一种d-乳酸脱氢酶、含有该酶的工程菌株及其构建和应用

一种d-乳酸脱氢酶、含有该酶的工程菌株及其构建和应用
【专利摘要】本发明提供了一种D?乳酸脱氢酶、含有该酶的工程菌株及其构建和应用。本发明公开了一个具有独特性质的来自热脱硫杆菌属(Thermodesulfatator indicus)的D?乳酸脱氢酶，其具有非常好的嗜热性及热稳定性。利用该D?乳酸脱氢酶和所述的基因工程改造的方法，使得改造后的地衣芽孢杆菌的发酵产物从天然的产2,3?丁二醇重定向为高产光学纯D?乳酸，所产的D?乳酸光学纯度达99.9％；发酵所用的原料价格较低，发酵状态介于厌氧和微氧之间。利用本发明的方法高温发酵生产D?乳酸，能够节约成本，提高生产效率，具有广阔的工业应用前景。CCTCC M 201602620160108
【专利说明】
一种D-乳酸脱氢酶、含有该酶的工程菌株及其构建和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种D-乳酸脱氢酶，一种含有该酶的芽孢杆 菌基因工程菌的构建以及在生产D-乳酸中的应用。
【背景技术】
[0002] 乳酸（lactic acid)是一种重要的工业原料，其可应用于医药、食品、化妆品和石 化工业等;近年来，乳酸作为单体还被用来合成高强度生物可降解塑料聚乳酸(polylactic acid，PLA)。传统来说，PLA是用高光学纯的L-乳酸聚合成的，而使用混合型L和D-乳酸，可以 明显提高以聚乳酸为材料产品的机械性能、热稳定性和抗水解性，由此极大激发了 D-乳酸 的市场需求。虽然乳酸能以石油为原料合成，但所合成的乳酸是两种同分异构体的混合物， 不适合用于PLA的生产。生产PLA所需的高光学纯L和D-乳酸只能通过微生物发酵而产生，许 多学者们也因此研究了利用微生物发酵法生产D-乳酸。
[0003] 高温发酵可以最小化污染的风险，提高原料转化速率，并且能够降低供热成本等 优点。到目前为止，高温生产光学纯L-乳酸已被广泛研究，这对于L-乳酸的商业化生产有着 巨大的贡献。至于D-乳酸，人们一直渴望实现其高温发酵生产，但少有关于嗜热生产D-乳酸 的报道，且报道的D-乳酸的浓度和生产速率及其丰富的培养基成分不适合工业化规模的生 产。因此，很有必要开发一种低成本的、强健的微生物平台来高温高产D-乳酸。
[0004] 烟酰胺腺噪呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)依赖的D-乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase)是微生物合成D-乳酸的关键酶。然而，大多数天然 存在的D-乳酸脱氢酶对热不稳定，这也是微生物高温生产D-乳酸的主要瓶颈之一。有报道 在体外测定植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中D-乳酸脱氢酶酶活表明，该酶在42 °(：具有很高的酶活，但在50°C中孵育3分钟后就会完全失活，而该菌体内的L-乳酸脱氢酶用 相同的方法处理后仍然保留94%的酶活。其他一些体内实验也表明D-乳酸脱氢酶在高温条 件下也容易失活。总之，上述报道菌株D-乳酸脱氢酶的低活性，或者说极差的热稳定性阻碍 了它们在高温条件下生产D-乳酸。为实现高温高效产D-乳酸，寻找一个热稳定性高的D-乳 酸脱氢酶是一个重要的任务。
[0005] 耐热地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580是一株兼性厌氧、革兰 氏阳性、内生孢子生成细菌。它具有许多作为微生物发酵平台的潜在优势：1)它能够利用 各种五碳糖和六碳糖;2)它具有较快的细胞生长速率，从而可以缩短发酵周期;3)它可以进 行遗传操作;4)它是食品和药物管理局公认的"大体上认为是安全的"菌株，这些优点表明 菌株ATCC 14580可作为一株理想的平台菌株。目前，该菌株已经被证实可用于2,3_ 丁二醇 的高温发酵生产。
[0006]因此，本领域的技术人员致力于以耐热地衣芽孢杆菌ATCC 14580为出发菌株，开 发一种D-乳酸高温高产工程菌株及其制备和应用。

【发明内容】

[0007] 针对现有技术中大多数天然存在的D-乳酸脱氢酶热稳定性差，现有的生产D-乳酸 的嗜热生产成本高、但D-乳酸浓度和生产速率不适合工业化规模生产的缺陷，本发明提供 一种D-乳酸高温高产工程菌株，及该菌株的的制备和应用。本发明公开了一个具有独特性 质的来自热脱硫杆菌属(Thermodesulfatator indicus)的D-乳酸脱氢酶，该酶具有非常好 的嗜热性及热稳定性。对该酶进行大肠杆菌密码子使用优化后，利用优化后的酶和基因工 程改造的方法，使得改造后的地衣芽孢杆菌的发酵产物从天然的产2,3_ 丁二醇重定向为高 产光学纯D-乳酸。
[0008] 具体地，本发明的一方面提供了一种D-乳酸脱氢酶，该D-乳酸脱氢酶具有下列氨 基酸序列之一：
[0009] 1)具有SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列；
[0010] 2)将SEQ ID No. 1的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或插入 产生的衍生蛋白质的氨基酸序列，该衍生蛋白质具有D-乳酸脱氢酶活性；
[0011] 3)包含与SEQ ID No. 1具有至少大约80%同源性的氨基酸序列。
[0012] 该蛋白来来源于热脱硫杆菌属(T. indicus)。上述蛋白可人工合成，也可先合成其 编码基因，再进行生物表达得到。
[0013] 本发明的还提供了编码上述D-乳酸脱氢酶的核酸分子，这些核酸分子可以是DNA， 如cDNA、基因组DNA或重组DNA;也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
[0014] 进一步地，本发明提供了一种编码上述D-乳酸脱氢酶的核苷酸序列，该核苷酸序 列具有下列核苷酸序列之一：
[0015] 1)具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
[0016] 2)具有SEQ ID No .3所示的核苷酸序列；
[0017] 3)与SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3具有80%以上的同源性的核苷酸序列。
[0018] 本发明的另一方面提供了上述D-乳酸脱氢酶或上述核苷酸序列在D-乳酸生产中 的应用。
