针对疟原虫乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白ii的核酸适体及其用于疟疾诊断的用途
【专利摘要】本发明提供了结合疟原虫蛋白乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体及其用于诊断疟疾的用途。针对富含组氨酸蛋白II的适体可用于通常检测疟原虫物种的存在，而针对乳酸脱氢酶的适体可用于特异性检测恶性疟原虫。
【专利说明】针对疟原虫乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白Μ的核酸适体 及其用于疟疾诊断的用途
[0001] 交叉引用相关申请 本申请要求2012年2月9日提交的美国临时申请序列号61/596, 774的权益，所述申 请以其整体通过引用并入本文。 发明领域
[0002] 本发明涉及特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)和富含组氨酸蛋 白II (HRPII)的DNA适体及其用于诊断疟疾的用途。
[0003] 背景 疟疾，热带和亚热带地区广泛传播的传染性疾病，由寄生原生生物疟原虫的感染引起。 尽管存在可以感染人的四种痕原虫，但物种恶性痕原虫引起痕 疾的最危险形式，具有最高的死亡率。根据世界卫生组织（WHO)，每年有超过两亿确诊的疟 疾病例，导致近一百万例死亡。
[0004] 此外，疟疾对国家和个人的财富具有负面影响。根据世界银行，疟疾使非洲每年花 费约120亿美元，且每年使国内生产总值（GDP)减缓超过1 %。疟疾的负担使家庭和社区陷 入由于生产力损失导致的更深的贫困和对国内和国外投资和旅游业的负面影响。此外，疟 疾大大影响社会的结构，因为高死亡率经常折磨五岁龄以下的年龄组。
[0005] 美国疾病控制和预防中心注意到，虽然彻底消除疟原虫将是最优的，但这对于大 部分疟疾流行的国家是不现实的。疟疾病例的改进管理对于控制疟疾传播是根本性的。
[0006] 快速诊断测试（RDT)对于管理疟疾以减少疟疾的发病率、死亡率和传播是至关重 要的。对于疟疾常用的RTD包括显微镜测定法、聚合酶链式反应（PCR)测定法、和基于抗体 的测定法。疟疾的显微镜诊断，其基于血液涂片中疟原虫的显微镜观察，可以区分不同种的 疟原虫。基于PCR的检测也可以以高灵敏度区分不同种的疟原虫。然而，显微镜和基于PCR 的诊断测试两者都需要昂贵的设备和训练有素的健康护理工作人员，这通常对于发展中国 家中的大多数处于风险中的群体是不可得的。
[0007] 基于抗体的测定法利用抗体来检测疟原虫抗原。用于疟疾诊断的常用疟原虫抗原 包括疟原虫乳酸脱氢酶（pLDH)、富含组氨酸蛋白2 (PfHRP2)和醛缩酶。尽管基于抗体的快 速诊断测定法已经使疟疾管理大大受益，但它们具有显著的缺点，包括热不稳定性、批次间 变化和高生产成本。
[0008] 因此，对于用于疟疾诊断的改进方法存在需求。
[0009] 概述 本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶和疟原虫富含组氨酸蛋白II的核酸适体（本文 中被称为"疟疾适体"）和使用这些疟疾适体诊断和治疗疟疾的方法。
[0010] 在一个实施方案中，本发明提供了以高特异性和亲和力靶向并结合两种疟疾蛋白 乳酸脱氢酶和富含组氨酸蛋白II的核酸适体。针对乳酸脱氢酶的适体可用于泛物种检测 (pan-species detection)痕原虫，而针对富含组氨酸蛋白II的适体可用于特异性检测恶 性疟原虫。并行地，可以将这两种适体并入装置以通常检测疟原虫和诊断疟疾，以及确定疟 疾是否特异性地由恶性疟原虫引起。
[0011] 本发明涉及使用疟疾适体作为用于诊断疟疾的诊断装置的组分的方法。该方法提 供了基于疟疾适体与疟疾蛋白目标的结合的特异性的疟疾抗原的特异性检测。
[0012] 在某些实施方案中，本发明提供了包含本发明的核酸适体、或此类适体的稳定的 衍生物、或其药学上可接受的盐的制剂。该制剂可以包含结合疟原虫乳酸脱氢酶或疟原虫 富含组氨酸蛋白Π 或其变体或片段的任何适体。
[0013] 本发明还提供了使用本发明的核酸适体用于通过特异性结合疟原虫编码蛋白和/ 或抑制疟原虫编码蛋白的功能而诊断或治疗疟疾的方法。
[0014] 在诊断方面，本发明可以与其它诊断方法组合使用。在一个实施方案中，本发明可 以给个体施用单独或与其它药物组合的一定量的疟疾适体。
[0015] 在一个实施方案中，本发明还提供了定量样品中疟原虫蛋白水平的诊断方法。疟 疾适体可以通过可检测物质进行标记，所述可检测物质包括但不限于荧光材料、酶、发光材 料和放射性材料。本发明的此类实施方案可以用于检测生物样品中的疟原虫蛋白水平。
[0016] 附图简述 图1是描绘使用"通过指数富集配体的系统进化（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) "（SELEX?)方法体外选择适体的不意图。
