具有d-乳酸脱氢酶活性的甘油脱氢酶变体及其用途

具有d-乳酸脱氢酶活性的甘油脱氢酶变体及其用途【专利摘要】本发明提供一种设计及产生比较于亲代多肽而具有改变功能的甘油脱氢酶(GlyDH)变体的方法。本发明更提供一种编码比较于亲代多肽而具有改变功能的GlyDH多肽变体的核酸。本发明的各种实施形态中也提供包含编码GlyDH变体的多核苷酸的宿主细胞和制造乳酸的方法。【专利说明】具有D-乳酸脱氢酶活性的甘油脱氢酶变体及其用途[0001]相关申请的前后参照本申请要求2011年10月4日提出的美国临时专利申请序号第61/543003号的权益，特此将该专利申请的公开内容完整加入作为参考，包括所有附图、表格和氨基酸或核酸序列。[0002]本发明受政府支持由能源部（DE-FG36-04G014019号与DE-FG36-08G088142)与美国农业部、国家食品和农业研究院（2011-10006-30358号）补助而成。政府在本发明中拥有特定权利。【
背景技术：
】[0003]石油作为汽车燃料的首要来源以及用于有机化学和塑料的主要原料。石油储备的有限性和使用石油的负面环境冲击，将注意力逐渐转移到可再生原料的替代物上（1?4)。碳水化合物的发酵作用已被证明制造出短链氢氧基酸以及其他可被聚合成塑料并代替石油的化学物质（5)。早在1895年时就已经开始使用纯细菌培养进行乳酸的商业化生产（6)，而目前的年产量已超过300000公吨。虽然乳酸主要用于食品和药品产业，假设可以降低制造聚乳酸生物聚合物（polylacticacidbiopolymers，PLA)的成本，贝u制造PLA的应用预期将会超过其他的用途（7,8)。[0004]乳酸被浓缩成乳酸交酯双体（lactidedimers)，纯化并聚合成热塑性塑料（7,9)。混合D型（_)和L型（+)乳酸聚合物提供实质上控制物理及热化学特性与生物分解速率(9)。虽然可以用石油人工合成出乳酸，化学合成制造出的异构物的混合物并不适合用于PLA。合成PLA所需的旋光性纯乳酸可以通过微生物发酵快速制造（8)。通过乳酸细菌，例如乳酸菌、乳酸球菌等等，从葡萄糖和蔗醣在介于30°C到40°C温度之间以高产率及滴度制造出商业化L型（+)乳酸（8,10)。大肠杆菌（Escherichiacoli)的衍生物是已知唯一商业化D型㈠乳酸的生产者（11，12)并且也能在40°C以下达到最佳运作。[0005]为了消除碳水化合物（葡萄糖、蔗醣）食物的使用，需要可发酵醣的替代来源，例如木质纤维素生物量与改良的微生物性生物催化剂以用于乳酸的制造（13)。然而，使用纤维素作为原料的商业化真菌纤维素意味着可观的制造成本。可以通过有效率地在最佳用于真菌纤维素的环境（PH5.0,50°C)下发酵的耐热性生物催化剂的开发而减少所述成本（14，15)。[0006]通过磷酸乙酮醇酶途径的工业代谢性五碳醣（从半纤维素）所使用的乳酸生物催化剂，阻止这些醣高效率的转换成乳酸。使用该途径从五碳醣制造的乳酸被等摩尔量的乙酸所污染（图1)(8,16?18)。为了提升这些乳酸细菌的木糖发酵性质所做的尝试仅获得有限的成功（18，19)。虽然在半纤维素中所有的五碳醣都被大肠杆菌（E.coli)衍生物有效率地通过五碳醣-磷酸途径发酵成D型（-)或L型（+)乳酸，这种生物催化剂的温度或pH值容忍度仍不足以允许用于在商业化纤维素的最佳温度（50°C)或pH值（5.0)下的纤维素发酵（20)。[0007]凝结芽孢杆菌（Bacilluscoagulans)具有多种将木质纤维素醣发酵成乳酸的期望特性。这种细菌利用高效率五碳醣-磷酸途径在用于商业化真菌纤维素的最佳环境50-55°C及pH值5.0下将五碳醣和六碳醣发酵成L型（+)乳酸（图1)(15,17,21)。原生菌株在葡萄糖或木糖进行补料分批发酵下，产生浓度高达180gΓ1的旋光性纯L型（+)乳酸，并使用真菌纤维素良好地运作于纤维素的同步醣化和发酵（SSF)期间（21，22)。这种用于凝结芽孢杆菌的发酵及真菌纤维素活性的最佳组合使得比较于嗜温细菌的生物催化剂的同步醣化和发酵允许减少4倍的纤维素使用量（21)。对比于需要复合营养素的乳酸细菌，凝结芽孢杆菌也以便宜的玉米浸渍液（cornsteepliquor)(0.25%，w/v)补充剂于矿物盐介质中成长并发酵糖（8,15,18)。虽然凝结芽孢杆菌在将纤维素转变成旋光性纯L型（+)乳酸的生物催化剂上具有优异潜力，相同效力的用于制造乳酸的D型（-)异构物的微生物目前仍未被讨论过。【