[0019] 本发明的又一方面提供了一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株具 有如权利要求1所述的D-乳酸脱氢酶或如权利要求2所述的核苷酸序列编码的D-乳酸脱氢 酶。
[0020] 进一步地，上述基因工程菌株中L-乳酸脱氢酶基因的失活或缺失，乙酰乳酸合成 酶和/或乙酰乳酸脱羧酶基因的失活或缺失。
[0021] 进一步地，上述基因工程菌株还具有一个或多个基因的失活或缺失，所述一个或 多个基因选自：丙酮酸甲酸裂解酶基因、丙酮酸甲酸裂解酶活化酶基因、丙酮酸脱氢酶基 因、乙酸激酶和乙醇脱氢酶基因。
[0022] 进一步地，上述基因工程菌株的起始菌为芽孢杆菌。进一步地，该芽孢杆菌选自地 衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、液化淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆 菌和解硫胺素芽孢杆菌。优选地，起始菌为地衣芽胞杆菌。优选地，起始菌为地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis)ATCC 14580。优选地，起始菌为地衣芽抱杆菌ATCC 14580的 Δ hsdRl Δ hsdR2双突变菌株MW3。
[0023] 进一步地，上述D-乳酸脱氢酶基因的启动子为地衣芽孢杆菌ATCC 14580的α-乙酰 乳酸合成酶的启动子Pais、质粒pMMPc中的Ρ。启动子、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的Ρ43启 动子或地衣芽孢杆菌ATCC 14580的L-乳酸脱氢酶的启动子Pidh。优选地，上述启动子与ldhTi 基因的起始密码子"ATG"直接相连。
[0024] 进一步地，上述基因工程菌株是保藏号为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)BNll，保藏号为CCTCC N0:M2016026,于2016年1月8日保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
[0025] 本发明的再一方面提供了一种制备上述的基因工程菌株的方法，包括以下步骤：
[0026] 1)敲除起始菌株中的L-乳酸脱氢酶基因；
[0027] 2)引入上述编码D-乳酸脱氢酶的核苷酸序列；
[0028] 3)将乙酰乳酸合成酶和/或乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活或缺失；
[0029] 4)在进行步骤3)的同时或之后，在步骤2)中引入的所述核苷酸序列之前加上启动 子序列。
[0030] 具体地，以敲除了L-乳酸脱氢酶基因的地衣芽孢杆菌ATCC 14580的突变菌株MW3 作为宿主，并将乙酰乳酸脱羧酶(alsD)和乙酰乳酸合成酶(alsS)替换为上述D-乳酸脱氢 酶，获得能够利用葡萄糖在30°C~55°C温度下发酵产生D-乳酸的耐热工程芽孢菌株CCTCC N0：M2016026〇
[0031] 本发明的还有一方面提供了一种上述基因工程菌株的应用，尤其是在生产D-乳酸 中的应用。进一步地，所述菌株在使用葡萄糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖或其组合为碳源进 行D-乳酸生产中的应用。进一步地，使用含有花生柏、玉米浆干粉的廉价培养基进行发酵。 进一步地，在介于厌氧和微氧的环境下，pH为6.0~8.0,温度条件为45 °C~55 °C的条件下进 行发酵生产D-乳酸。进一步地，所述发酵工艺为连续发酵或补料流加工艺。
[0032 ]进一步地，首先对上述基因工程菌株进行种子培养获得种子培养液，然后以葡萄 糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖中的一种作为碳源，酵母粉、蛋白胨、花生柏、玉米浆干粉作为 氮源的发酵培养基进行发酵培养，得到D-乳酸。具体包括如下步骤：
[0033] 1)斜面培养:将工程芽胞杆菌菌种接种于含有20g/L琼脂的固体斜面培养基上，45 ~55°C条件下，培养24~48h;
[0034] 2)种子培养:将经过斜面培养的工程芽胞杆菌在无菌条件下接种到种子培养基 中，45~55 °C条件下，静止培养24~36h，加入中和剂控制发酵液pH，制得种子培养液；
[0035] 3)发酵培养:按5~20 %体积比的接种量接入到发酵培养基中，在45°C~55°C环境 下培养48~90h，温度优选50 °C。
[0036]优选地，步骤2)所述的种子培养基每升中含有：葡萄糖60~120g或木糖40~70g， 酵母粉8~12g，蛋白胨3~8g，碳酸f丐50g，余量为水，优选含有:葡萄糖90g，酵母粉10g，蛋白 胨5g，碳酸钙50g，余量为水;该种子培养基的pH为6.0。115°(：灭菌15min。中和剂包括NaOH、 NH4OH和Ca(0H)2中的一种或几种。
[0037]优选地，步骤3)中所述的发酵培养基的组分及其含量为:碳源40~180g/L、氮源添 加量5~20g/L。优选地，步骤3)中所述的发酵工艺为补料流加工艺，该补料流加工艺是指： 当发酵液中总还原糖含量低于20g/L时补加碳源，使总还原糖含量维持在30~70g/L，或达 到50~70g/L。优选地，所述的发酵培养基的pH为6.0~8.0。
[0038]本发明提供的改造的基因工程菌株，可以利用低成本的原料和较高的发酵温度发 酵生产高浓度、高光学纯度的D-乳酸，在节约成本的同时提高生产效率，降低生产成本，适 合于工业生产中推广应用。其中D-乳酸产量最高可达226g/L，光学纯度为99.9 %，糖酸转化 率最高可达93.6%，发酵生产能力3.28/α·?!]。因此，利用本发明方法生产D-乳酸，能节约 成本、简化操作流程，具有广阔的工业应用前景。
[0039] 以下将结合附图对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以 充分地了解本发明的目的、特征和效果。
【附图说明】
[0040] 图1是本发明的一个【具体实施方式】的耐热地衣芽孢杆菌的构建及产D-乳酸途径示 意图。
[0041] 图2是SDS-PAGE检测纯化D-乳酸脱氢酶蛋白的分子量大小。其中，泳道Μ为蛋白分 子量标准;泳道1为含有pETDuet-Ι空载体的大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)诱导后获得的粗酶 液;泳道2为含有原核表达载体pETDuet-ldhn的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)诱导后获得的 粗酶液;泳道3为纯化后D-乳酸脱氢酶。