[0017] 图2显示体外选择LDH适体的琼脂糖凝胶分析。在第1、第3、第5、第7、第9、第 12、第15、第18、第19和第20轮采集的样品。
[0018] 图3显示本发明的适体的实施方案的核酸序列。所述适体特异性结合恶性疟原虫 乳酸脱氢酶（PfLDH)或富含组氨酸蛋白2 (HRP2)。分别在20轮针对恶性疟原虫PfLDH或 针对恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRP2)的SELEX(包括通过使用人LDH和磁珠的反向 SELEX方法）之后从ssDNA库克隆并测序适体。
[0019] 图4是显示使用等温滴定量热法的2009(在每个5'和3'末端具有两个18聚体 (18-mer)序列的PfLDH适体）和2009s之间的比较的图。左侧小图是2009的原始量热法 数据和结合等温线，右侧小图是2009s(SEQ ID N0:3)的原始量热法数据和结合等温线。通 过连续注射用适体滴定PfLDH，且使用单一结合位点模型拟合结合等温线。
[0020] 图5是显示PfLDH适体（SEQ ID NO: 1; 2004s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之 间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体剂（SEQ ID N0:1; 2004s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原 始量热法数据的整合产生的结合等温线。
[0021] 图6是显示PfLDH适体（SEQ ID N0: 2; 2008s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之 间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体（SEQ ID N0:2; 2008s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原 始量热法数据的整合产生的结合等温线。
[0022] 图7是显示PfLDH适体（SEQ ID N0: 3; 2009s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之 间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体（SEQ ID N0:3; 2009s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原 始量热法数据的整合产生的结合等温线。
[0023] 图8是显示PfLDH适体（SEQ ID NO: 4; 2021s)和重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶之 间的结合的等温滴定量热法分析结果的图。上面小图是用连续注射PfLDH适体（SEQ ID N0:4; 2021s)滴定PfLDH的原始量热法数据。下面小图是针对适体稀释的热校正之后由原 始量热法数据的整合产生的结合等温线。
[0024] 图9显示四聚的PfLDH与两个本发明的DNA适体的结合。（A)四聚的LDH在与本 发明的DNA适体的两个具体实施方案的复合体中的晶体结构。（B)复合状态中本发明的 DNA适体的具体实施方案的结构，以及该DNA适体的核酸序列。（C)适体与PfLDH(左）和 人LDHA1和LDHB (右）结合的等温滴定量热法滴定。
[0025] 图10显示在蛋白：适体结合：适体结合界面处的底物特异性环决定适体对于 PfLDH相比于hLDH的辨别。（A) DNA适体与PfLDH的直接相互作用。⑶适体结合的辨别 是由于底物特异性环中的差异。PfLDH和hLDHB的底物特异性环显示于（B)。
[0026] 图11显示用于分子诊断中的缀合至金纳米颗粒的适体。（A)方法的原理。（B)单 独的纳米颗粒（左）、适体缀合的纳米颗粒（中）和在PfLDH存在的情况下适体缀合的纳 米颗粒（右）的TEM。（C)使用纳米颗粒来检测具体以25 ng/μ 1的PfLDH的定性观察。 (D) (C)中数据的定量吸光度。
[0027] 序列概述 SEQ ID NO: 1是结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)的DNA适体的核酸序列。
[0028] SEQ ID N0: 2是结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)的DNA适体的核酸序列。
[0029] SEQ ID N0: 3是结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)的DNA适体的核酸序列。