发明内容】[0008]本发明提供一种设计并产生比较于亲代多肽（parentpolypeptide)具有修改功能的甘油脱氢酶（glyceroldehydrogenase,GlyDH)变体。本发明更提供一种编码比较于亲代多肽具有修改功能的甘油脱氢酶多肽变体的核酸。本发明的各种实施形态中也提供一种包含编码甘油脱氢酶变体的多核苷酸的宿主细胞与制造乳酸的方法。【专利附图】【附图说明】[0009]图1为葡萄糖与木糖在凝结芽孢杆菌菌株P4-102B中的无氧代谢途径。箭头的厚度表示葡萄糖或木糖流到L-乳酸（折线）作为野生型无氧生长期间的优选路线和流到在本研究中所建构的菌株QZ19的D-乳酸。虚线箭头（L-LDH和ALS)代表于本研究中引进的二个途径的变异。在乳酸细菌中的木糖发酵途径，例如乳酸球菌利用磷酸乙酮醇酶途径导致等摩尔乳酸和乙酸亦呈现作为比较。参考帕特尔等人透过凝结芽孢杆菌和乳酸球菌发酵五碳醣的细节（17)。[0010]图2D-乳酸生产凝结芽孢杆菌菌株QZ19的发酵分布曲线图。葡萄糖为进行发酵在50°C下浓缩为110gΓΗΟ.ΘΜ)且媒介通过添加氢氧化钙（Ca(0H)2)维持pH值为5.0。[0011]图3为结晶纤维素通过凝结芽孢杆菌菌株QZ19在50°C、pH值5.0下同步醣化和发酵成D-乳酸。乳酸球菌资料是从欧等人（22)取得并包含作为比较。初始纤维素（过滤禮：，SolkaFloe)浓缩为40gL、[0012]图4为各种凝结芽孢杆菌菌株在往D-乳酸生产菌株QZ19的路径上的粗取物蛋白质的聚丙烯酰胺胶体电泳（SDS-PAGE)。以pH控制（5.0)发酵的LB+葡萄糖中（30gΓ1)的培养生长物在生长的中期到晚期指数相期间收获，且制备并分析细胞萃取物。左线，标准分子量。左侧的数字代表蛋白质依千道尔吞的对应分子量。右线，菌株QZ19的纯甘油脱氢酶(GlyDH*)〇[0013]图OTNA插入于强化gldA表达的凝结芽孢杆菌菌株QZ13的gldA基因的上行区域中。插入件DNA(1821bp)以斜体起始表示于gldA基因（在ATG中"A"作为+1)的-62处的"C"後且持续往上行。直接重复（封闭于椭圆形内）的十一个底物表示插入的端点处，一个位于插入件的5-端点处而第二个位于紧邻插入的3-端点处的gldA基因的5-端点处。0RF1，为假定DoeR家族转录调节子；0RF2和0RF3,在插入件DNA中的假定转座酶；gldA，甘油脱氢酶。表不假定-10、-35及沙恩-达尔加诺序列（Shine-Dalgarnosequences,SD)。[0014]图6A、6B、6C凝结芽孢杆菌野生型P4-102B的发酵分布曲线图（图6A)，和它的ldh(菌株QZ4,图6B)及ldh、als(菌株QZ5,图6C)变体。通过自动添加Κ0Η到LB+葡萄糖（0.16M)在pH值控制在5.0下于50°C的小发酵槽内进行发酵作用。[0015]图7小发酵槽内的凝结芽孢杆菌菌株QZ5到D-乳酸生产菌株QZ19的代谢进化。每三天在代谢进化期间进行乳酸滴度的测定。关于其他细节参考正文。[0016]图8小发酵槽内的LB+葡萄糖在pH值为7.0下以逐渐增加的葡萄糖浓度的凝结芽孢杆菌菌株QZ14的代谢进化。介质也包含0.2M碳酸钙（CaC03)。起始葡萄糖浓度为50gΓ1(0.28M)。在第三次转换后，葡萄糖浓度增加到60gΓ1(0.33M)。在第五次转换后介质的葡萄糖浓度为l〇〇g1^(0.56M)。在各转换的三天后测定培养基的乳酸滴度。在进行培养60天之后，隔离制造约0.8Μ乳酸的菌株QZ15。在进行代谢进化的再63天之后，隔离菌株QZ19。[0017]图9通过凝结芽孢杆菌菌株QZ19在pH值5.0及50°C下进行葡萄糖的补料分批发酵成D-乳酸。在LB+葡萄糖中控制pH值起始于葡萄糖的lOOgPOXSeM)进行发酵，且在72小时加入另外的葡萄糖的lOOgL4(0.56M)。