[0042] 图3是D-乳酸脱氢酶的最适反应pH值测定结果。
[0043] 图4是D-乳酸脱氢酶的最适反应温度测定结果。
[0044] 图 5 是各种质粒的构建:A · pKVM Δ 1 dh; B · pKVMN 1; C · pKVMN2; D · pKVMN4; E · pKVMN6; F.pKVMAl〇
[0045] 图6是菌株BN11产D-乳酸的HPLC光学纯度分析。
[0046] 图7是菌株BN11利用不同葡萄糖糖浓度发酵生产D-乳酸的情况:A.不同浓度糖的 消耗情况;B.不同浓度的糖产D-乳酸的情况。初始糖浓度：?，60.0 g/L; ，87 . Og/L; ·， 122·0g/L; ▲，148·0g/L; ▼，180·0g/L; ?，202·0g/L。
[0047] 图8是菌株BN11进行分批发酵和补料(葡萄糖)流加发酵生产D-乳酸的情况。A.分 批发酵结果;B.补料(葡萄糖)流加发酵结果。·，细胞密度；?，葡萄糖；▲，0-乳酸；?，甲 酸;▼，乙酸;★，乙醇。
[0048]图9是菌株BA11进行分批发酵和补料(葡萄糖)流加发酵生产D-乳酸的情况。A.分 批发酵结果;B.补料(葡萄糖)流加发酵结果。·，细胞密度；?，葡萄糖；▲，0-乳酸；?，甲 酸;▼，乙酸;★，乙醇。
[0049] 图10是菌株BN11利用木糖进行补料流加发酵生产D-乳酸的情况。，细胞密度； ?，木糖;▲，0-乳酸;?，甲酸;▼，乙酸;★，乙醇。
[0050] 图11是菌株BN11进行利用廉价培养基进行补料(葡萄糖)流加发酵生产D-乳酸的 情况。，细胞密度;?，葡萄糖;▲，〇-乳酸;?，甲酸;▼，乙酸;★，乙醇。
【具体实施方式】
[0051] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所 用的材料、试剂、菌株等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0052]试剂和菌株：本发明中的所有试剂均是市场购买的试剂级以上的试剂。其中 FastPfu DNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司。所有的限制性内切酶和T4 DNA连 接酶购自NEB(New England Biolabs)。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)、二硫苏糖醇 (DTT)、苯甲基磺酰氟(PMSF)购自德国默克公司。L-乳酸和D-乳酸标品购自西格玛奥德里 奇。PMD18-T和所有的引物合成于大连宝生物公司。地衣芽孢杆菌ATCC 14580可以从ATCC网 站直接购买获得，地衣芽孢杆菌ATCC 14580的双突变菌株MW3( AhsdRl，AhsdR2)可以根据 文献：Generation of readily transformable Bacillus licheniformis mutants (Bianca Waschkaw et al.，Appl Microbiol Biotechnol ,(2008)78:181-188)中的方法构 建获得，双突变菌株MW3作为DNA操作时使用的宿主菌。大肠杆菌E.coli DH5a和BL21(DE3) 分别用作克隆宿主菌和表达宿主菌。大肠杆菌E.coli S17-1用作接合转移的供体菌。 pETDuet-Ι用作表达载体。穿梭质粒pKVMl带有氨苄青霉素和红霉素抗性，用于地衣芽孢杆 菌MW3的基因敲除。Luria-Bertani(LB)培养基用作培养大肠杆菌和芽孢杆菌。氨苄青霉素 (100g/mL)，红霉素（5g/mL)，多粘菌素 B(40g/mL)用于大肠杆菌和芽孢杆菌的筛选。X-Gal (40g/mL)用于蓝白斑筛选。
[0053]用于菌株产D-乳酸的HPLC分析使用的是手性柱:MCI GEL CRS10W。
[0054] 下方【具体实施方式】中的D-乳酸工程菌株的构建的构建及产D-乳酸途径如图1所 不。
[0055] 实施例1:D_乳酸脱氢酶基因及其蛋白的获得
[0056] 1. D-乳酸脱氢酶LdhTi基因的获得
[0057] 在NCBI中以超嗜热菌Aquifex aeolicus VF5中的D-乳酸脱氢酶NP_213499为模 板，经过比对得到一个与NP_213499相似度为38%的可能是0-乳酸脱氢酶的蛋白即_ 013906894,其序列如SEQ ID No. 1所示。进一步查找发现该蛋白存在于热脱硫杆菌 (Thermodesulfatator indicus)DSM 15286中，其对应的核苷酸序列为一个完整的开放阅 读框，如SEQIDN0.2所示，长度为978bp，编码如SEQIDN 0.l所示的氨基酸残基组成的蛋 白质，该蛋白命名为LdhTi。依照大肠杆菌E. coli K12的密码子使用优化后，用PCR合成方法， 采用如表1所示的引物，引物之间互为模版，从而合成密码子优化的核苷酸序列，其序列如 SEQIDNo.3所示。将得到的如SEQIDNo.3所示的基因插入pMD18-T载体中，获得pMD18-T-ldhTi质粒，并进行核苷酸序列测定。本领域技术人员可知，SEQ ID No.3所示的基因，也可以 直接通过基因合成的方式直接合成。
[0058] 表1用于PCR合成D-乳酸脱氢酶LdhTi的引物序列
[0059]
[0060]
[0061]下划线代表酶切位点。
[0062] 2.重组原核表达载体的构建
[0063] 将上述获得的pMD18-T-ldhTi质粒用如表1所示的引物1和40进行PCR扩增，获得的 目的基因片段用BamHI和Hindlll双酶切后，连接到经相同的酶双酶切处理的表达载体 pETDuet-1 (Novagen公司）中，将含有LdhTi基因的连接产物转化大肠杆菌转化大肠杆菌 E. coli BL21 (DE3) (Novagen公司），经PCR和DNA测序鉴定后将含有正确LdhTi基因的阳性克 隆中的质粒命名为pETDuet-ldh Ti，可用其进行D-乳酸脱氢酶的表达。
[0064] 3.D-乳酸脱氢酶的原核表达及纯化 [0065] 1 )D_乳酸脱氢酶LdhTi的原核表达
[0066] 将上述获得的含有原核表达载体pETDuet-ldhTi的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)在 37 °C下摇菌至OD6(X)nmS〇. 6~0.8后，加入终浓度为ImM的IPTG诱导，16 °C下摇床培养16h或30 °C下摇床培养8h后离心收集菌体，重悬于50mM磷酸盐缓冲液(PBS;pH 7.4)中，超声破碎细 胞，收集上清，进行SDS-PAGE电泳分析。