[0030] SEQ ID N0: 4是结合恶性疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)的DNA适体的核酸序列。
[0031] SEQ ID N0: 5是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序 列。
[0032] SEQ ID N0: 6是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序 列。
[0033] SEQ ID N0: 7是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序 列。
[0034] SEQ ID N0: 8是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序 列。
[0035] SEQ ID N0: 9是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸序 列。
[0036] SEQ ID N0: 10是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸 序列。
[0037] SEQ ID N0: 11是结合恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体的核酸 序列。
[0038] SEQ ID N0: 12是根据本发明有用的引物的核酸序列。
[0039] SEQ ID N0: 13是根据本发明有用的引物的核酸序列。
[0040] SEQ ID N0: 14是根据本发明有用的核酸序列。
[0041] SEQ ID N0: 15是根据本发明有用的引物的核酸序列。
[0042] SEQ ID N0: 16是根据本发明有用的引物的核酸序列。
[0043] SEQ ID NO: 17是根据本发明有用的引物的核酸序列。
[0044] SEQ ID N0: 18是根据本发明有用的引物的核酸序列。
[0045] SEQ ID N0: 19是根据本发明有用的引物的核酸序列。
[0046] SEQ ID N0: 20是根据本发明有用的引物的核酸序列。
[0047] 详述 本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII)的核 酸适体。本发明的核酸适体可以包含DNA或RNA核苷酸。在一个实施方案中，本发明提供 了结合疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II(HRPII)的DNA适体。
[0048] 在某些具体实施方案中，本发明提供了包含选自SEQ ID NOs: 1-11的核酸序列的 i^一种不同的DNA适体序列。这些适体中的四种（SEQ ID N0s: 1-4)针对疟原虫乳酸脱氢 酶进行选择，且这些适体中的七种（SEQ ID N0s:5-ll)针对富含组氨酸蛋白II进行选择。 [0049] 等温滴定量热法结果显示本发明的适体与它们各自的目标（疟原虫乳酸脱氢酶 和疟原虫富含组氨酸蛋白II)的紧密结合（图4-8)。这些适体还显示与对照蛋白的可忽略 的结合，表明与各自目标的特异性结合。具体而言，本发明的疟原虫LDH适体不结合人LDH。
[0050] 本发明还提供了本发明的核酸适体用于快速且灵敏地检测样品中的疟原虫，以及 用于检测个体中的疟疾的用途。
[0051] 结合疟原虫LDH和疟原虫HRPII的适体 本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII)的核 酸适体。本发明的核酸适体可以包含DNA或RNA核苷酸。在一个实施方案中，本发明提供 了结合疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII)的DNA适体。
[0052] 在一个实施方案中，本发明提供了结合或特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)的 核酸适体，其中所述适体包含SEQ ID NOs: 1-4中的任一种： 5^ΛCtCGΛCιC^ΛGGTCfGTΛCiΛΛTC^ATΛΛTCjGCΓTGΛΓΓ-.V (St*：Q ID M?: i) (2004^； 5·<?Τι0(?Γ001'Λ(1ΑAC：C\<I：A(ll，GACrrAGCCCrrCl，AC-3'(SEQ ID K〇：2) (2(10X^}; 5 -?'ΛΟΟΤΟΟΓΓΛΟ Λ ΛΟΟΤΛΟΛ ΛΓΓΛΤΛΟΤΟΟΙ'Γ 1'OG TA-3*{Sl：；〇 ID NO; 31 fi 5*-Λ0Λ AlOCXlIGGACiAGCCll'ACiCTiArCATTf：fi1'AC：-；r(SH〇 1D MO:4) (2021 s)