通过添加氢氧化钙维持培养基的pH值在5.0〇[0018]图10通过凝结芽孢杆菌菌株QZ19在50°C及pH值5.0下将木糖发酵成D-乳酸。LB介质内含木糖SOgr1(0.53M)及碳酸钙（CaC03)0.2M。[0019]图11凝结芽孢杆菌菌株QZ19的甘油脱氢酶的胺基酸序列与D-乳酸脱氢酶活性。在消化胰蛋白酶及片段的LC-MS/MS後检验上例的胺基酸。[0020]图12凝结芽孢杆菌野生菌株P4-102B及它的D-乳酸生产衍生物，内含于甘油脱氢酶中的二突变变异菌株QZ19(序列号第1号）（GlyDH*)改变的甘油脱氢酶（GlyDH)(序列号第3号）的胺基酸序列。[0021]图13凝结芽孢杆菌甘油脱氢酶根据通过瑞士模型所建构的嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus)甘油脱氢酶（PDB1JPU)的模型。自然酵素颜色为绿色而QZ19(GlyDH*)的酵素颜色为青色，并被迭加在一起。胺基酸121及245被强调显示；自然胺基酸为黄色以及修改的胺基酸（菌株QZ19)为品红色。底部：根据所列的嗜热脂肪杆菌酵素结构，仅有在活性位的胺基酸。左侧，具甘油的自然甘油脱氢酶在活性位；右侧，具丙酮酸的甘油脱氢酶（GlyDH*)(D121N，F245S)在活性位。[0022]图14提供各种甘油脱氢酶多肽（序列号第5?32号）的比对。如比对中所表示的，在对应序列号第3号的胺基酸121及245的位置所发现的天冬氨酸（asparticacid)及苯丙氨酸（phenylalanine)保存于所有多肽中。[0023]图15自然蛋白质以及在基于生长选择用于生产D-乳酸的凝结芽孢杆菌期间所获得的酵素修改形式的甘油脱氢酶活性。[0024]图16自然蛋白质以及在基于生长选择用于生产D-乳酸的凝结芽孢杆菌的期间所获得的酵素修改形式的乳酸脱氢酶活性。[0025]图17于凝结芽孢杆菌菌株QZ19(序列号第53号）的gldA基因上行的插入序列。[0026]图18包含gldA基因于凝结芽孢杆菌菌株QZ19的gldA基因上行的插入序列。小写字母代表插入序列而大写字母表示gldA序列及其紧邻插入位置的上行序列（在-62後以"ATG"中的"A"作为+1)。以小写、粗体、斜体并加底线_(序列号第54号中的位置1822?1827)的序列"ttgaca"为假定-35序列，它通过插入序列被引入gldA上行序列中。gldA的自然上行序列不具有假定-35序列。通过插入而引入该新-35序列使得gldA基因可被表达且在菌株QZ13中生产出高程度的蛋白质及其后代。自然gldA基因的假定-10序列也标明（粗体、斜体及_)。[0027]图19没有插入序列的自然gldA序列。插入位置是以箭头标示（在序列号第55号的脸基219之后）。【具体实施方式】[0028]根据本发明，"核苷酸序列"、"聚核苷酸"或"核酸"可以互换使用并被理解为意指双链DNA、单链DNA或所述DNAs的转录产物（例如RNA分子）。其应同时被理解为本发明应无关于其自然环境或自然状态中的基因组的聚核苷酸序列。本发明的核酸、聚核苷酸或核苷酸序列可通过包含但不限于离子交换层析法、分子尺寸排出层析法的隔离方法，或通过例如增幅（amplification)、差减杂交（subtractivehybridization)、克隆（cloning)、亚克隆（subcloning)或化学合成（chemicalsynthesis)的基因工程方法或这些基因工程方法的组合而被隔离、纯化（或部分纯化）。[0029]蛋白质及核酸序列的同源序列可利用领域中任何各种现有的序列比对算法及程序而评估。这样的算法及程序包含但并不意味着限制于TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA及CLUSTALW。典型地，进行序列比对法是使用通过供应商提供的默认参数或使用那些列于上方所确定的参考数据中的参数，它整体内容在这里合并作为参考。如下文所讨论的，甘油脱氢酶序列可被比对以确定对应那些分别在序列号第3号的位置245及121所找到的苯丙氨酸（phenylalanine)及天冬氨酸（asparticacid)胺基酸残基，且那些胺基酸随后可以被其他的胺基酸取代，例如丝氨酸（serine)或天冬酰胺（asparagine)。