[0067]结果如图2所示，从图中可以看出携带目的基因的原核表达载体pETDuet-1 dhTi在 大肠杆菌E.coli BL21 (DE3)中获得大量表达，表达的重组蛋白的单亚基分子量约为37kDa， 与预期结果相符。
[0068] 2)D_乳酸脱氢酶LdhTi的纯化
[0069] 通过His-tag标签对步骤1)表达的蛋白进行纯化。具体如下：
[0070]将步骤1)获得的经过SDS-PAGE检测的原核表达产物进行亲和层析纯化，即将超声 后的上清过填充有Ni-NTA凝胶的层析柱，含有His-tag标签的蛋白将结合到Ni-NTA凝胶上， 然后用清洗缓冲液(25mM Tris盐酸缓冲液，500mM NaCl，50mM咪唑，以上浓度均为在溶液中 的终浓度，pH 8.0)洗涤非特异性结合的杂蛋白，最后用洗脱缓冲液(25mM Tris盐酸缓冲 液，500mM NaCl，220mM咪唑，以上浓度均为在溶液中的终浓度，pH 8.0)将目的蛋白洗脱，即 得到纯化后的目的蛋白。然后使用分子筛凝胶柱更换缓冲液为50mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0)，获得最终纯化后目的蛋白D-乳酸脱氢酶LdhTl。
[0071 ] 对最终纯化后目的蛋白D-乳酸脱氢酶Ldhn进行SDS-PAGE电泳，结果如图2泳道3所 示，目的条带单一，大小约为37kDa，表明所得目的蛋白较纯。
[0072]实施例2:实施例1所得目的蛋白D-乳酸脱氢酶LdhTl的酶学特性鉴定 [0073]用下列底物来鉴定实施例1所得目的蛋白的酶学特性:丙酮酸、D-乳酸，L-乳酸、甘 油酸、苯丙酮酸、乙醛酸和草酰乙酸。反应体系：50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、0.2mM的NADH 或NAD+为辅酶、适量的D-乳酸脱氢酶LdhTl以及不同浓度的底物，于37°C反应。酶活的测定方 法是在340nm紫外波长下测定NADH的氧化或NAD+的还原，一个单位酶活定义为每分钟氧化 或还原lymoL的NADH或NAD+所需的酶量。
[0074]结果表明：实施例1所得目的蛋白既可以催化丙酮酸、乙醛酸、草酰乙酸、D-乳酸和 苯丙酮酸，而对L-乳酸和甘油酸没有活性(表2)。尤其，D-乳酸脱氢酶LdhTi对丙酮酸具有最 高的催化效率，且可以专一性的催化D-乳酸。因此，上述结果表明实施例1所得目的蛋白确 实为D-乳酸脱氢酶LdhTi。
[0075] 表2 D-乳酸脱氢酶LdhTi催化的底物谱范围。
[0076]
[0077]-:表明酶对该底物没有活性。
[0078] 其中，实施例1获得的D-乳酸脱氢酶LdhTi的最适反应pH值和最适反应温度是通过 如下两个试验确定的：
[0079] 1 )D_乳酸脱氢酶LdhTi的最适反应pH值确定
[0080]酶活的测定方法是在340nm紫外波长下测定NADH的变化，一个单位酶活定义为每 分钟氧化lymoL的NADH所需的酶量。在37°C条件下，以20mM的丙酮酸为底物，以0.2mM的NADH 为辅酶，测定了所述D-乳酸脱氢酶从pH 3.0到11.0的范围内，酶活性的变化情况。缓冲体 系：pH 3.0到7.0的50mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液;pH 7.0到9.0的50mM磷酸盐缓冲液;pH 9.0到11.0的50mM碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液。实验重复三次。结果如图3所示，该酶的最适反 应pH值为6.0。图3中酶相对活力是测定不同pH值条件下酶的活力，依据在pH 6.0的最高值 为100%，其他pH时的酶活力数值相应折算得到酶相对活力。
[0081 ] 2)D-乳酸脱氢酶LdhTi的最适反应温度确定
[0082]酶活的测定方法是在340nm紫外波长下测定NADH的变化，一个单位酶活定义为每 分钟氧化lymoL的NADH所需的酶量。D-乳酸脱氢酶最适反应温度的测定条件如下:20mM的丙 酮酸为底物，〇. 2mM的NADH为辅酶，50mM的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)体系；分别测定了从30°C 到100 °C的酶活力，实验重复三次。结果如图4所示，该酶的最适反应温度是70 °C。图4中酶相 对活力是测定不同温度条件下酶的活力，依据在70°C的最高值为100%，其他温度时的酶活 力数值相应折算得到酶相对活力。
[0083]实施例3:耐热地衣芽孢杆菌菌株的制备 [0084] 1.构建本发明中的各种敲除质粒
[0085] 1)L-乳酸脱氢酶基因敲除质粒的构建：以ATCC 14580基因组DNA为模板，用引物 对1 dh-up-F/1 dh-up-R和1 dh-Dn-F/1 dh-Dn-R分别PCR扩增L-乳酸脱氢酶基因的上下游同源 臂，然后用BamHI/XhoI和Xhol/Ncol分别双酶切上下游同源臂，同时用BamHI/NcoI双酶切质 粒pKVMl，上述酶切后的载体和片段用T4 DNA连接酶连接后，转化大肠杆菌E.coli S 17-1， 经DNA测序验证正确后，将阳性克隆质粒命名为pKVM Δ 1 dh，质粒构建如图5A所示。其中， pKVMl 质粒可以通过文南犬Size unlimited markerless deletions by a transconjugative plasmid-system in Bacillus licheniformis(Rachinger,M.et al., Journal of biotechnology ,2013,167(4) ,365-369)构建而成。
[0086] 2)2,3-丁二醇代谢途径乙酰乳酸合成酶(alsS)和乙酰乳酸脱羧酶(alsD)基因敲 除质粒的构建：
[0087] 其中，使用到的引物序列如表3所示。
[0088] (1)以ATCC 14580基因组DNA为模板，用引物对Alsl-up-F/Alsl-up-I^PAls-Dn-F/ Alsl-Dn-R分别PCR扩增上下游同源臂，同时用引物对Als-ldh-F/Als-ldh-R PCR扩增D-乳 酸脱氢酶LdhTi基因，然后用引物Alsl-up-F和Alsl-Dn-R以重组PCR的方法将以上三段基因 进行融合。将上述重组PCR产物和pKVMl分别用酶BamHI/NcoI进行双酶切，将T4 DNA连接酶 连接后的产物转化大肠杆菌E.coli S17-1，经DNA测序验证正确后，将阳性克隆质粒命名为 pKVMNl (图5B)。此质粒上游同源臂末端完整保留了 alsS的启动子区域(Pais)，且与ldhTi的起 始密码子"ATG"直接相连。其中，ATCC 14580的基因组序列可从NCBI上获得。其中，Pais的序 列如SEQ ID No.69所示。