[0053] 在另一个实施方案中，本发明提供了结合或特异性结合疟原虫富含组氨酸蛋白 II (HRPII)的核酸适体，其中所述适体包含SEQ ID NOs: 5-7中的任一种： i'-ACK'CK'ATTf'ATGC'GC'TCX'CXiCTTATCKXJtXKifXjiKX'AC'CiTCKiAAAC'CXXiGI ΙΓΓΟΓΙΤΟ?πΤΟΓ?Λ?ΚΤ^' {SEQ 1DK0:5) CJOb): 5"-TCK'(rACTTATCJTTCCiCC'CCXTX'CCTCTTGTTCTC.J'CSEQ ID N〇：6) (2f〇5^)： S'-CjCTTATCX'OATCK'AtiAC'CCCTTCCKiTCrTCJC'rCTr.S'tSEQ ID K():7) (21 Ofe); 5*-ixiGit：Airi(XtTritiGG/\cTiAir：A'ii'Ccraiiv\ror-;r(Sb：〇 id no：k) m 12s)； 5'4'\Α--ΤΧ\·\€ΠΧ?Λ(3ΛΛ€,1?Γ?Γ〇4〇--Γι1·€ΧΓΛΙ--?*Λ€Γ1，ΛΓι(·Τ(Τ1Γ?ΧΓιΓΛΓΤ ΟΓ1Γι€--?Τ1?ΤΟ€ΟΟΛ(ΧΓι·Ι'Λ'ΙΤχν(?；|·；〇 ID \〇；9) (2115s); 5'-(T(KiCKJ(iGGTT(TAC}(iCiC；CKi<iOCK'ACTTAT(TOCA-.riSCQ ID NO:刚 f212fc): p 5'.TTATTCiCKi(ICKi(iITACKKKi<JCjCiCJCTTTTATTCACT-3*lSEQ ID NO:l 1) |?144s)
[0054] 如等温滴定量热法的结果（图4)中显示，当与具有SEQ ID NO:3的适体相比时， 在SEQ ID N0:3的5'和3'末端添加两个18聚体序列的适体具有相似的对疟原虫LDH的 化学计量、解离常数和结合亲和力（在纳摩尔范围内的相似结合亲和力）。
[0055] 在某些实施方案中，本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)的核酸适体，其 中所述适体包含核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID NOs: 1-4中的任一种具有至少约80%同 一性，或高于80%的任何百分比，诸如，至少85%、90%、92%、93%、94%、95%或98%。
[0056] 在某些实施方案中，本发明提供了结合疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII)的核酸 适体，其中所述适体包含核酸序列，所述核酸序列与SEQ ID N0s:5-ll中的任一种具有至少 约80%同一性，或高于80%的任何百分比，诸如，至少85%、90%、92%、93%、94%、95%或98%。
[0057] 在某些实施方案中，本发明提供了结合疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)的核酸适体，其 中所述适体包含核酸序列，所述核酸序列相对于SEQ ID NOs: 1-4中的任一种具有不超过8、 7、6、5、4、3、2或1个核酸的修饰（诸如添加、缺失、取代）。
[0058] 在某些实施方案中，本发明提供了结合疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII)的核酸 适体，其中所述适体包含核酸序列，所述核酸序列相对于SEQ ID NOs: 5-11具有不超过15、 14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核酸的修饰（诸如添加、缺失、取代）。
[0059] 在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)或疟原虫 富含组氨酸蛋白II(HRPII)的核酸适体。在一个实施方案中，本发明提供了特异性结合恶 性疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)或恶性疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII)的核酸适体。
[0060] "特异性结合"或"特异性"是指适体可检测地结合呈递在抗原上的表位，同时具 有与其它蛋白或结构相对小的可检测的反应性的能力。特异性可以通过，例如，与特定抗原 的结合相比于与其它无关分子的非特异性结合的亲和力/亲和力（affinity/avidity)的约 10:1、约20:1、约50:1、约100:1、10. 000:1或更高比例来表现。