[0030]本发明的主题也是提供一种包含编码变体甘油脱氢酶多肽的多核苷酸序列的基因结构。这里所公开的基因结构可以内含额外的调控单元，例如启动子（promoters)或增强子（enhancers),以及可选择性的，选择标记（selectablemarkers)。同时本发明的主题的范畴内为内含上述的基因结构的载体或表达框（expressioncassettes)或编码公开在本说明书中可操作性的连接到调控单元的变体甘油脱氢酶多肽的多核苷酸。载体及表达框还可内含额外的转录控制序列。载体及表达框可进一步包含选择标记。表达框可内含至少一个额外基因，可操作性的连接到控制单元，以共转形有机体。另外，附加基因及控制单元可被提供到多个表达框上。那些表达框被提供具有用于插入本发明的序列的多个限制性酶切位点（restrictionsites)以遵守调控区域的转录规则。表达框可额外的内含可操作性的连接到控制单元的可选择性标记基因。[0031]表达框将包含在转录方向5'?3'、转录及转译起始区、本发明的DNA序列、以及转录及转译终止区中。转录起始区、启动子，对于宿主细胞而言可以为原型的或类似的，或为外来的或异源的。外来的是意指转录起始区不被发现于转录起始区被引入的有机体中。[0032]本发明主题也提供变体甘油脱氢酶多肽的表达，编码在这里所公开的聚核苷酸序列，包含将编码所述变体甘油脱氢酶多肽的聚核苷酸在允许多肽转形的条件下转形进宿主细胞培养，且选择性地回收表达的多肽。[0033]本发明的其他实施形态更提供编码变体甘油脱氢酶的多核苷酸（例如序列号第1号），还有包含核酸的重组载体和重组宿主细胞，或编码变体甘油脱氢酶的重组载体。在一个实施例中，编码变体序列码第1号的变体甘油脱氢酶的多核苷酸包含序列码第2号。[0034]本发明的其他实施形态更提供具有D-乳酸脱氢酶活性的变体甘油脱氢酶多肽。在本发明该实施形态的各种实施例中，甘油脱氢酶多肽是变体的（改变的），使得对应序列码第3号位置245的苯丙氨酸被丝氨酸（F245S)取代及/或对应序列码第3号位置121的天冬氨酸被天冬酰胺（D121N)取代。在一个实施例中，变体甘油脱氢酶具有单体胺基酸取代基（F245S或D121N)。其他实施例提供具有二个胺基酸取代基（F245S或D121N)的变体甘油脱氢酶。另一个实施例更提供包含序列码第1号的变体甘油脱氢酶，或其中具有D-乳酸脱氢酶活性的片段。在优选的特定实施例中，在这里所公开的变体甘油脱氢酶多肽的片段保留了完整长度的变体甘油脱氢酶多肽的至少一个特性或活性。该特性或活性是D-乳酸脱氢酶活性。本发明的该实施形态的其他实施例提供了以同义于丝氨酸（例如苏氨酸(Thr)、甘氨酸（Gly)和天冬酰胺（Asn))的胺基酸在对应于位置245的苯丙氨酸的胺基酸的取代，以及以同义于天冬酰胺（例如谷氨酰胺（Gin))的胺基酸取代对应于序列码第3号位置121的天冬氨酸。[0035]本发明的其他实施形态提供包含在这里所公开的甘油脱氢酶变体的组成物。在各种实施例中，该成分典型地包含携带体，像是缓冲剂或其他液体介质，结合如在这里所公开的变体甘油脱氢酶。[0036]本发明的另一个实施形态更提供导致可操作性连接到启动子的核酸序列的组成性表达增加的启动子。新的重建启动子（图5)看上去可正常构成运作且从该启动子所转录的程度是高的（表2;甘油脱氢酶基因gldA的mRNA水平；在SDS-PAGE硅胶中的蛋白质水平-图4)。该启动子在凝结芽孢杆菌（革兰氏阳性）及大肠杆菌（革兰氏阴性）中作用。"_1〇以及-35"序列本质上为大肠杆菌共识部且通过插入转座子（transposon)而驱动。在一些实施例中，在一些实施例中的核苷酸，核苷酸cgaaaattacaccgagcaagtaaagcacggtagccgaaagtgtacaaaaagagtgtcttggaatacccgatatttaaaccttgtcgagaaaaacttgacacatacCAAAAATAAGTTATGATGGAATTGTGCTTGTTATATTTTTCAC(序列号第56号）或tcgagaaaaacttgacacatacCAAMATAAGTTATGATGGAATTGTGCTTGTTATATTTTTCAC(序列号第56号的核苷酸84?148)可以为了驱动异源基因序列的表达而被操作性的连接到异源序列。