[0089] (2)用P。启动子起始ldhTi表达的敲除质粒构建：以质粒pMMPc为模板，用引物Als2-Pc-F和Als2-Pc-R进行PCR扩增，获得P c启动子的基因。其中，pMMPc质粒可以根据文献New constitutive vectors:useful genetic engineering tools for biocatalysis(Xu,Y., Tao,F.,Ma,C.,&Xu,P.,Applied and environmental microbiology,2013,79(8),2836-2840)中的方法，从质粒pMMB66EH构建而成；以ATCC 14580基因组DNA为模板，用引物对 A1 s2-up-F/Als2-up-R和A1 s-Dn-F/Als2-Dn-R分别PCR扩增上下游同源臂，同时用引物对 Als2-ldh-F/Als-ldh-R PCR扩增D-乳酸脱氢酶LdhTi基因，然后用引物Als2-up-F和Als2-Dn-R以重组PCR的方法将以上四段基因进行融合。将上述重组PCR产物和pKVMl分别用酶 BamHI/Xmal进行双酶切，将T4 DNA连接酶连接后的产物转化大肠杆菌E. coli S17-1，经DNA 测序验证正确后，将阳性克隆质粒命名为PKVMN2 (图5C)。其中，Pc的序列如SEQ ID No. 70所 不。
[0090] (3)用P43启动子起始ldhTi表达的敲除质粒构建：以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)基 因组DNA为模板，用引物A1S4-P43-F和A1S4-P43-R进行PCR扩增，获得P43启动子的基因，其 中，P43启动子的信息，可以从文献Isobutanol production at elevated temperatures in thermophilic Geobacillus thermoglucosidasius(Lin,P.P.,Rabe,K.S.,Takasumi, J.L. ,Kadisch,M. ,Arnold,F.H. ,&Lia〇,J-C. ,Metabolic engineering,2014,24,1-8)中获 知；以ATCC 14580基因组DNA为模板，用引物对A1 s2-up-F/Al s4-up-R和A1 s-Dn-F/Al s2-Dn-R分别PCR扩增上下游同源臂，同时用引物对Als2-ldh-F/Als-ldh-R PCR扩增D-乳酸脱氢酶 LdhTl基因，然后用引物Als2-up-F和Als2-Dn-R以重组PCR的方法将以上四段基因进行融合。 将上述重组PCR产物和pKVMl分别用酶BamHI/Xmal进行双酶切，将T4 DNA连接酶连接后的产 物转化大肠杆菌E.coli S17-1，经DNA测序验证正确后，将阳性克隆质粒命名为pKVMN4(图 ro)。其中，P43的序列如SEQIDNo.71所示。
[0091] (4)用Pidh启动子起始ldhTi表达的敲除质粒构建:Pidh为地衣芽孢杆菌ATCC14580L-乳酸脱氢酶的启动子。以ATCC 14580基因组DNA为模板，用引物Als6-Pldh-F和Als6-Pldh-R 进行PCR扩增，获得Pidh启动子的基因；用引物对A1 s2-up-F/Als6-up-R和A1 s-Dn-F/Als2-Dn-R分别PCR扩增上下游同源臂，同时用引物对Als2-ldh-F/Als-ldh-R PCR扩增D-乳酸脱 氢酶LdhTl基因，然后用引物Als2-up-F和Als2-Dn-R以重组PCR的方法将以上四段基因进行 融合。将上述重组PCR产物和pKVMl分别用酶BamHI/Xmal进行双酶切，将T4 DNA连接酶连接 后的产物转化大肠杆菌E.coli S17-1，经DNA测序验证正确后，将阳性克隆质粒命名为 pKVMN6(图5E)。其中，Pldh的序列如SEQIDNo.72所示。
[0092] (5)替换ldhTi为适中温D-乳酸脱氢酶的敲除质粒构建：以ATCC 14580基因组DNA为 模板，用引物对A1 s 1-up-F/Al sA-up-R和A1 s-Dn-F/Al s Ι-Dn-R分别PCR扩增上下游同源臂； 以大肠杆菌E. co 1 i K12基因组DNA为模板，用引物A1 sA-1 dhA-F/AlsA-ldhA-R PCR扩增D-乳 酸脱氢酶LdhA基因，然后用引物A1 s 1 -up-F和A1 s 1 -Dn-R以重组PCR的方法将以上三段基因 进行融合。将上述重组PCR产物和pKVMl分别用酶BamHI/NcoI进行双酶切，将T4 DNA连接酶 连接后的产物转化大肠杆菌E.coli S17-1，经DNA测序验证正确后，将阳性克隆质粒命名为 pKVMAl (图 5F)。
[0093]表3载体构建用到的引物
[0094]
[0096] 注："-F"代表正向引物；"-R"代表反向引物;下划线表示酶切位点。
[0097] 2.将构建的载体用于改造耐热地衣芽孢杆菌
[0098] 1)耐热地衣芽孢杆菌基因敲除步骤：
[0099] (1)将含有敲除质粒的大肠杆菌E.coli S17-1和地衣芽孢杆菌MW3在LB培养基中 分别培养至1.2，6000rpm离心5min，用0.9 %生理盐水洗两遍，将两个菌混合后重悬 并离心，然后用LB培养基重悬并滴在LB平板上，在30°C过夜培养，用预热(30°C )的LB收集细 胞后，涂布于LB固体平板(红霉素和多粘菌素 B)，30°C培养；
[0100] (2)挑转化子至LB培养基(红霉素），30°C培养，然后系列稀释至LB平板(红霉素和 X-Gal)，42°C过夜培养，蓝色菌落为正确的转化子；
[0101] (3)挑转化子至LB培养基，30°C无抗性培养并转接两代，稀释涂平板至LB平板(X-Gal)，挑白色转化子，并进行分子验证。
[0102] 2)耐热地衣芽孢杆菌敲除菌株的制备过程
[0103] 遗传操作选用的宿主菌为敲除了限制性修饰系统（AhsdRl，AhsdR2)的突变株 MW3,该突变菌株可以更高效的进行外源DNA的转化，同时其生长和分泌蛋白的能力与野生 型ATCC 14580相同，不受敲除的影响。耐热地衣芽孢杆菌MW3敲除菌株的制备：