[0061] 除非另有说明，如本文所用，两个序列的百分比序列同一性和/或相似性可以使 用如Karlin和Altschul(1993)中修改的Karlin和Altschul(1990)的算法来确定。将此 类算法并入Altschul等人（1990)的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NBLAST程序、评分 =100、字长=12进行BLAST搜索，以获得具有期望百分比序列同一性的序列。为了获得用 于比较目的的有缺口的比对，可以如Altschul等人（1997)中所述使用Gapped BLAST。当 利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各自程序（NBLAST和XBLAST)的默认参数。 参见NCBI/NIH网站。
[0062] 适体序列的修饰 可以对适体进行各种修饰，以降低外切核酸酶降解并增加其用于诊断或用于治疗的寿 命。用反转胸苷、脱氧胸苷核苷酸和聚乙二醇（PEG)修饰适体的3'末端可以降低寡核苷酸 适体的降解并且增加适体的稳定性。在一个实施方案中，PEG具有约20 - 80 kDa的平均 分子量。
[0063] 进一步，还可以修饰适体的脱氧核糖-磷酸酯骨架的磷酸二酯键，以改善稳定性。
[0064] 在一个实施方案中，本发明的核酸适体是寡核酸分子，其包含式1所示结构的重 复单元。波浪线区别一个核苷酸和/或重复单元与邻近的核苷酸和/或重复单元。
【权利要求】
1. 结合疟原虫乳酸脱氢酶的适体，其包含与SEQ ID NOs: 1-4中任一种具有至少85% 同一'I"生的核酸序列。
2. 根据权利要求1的适体，其包含选自SEQ ID NOs: 1-4中任一种的核酸序列。
3. 根据权利要求1的适体，其具有15-50个核苷酸碱基。
4. 根据权利要求1的适体，其中所述适体与一个或多个选自脱氧胸苷核苷酸、反转胸 苷和聚乙二醇的部分缀合。
5. 根据权利要求1的适体，其中所述适体是具有由脱氧核糖-磷酸酯键形成的骨架的 寡核苷酸。
6. 根据权利要求1的适体，其中所述适体是这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸的骨架包 含由一个或多个硫酯键和/或一个或多个酰胺键稳定的一个或多个脱氧核糖-磷酸酯键。
7. 结合疟原虫富含组氨酸蛋白II的适体，其包含与SEQ ID N0s:5-ll中任一种具有至 少85%同一性的核酸序列。
8. 根据权利要求7的适体，其包含选自SEQ ID N0s:5-ll中任一种的核酸序列。
9. 根据权利要求7的适体，其具有15-100个核苷酸碱基。
10. 根据权利要求7的适体，其中所述适体与一个或多个选自脱氧胸苷核苷酸、反转胸 苷和聚乙二醇的部分缀合。
11. 根据权利要求7的适体，其中所述适体是具有由脱氧核糖-磷酸酯键形成的骨架的 寡核苷酸。
12. 根据权利要求7的适体，其中所述适体是这样的寡核苷酸，所述寡核苷酸的骨架包 含由一个或多个硫酯键和/或一个或多个酰胺键稳定的一个或多个脱氧核糖-磷酸酯键。
13. 试剂盒，其包含根据权利要求1的适体，和载体。
14. 试剂盒，其包含根据权利要求7的适体，和载体。
15. 用于诊断个体中的疟原虫感染的方法，其包括： 从个体获得生物样品； 将所述生物样品与核酸适体接触，所述核酸适体包含与SEQ ID NOs: 1-11中任一种具 有至少85%同一性的序列； 确定所述核酸适体和疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)和/或疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII)之间的结合复合体的形成， 其中所述结合复合体的存在表明所述个体具有疟原虫感染。
16. 根据权利要求15的方法，其中所述核酸适体包含选自SEQ ID NOs: 1-11中任一种 的序列。
17. 根据权利要求15的方法，其中所述结合复合体的存在表明所述个体具有恶性疟原 灰{Plasmodium falciparum)感染。
18. 根据权利要求15的方法，其中所述生物样品是血液或尿液样品。
19. 用于检测样品中疟原虫的存在的方法，其包括： 将样品与核酸适体接触，所述核酸适体包含与SEQ ID N0s:l-ll中任一种具有至少 85%同一性的序列； 确定所述核酸适体和疟原虫乳酸脱氢酶（LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII) 之间的结合复合体的形成，其中所述结合复合体的形成表明所述样品中疟原虫的存在。
20. 根据权利要求19的方法，其进一步包括确定所述核酸适体和疟原虫乳酸脱氢酶 (LDH)或疟原虫富含组氨酸蛋白II (HRPII)之间形成的结合复合体的浓度或量。
21. 根据权利要求19的方法，其中所述核酸适体包含选自SEQ ID NOs: 1-11中任一种 的序列。
22. 根据权利要求19的方法，其中所述结合复合体的存在表明个体具有恶性疟原虫感 染。
【文档编号】C07H21/04GK104245957SQ201380008737
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年2月6日 优先权日:2012年2月9日
【发明者】唐柱霖, 张绮蕙, 小高雅代 申请人:香港大学