[0037]本发明的其他实施形态更提供相较于对照组的细菌、真菌或酵母细胞（不会产生在这里所公开的变体甘油脱氢酶多肽的细胞）而演示增加D-乳酸的生产率（具有增加的D-乳酸脱氢酶活性）的细菌细胞、真菌细胞及酵母（yeast)。细菌细胞可以是革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。在本发明的该实施形态中，革兰氏阴性细菌细胞可以是从埃希氏菌（Escherichia)、发酵单胞菌（Zymomonas)、不动杆菌属（Acinetobacter)、葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter)、地杆菌（Geobacter)、希瓦氏菌（Shewanella)、沙门氏菌(Salmonella)、肠杆菌（Enterobacter)和克雷伯氏菌（Klebsiella)组成的群组中选择的菌属。革兰氏阳性细菌可以从芽孢杆菌属（Bacillus)、梭菌属（Clostridium)、棒杆菌属（Corynebacterium)、乳杆菌属（Lactobacillus)、乳球菌属（Lactococcus)、酒球菌(Oenococcus)、链球菌（Streptococcus)和真细菌细胞（Eubacterialcells)组成的群组中选择。各种嗜热细菌细胞，例如嗜热厌氧菌（Thermoanaerobes)(例如解糖热厌氧杆菌（Thermoanaerobacteriumsaccharolyticum))也可被操纵以通过在这里所公开的变体甘油脱氢酶多肽的表达的方式提升乳酸生产率。其他的嗜热微生物包含但不限于芽孢杆菌属（Bacillusspp·)，例如凝结芽孢杆菌菌株（Bacilluscoagulansstrains)、地衣芽孢杆菌菌株（Bacilluslicheniformlsstrains)、枯草芽抱杆菌菌株（Bacillussubtilisstrains)、解淀粉芽抱杆菌菌株（Bacillusamyloliquifaclensstrains)、巨大芽抱杆菌菌株（Bacillusmegateriumstrains)、浸麻芽抱杆菌菌株（Bacillusmaceransstrains)或类芽孢杆菌属的菌株（Paenibacillusspp.strains)、或土芽孢杆菌属菌（Geobacillusspp·)，例如嗜热脂肪土芽抱杆菌属的菌株（Geobacillusstearothermophilusstrains)可以进行基因改良。其他芽孢杆菌属菌株可从菌种保藏中心（culturecollection)获得，例如美国典型培养物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection,ATCC)，并修改（以编码一个或多个变体甘油脱氢酶多肽的多核苷酸而转形）以通过在这里所公开的一个或多个变体甘油脱氢酶多肽的表达而具有增加的乳酸脱氢酶活性。特殊实施例明确地排除凝结芽孢杆菌菌株QZ19(收存于2010年11月4日，美国农业研究培养收集中心，美国伊利诺伊州60604波利亚市北大学街1815号，登录号NRRLB-50443)在其自然态（未转形）。[0038]其他实施例提供具有增加的D-乳酸脱氢酶活性的酵母细胞或真菌细胞。酵母细胞可以为念珠菌属（Candida)、汉逊酵母（Hansenula)、克鲁维酵母属（Kluyveromyces)、毕赤酵母属（Pichia)、酵母属（Saccharomyces)、裂殖酵母属（Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属细胞（Yarrowiacell),例如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母（Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母（Saccharomycesdiastaticus)、道格拉斯酵母（Saccharomycesdouglasii)、克鲁维酵母（Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母（Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomycesoviformis)或脂耶氏酵母细胞（Yarrowialipolyticacell)。