[0104] (1)敲除了 L-乳酸脱氢酶(Ldh)基因的宿主菌株BL2的制备:利用上述遗传操作方 法将菌株MW3和含有敲除质粒pKVM Δ ldh的大肠杆菌E. coli S17-1进行双亲结合，然后分别 通过单交换和双交换得到转化子，再提取基因组，通过PCR鉴定，挑取阳性菌株，并进行下一 步实验。
[0105] (2)敲除了L-乳酸脱氢酶(Ldh)基因和2，3_丁二醇途径乙酰乳酸合成酶(alsS)及 乙酰乳酸脱羧酶(alsD)基因，并保留启动子P als的宿主菌株BN11的制备:利用上述遗传操作 方法将菌株BL2和含有敲除质粒pKVMNl的大肠杆菌E.coli S17-1进行双亲结合，然后分别 通过单交换和双交换得到转化子，再提取基因组，通过PCR鉴定，挑取阳性菌株，并进行下一 步实验。
[0106] (3)敲除了L-乳酸脱氢酶(Ldh)基因和2，3_丁二醇途径乙酰乳酸合成酶(alsS)及 乙酰乳酸脱羧酶(alsD)基因，并替换?士为P c启动子的宿主菌株BN22的制备:利用上述遗传 操作方法将菌株BL2和含有敲除质粒pKVMN2的大肠杆菌E.coli S17-1进行双亲结合，然后 分别通过单交换和双交换得到转化子，再提取基因组，通过PCR鉴定，挑取阳性菌株，并进行 下一步实验。
[0107] (4)敲除了L-乳酸脱氢酶(Ldh)基因和2，3_丁二醇途径乙酰乳酸合成酶(alsS)及 乙酰乳酸脱羧酶(al sD)基因，并替换?士为P43启动子的宿主菌株BN44的制备:利用上述遗传 操作方法将菌株BL2和含有敲除质粒pKVMN4的大肠杆菌E.coli S17-1进行双亲结合，然后 分别通过单交换和双交换得到转化子，再提取基因组，通过PCR鉴定，挑取阳性菌株，并进行 下一步实验。
[0108] (5)敲除了L-乳酸脱氢酶(Ldh)基因和2，3_丁二醇途径乙酰乳酸合成酶(alsS)及 乙酰乳酸脱羧酶(alsD)基因，并替换?士为Pidh启动子的宿主菌株BN66的制备:利用上述遗 传操作方法将菌株BL2和含有敲除质粒pKVMN6的大肠杆菌E.coli S17-1进行双亲结合，然 后分别通过单交换和双交换得到转化子，再提取基因组，通过PCR鉴定，挑取阳性菌株，并进 行下一步实验。
[0109] (6)替换BN11中嗜热D-乳酸脱氢酶LdhTi为适中温型的D-乳酸脱氢酶LdhA宿主菌株 BA11的制备:利用上述遗传操作方法将菌株BN11和含有敲除质粒pKVMAl的大肠杆菌E. col i S17-1进行双亲结合，然后分别通过单交换和双交换得到转化子，再提取基因组，通过PCR鉴 定，挑取阳性菌株，并进行下一步实验。
[0110] 实施例4:原始菌株、ldh敲除菌株以及含有不同启动子和ldhTl基因的菌株的发酵 情况
[0111] 本实施例在5L全自动发酵罐中进行，所使用的各培养基的组成如下：
[0112]斜面培养基每升中含有：葡萄糖30~50g，酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，碳酸|丐 30g，琼脂粉15~25g，余量为水。所述斜面培养基的pH为7.0。115°(：灭菌15min。
[0113]种子培养基每升中含有：葡萄糖40~120g，酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，碳酸|丐 50g，余量为水。所述种子培养基的pH为6.0~8.0。115°(：灭菌1511^11。
[0114]发酵培养基每升中含有:葡萄糖120g，酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，余量为水;所 述发酵培养基的pH为6.5~7.5。115 °C条件下灭菌15m i η。
[0115]本实施例所述发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
[0116] (1)斜面培养:将菌株接种于斜面培养基上，50°C培养24h;
[0117] (2)种子培养:将步骤（1)培养的菌株在无菌条件下用接种环接2环于装有40mL种 子培养基的40mL三角瓶中，50°C静止培养24h，制得种子培养液1;将10mL种子培养液1在无 菌条件下接入装有l〇〇mL种子培养基的500mL三角瓶中，50°C静止培养24h，制得种子培养液 2；
[0118] (3)发酵培养:将300mL步骤(2)制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有2.7L发 酵培养基的发酵罐中，50 °C、70rpm搅拌培养，每3h取样一次，12h后结束发酵。
[0119] 发酵结束后，取发酵液上清通过HPLC检测分析D-乳酸、副产物和总还原糖的浓度， 计算糖酸转化率（表4)。其中，转化率（％ )=乳酸的产量（g/L)/葡萄糖消耗量（g/L) X 100%。其中，通过检测D-乳酸和L-乳酸的HPLC检测，可以获知，BN11产的D-乳酸的光学纯度 可达到99.9%(图6)。
[0120] 表4不同菌株的葡萄糖消耗和产物生成情况。
[0121]
[0122] -:表明产物的量小于0.018/1·
[0123] 实施例5:实施例4中最优菌株的发酵条件的优化
[0124] 本实施例在5L全自动发酵罐中进行，所选用菌株为BN11，所使用的各培养基的组 成如下：
[0125] 斜面培养基和种子培养基同实施例4。
[0126] 发酵培养基每升中含有：1)确定最适发酵pH时，培养基组成为:葡萄糖90g，酵母粉 5~10g，蛋白胨2~8g，余量为水，pH分别调至6.0、6.5、7.0、7.5和8.0;2)为确定菌株在不同 葡萄糖浓度的培养基中生产D-乳酸的能力，培养基组成为:酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，葡 萄糖的量为6(^、87 8、1228、1488、18(^和2028，余量为水。
[0127] 本实施例所述发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
[0128] (1)斜面培养:同实施例4;
[0129] (2)种子培养:同实施例4;
[0130] (3)发酵培养:将300mL步骤(2)制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有2.7L不 同条件的发酵培养基的发酵罐中，50 °C、70rpm搅拌培养，每3h取样一次，12h后结束发酵。
[0131] 发酵结束后，取发酵液上清通过HPLC检测分析D-乳酸、副产物和总还原糖的浓度， 计算糖酸转化率。
[0132] 实验结果表明，实验菌株BN11在50°C条件下，最适发酵pH是7.0，在该pH值下，消耗 葡萄糖速率最快，糖酸转化率最高，同时副产物也最少(表5)。从图7可知，当葡萄糖浓度不 超过180g/L时，菌株BN11消耗葡萄糖和生产D-乳酸的速率没有明显的被抑制；当葡萄糖浓 度高于此值，如202g/L时，葡萄糖的消耗明显受到抑制，D-乳酸的生产速率也随之降低。
[0133] 表5 pH对菌株BN11产D-乳酸的影响。
[0134]
[0135] -:表明产物的量小于0.018/1·
[0136] 实施例6:利用实施例4中最优菌株进行分批发酵和补料(糖)流加发酵生产D-乳酸
[0137] 本实施例在5L全自动发酵罐中进行，所选用菌株为BN11，所使用的各培养基的组 成如下：
[0138] 斜面培养基和种子培养基同实施例4。
[0139] 发酵培养基每升中含有：1)分批发酵生产D-乳酸时，培养基组成为：葡萄糖180g， 酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，余量为水;2)补料(糖)流加发酵生产D-乳酸，培养基组成为： 葡萄糖40~70g，酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，余量为水。
[0140] 本实施例所述发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
[0141] (1)斜面培养:同实施例4;
[0142] (2)种子培养:同实施例4;
[0143] (3)发酵培养:将300mL步骤(2)制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有2.7L分 别含有分批发酵和补料(糖)流加发酵培养基的发酵罐中，50 °C、70rpm搅拌培养，每2~5个 小时取样一次，测定发酵液中的残糖量。分批发酵时，当发酵过程中葡萄糖消耗完或消耗速 率趋于〇时，结束发酵;补料(糖)流加发酵时，当葡萄糖浓度降到10~20g/L时，流加葡萄糖， 使葡萄糖浓度达到50~70g/L，共计补糖2~5次。当发酵过程中葡萄糖消耗速率趋于0时，结 束发酵。
[0144] 发酵结束后，取发酵液上清通过HPLC检测分析D-乳酸、副产物和总还原糖的浓度， 计算糖酸转化率及生产速率。
[0145] 从图8A可知，实验菌株BN11在50°C条件下进行分批发酵时，40h后葡萄糖消耗完 毕，发酵结束。生产出的D-乳酸浓度为167.7g/L，副产物乙醇浓度为5.8g/L，甲酸浓度为 1. lg/L，乙酸浓度为3.6g/L。糖酸转化率和生产速率分别为93.0%和4.2g/[L · h]。
[0146] 从图8B可知，菌株BN11在50°C条件下进行补料(糖)流加发酵时，共流加葡萄糖补 料4次，70h后结束发酵。其中前38h生产了 173.2g/L D-乳酸，生产速率为4.6g/[L · h];从 38h到70h，D-乳酸浓度从173.2g/L增加到226.6g/L，生产速率为1.7g/ [ L · h ]。发酵完毕后， 共消耗葡萄糖242. lg/L，平均生产速率为3.2g/[L · h]，糖酸转化率为93.6%。副产物甲酸 最终的浓度为0.56g/L，乙酸和乙醇的终浓度分别为5.5g/L和4.3g/L。
[0147] 实施例7:替换嗜热LdhTi为适中温D-乳酸脱氢酶(LdhA)的菌株进行分批发酵和补 料(糖)流加发酵生产D-乳酸
[0148] 本实施例在5L全自动发酵罐中进行，所选用菌株为BA11，所使用的各培养基的组 成如下：
[0149] 斜面培养基和种子培养基同实施例4。
[0150] 发酵培养基每升中含有:同实施例6。
[0151 ]本实施例所述发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
[0152] (1)斜面培养:同实施例4;
[0153] (2)种子培养:同实施例4;
[0154] (3)发酵培养:同实施例6。
[0155] 发酵结束后，取发酵液上清通过HPLC检测分析D-乳酸、副产物和总还原糖的浓度， 计算糖酸转化率及生产速率。
[0156] 从图9A可知，实验菌株BA11在50°C条件下进行分批发酵时，40h后结束发酵，剩余 的残糖为57 . lg/L。最终生产出的D-乳酸浓度为100.8g/L，副产物乙醇浓度为9.5g/L，甲酸 浓度为3.98/1，乙酸浓度为4.58/1。糖酸转化率和生产速率分别为82.4%和2.5 8/[1^11]。
[0157] 从图9B可知，菌株BA11在50°C条件下进行补料(糖)流加发酵时，共流加葡萄糖补 料3次，70h后结束发酵。最终共消耗葡萄糖196.9g/L，生产D-乳酸168.6g/L，平均生产速率 为2.4g/[L· h]，糖酸转化率为85.6%。副产物甲酸和乙醇最终的浓度为1.(^凡，乙酸的终 浓度为5.5g/L。
[0158] 实施例8:实施例4中最优菌株利用木糖进行补料流加发酵生产D-乳酸
[0159]本实施例在5L全自动发酵罐中进行，所选用菌株为BN11，所使用的各培养基的组 成如下：
[0160]斜面培养基每升中含有:木糖30~50g，酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，碳酸f丐30g， 琼脂粉15~25g，余量为水。所述斜面培养基的pH为7.0。115°(：灭菌15min。
[0161 ]种子培养基每升中含有:木糖40~70g，酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，碳酸f丐50g， 余量为水。所述种子培养基的pH为6.0~8.0。115°(：灭菌15min。
[0162] 发酵培养基每升中含有:木糖40~60g，酵母粉5~10g，蛋白胨2~8g，余量为水;所 述发酵培养基的pH为6.5~7.5。115 °C条件下灭菌15m i η。
[0163] 本实施例所述发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
[0164] (1)斜面培养:同实施例4;
[0165] (2)种子培养:同实施例4;
[0166] (3)发酵培养:将300mL步骤(2)制得的种子培养液在无菌条件下接入装有2.7L发 酵培养中，50 °C、70rpm搅拌培养，每2~5个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量。当木糖 浓度降到10~20g/L时，流加木糖，使木糖达到40~60g/L，共计补糖2~5次。当发酵过程中 木糖消耗速率趋于〇时，结束发酵。
[0167] 发酵结束后，取发酵液上清通过HPLC检测分析D-乳酸、副产物和总还原糖的浓度， 计算糖酸转化率及生产速率。
[0168] 从图10可知，菌株BN11以木糖为碳源，在50 °C条件下进行补料流加发酵时，共流加 木糖补料1次，70h后结束发酵。最终共消耗木糖114.7g/L，生产D-乳酸72. lg/L，平均生产速 率约为1. 〇g/[L · h]。副产物甲酸终浓度为23. Og/L，乙酸和乙醇的终浓度分别为7.2g/L和 8g/L〇
[0169] 实施例9:实施例4中最优菌株利用廉价培养基进行补料(糖)流加发酵生产D-乳酸 [0170]本实施例在5L全自动发酵罐中进行，所选用菌株为BN11，所使用的各培养基的组 成如下：
[0171] 斜面培养基和种子培养基同实施例4。
[0172] 发酵培养基每升中含有：葡萄糖40~70g，酵母粉1~5g，磷酸二氢钾0.25~l.Og/ L，磷酸氢二钾0.25~1. Og/L，硫酸铵1.5~10.0 g/L，磷酸氢二铵1.2~5. Og/L，硫酸锌0.15 ~0.8g/L，玉米浆干粉1~10g/L，余量为水。115 °C条件下灭菌15min。
[0173] 本实施例所述发酵生产D-乳酸的方法包括以下步骤：
[0174] (1)斜面培养:同实施例4;
[0175] (2)种子培养:同实施例4;
[0176] (3)发酵培养:将600mL步骤(2)制得的种子培养液2在无菌条件下接入装有2.4L廉 价发酵培养基中，50 °C、70rpm搅拌培养，每2~5个小时取样一次，测定发酵液中的残糖量。 当葡萄糖浓度降到10~20g/L时，流加葡萄糖，使葡萄糖浓度达到50~70g/L，共计补糖2~5 次。当发酵过程中葡萄糖消耗速率趋于〇时，结束发酵。
[0177] 发酵结束后，取发酵液上清通过HPLC检测分析D-乳酸、副产物和总还原糖的浓度， 计算糖酸转化率及生产速率。
[0178]从图11可知，菌株BN11利用廉价培养基在50°C条件下进行补料(糖)流加发酵时， 共流加葡萄糖补料4次，90h后结束发酵。最终共消耗葡萄糖190.9g/L，生产D-乳酸175.7g/ L，平均生产速率为2.0g/[L · h]，糖酸转化率为92.0%。副产物乙酸终浓度为7.5g/L，甲酸 和乙醇的终浓度分别为0.62g/L和1.6g/L。
[0179]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无 需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术 人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的 技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种D-乳酸脱氢酶，其特征在于，所述D-乳酸脱氢酶具有下列氨基酸序列之一： 1) 具有SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列； 2) 将SEQ ID No. 1的氨基酸序列通过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或插入产生 的衍生蛋白质的氨基酸序列，所述衍生蛋白质具有D-乳酸脱氢酶活性； 3) 包含与SEQ ID No. 1具有至少大约80%同源性的氨基酸序列。2. -种编码如权利要求1所述的D-乳酸脱氢酶的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸 序列具有下列核苷酸序列之一： 1) 具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列； 2) 具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列； 3) 与SEQ ID No.2或SEQ ID No.3具有80%以上的同源性的核苷酸序列。3. -种如权利要求1所述的D-乳酸脱氢酶或一种如权利要求2所述的核苷酸序列在D-乳酸生产中的应用。4. 一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株具有如权利要求1所述的D-乳酸 脱氢酶或如权利要求2所述的核苷酸序列编码的D-乳酸脱氢酶。5. -种如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株中原始的D-乳酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶基因失活或缺失，乙酰乳酸合成酶和乙酰乳酸脱羧酶基因中的 一种或两种失活或缺失。6. -种如权利要求5所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株还具有一个 或多个基因的失活或缺失，所述一个或多个基因选自：丙酮酸甲酸裂解酶基因、丙酮酸甲酸 裂解酶活化酶基因、丙酮酸脱氢酶基因、乙酸激酶和乙醇脱氢酶基因。7. -种如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的起始菌为 牙抱杆囷。8. -种如权利要求4所述的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是地衣芽孢 杆菌（Bacillus licheniformis)BNll，保藏号为CCTCC N0:M2016026的，于2016年1 月8 日保 藏于中国典型培养物保藏中心。9. 一种制备如权利要求3所述的基因工程菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 敲除起始菌株中的L-乳酸脱氢酶基因； 2) 引入如权利要求2所述的编码D-乳酸脱氢酶的核苷酸序列； 3) 将乙酰乳酸合成酶和/或乙酰乳酸脱羧酶基因进行失活或缺失； 4) 在进行步骤3)的同时或之后，在步骤2)中引入的所述核苷酸序列之前加上启动子序 列。10. -种如权利要求4-8中任一项所述的基因工程菌株的应用，其特征在于，在生产D-乳酸中的应用。
【文档编号】C12R1/10GK105907732SQ201610056883
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年1月27日
【发明人】许平, 李超, 陶飞, 唐鸿志
【申请人】上海交通大学