[0039]在其他实施例中，具有提升的D-乳酸脱氢酶活性的细胞可以为真菌细胞。在这里所使用的"真菌"包含子囊菌门（Ascomycota)、担子菌门（Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门（Zygomycota)、卵菌门（Oomycota)及所有的有丝分裂孢子真菌门（mitosporicfungi.)。真菌细胞可以是酵母细胞。在这里所使用的"酵母"包含子囊孢子酵母（内孢霉目（Endomycetales))、产担子孢子囊酵母（basidiosporogenousyeast),且酵母属于不完全真菌属（芽生菌目（Blastomycetes))。由于酵母的分类可能会在未来中改变，为了本发明的目的，酵母应该被定义为酵母的生物学和活动（BiologyandActivitiesofYeast)(斯金纳F.A.、帕斯穆尔S.Μ.及达文波特R.R.合编应用细菌学研讨学会系列第9号，1980年）（Skinner，F.A.，Passmore，S.Μ·，andDavenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9,1980)中所讨论的酵母。[0040]真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞（filamentousfungalcell)。"丝状真菌细胞"包含丝状形式的所有细分真菌门（Eumycota)和卵菌门（Oomycota)(如同霍克斯沃思（Hawksworth)等人所定义的，1995年，同上）。丝状真菌的普遍特性是以几丁质、纤维素、葡聚醣（glucan)、壳聚醣（chitosan)、甘露聚醣（mannan)和其它复杂多醣构成的菌丝体壁。营养生长通过菌丝延伸且碳分解代谢是专性需氧的。相反的，通过例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的酵母的营养生长是通过单细胞菌体的芽接且碳分解代谢可以是发酵性的。[0041]丝状真菌宿主细胞可以是支顶头孢菌（Acremonium)、曲霉菌（Aspergillus)、短梗霉菌（Aureobasidium)、烟管菌属（Bjerkandera)、拟錯菌属（Ceriporiopsis)、金孢子菌属（Chrysosporium)、鬼伞属（Coprinus)、革盖菌属（Coriolus)、隐球菌（Cryptococcus)、线黑粉酵母属（Filibasidium)、镰刀菌（Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌（Magnaporthe)、毛霉菌属（Mucor)、毁丝霉菌（Myceliophthora)、新考玛脂霉菌（Neocallimastix)、脉抱霉菌（Neurospora)、拟青霉菌（Paecilomyces)、青霉菌属（Penicillium)、平革菌属（Phanerochaete)、射脉菌属（Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、蛇燕属（Pleurotus)、裂糟菌属（Schizophyllum)、篮状菌属（Talaromyces)、嗜热子囊菌属（Thermoascus)、梭孢壳菌属（Thielavia)、弯颈霉属（Tolypocladium)、栓孔菌属（Trametes)或木霉细胞（Trichodermacell)。例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、臭曲霉（Aspergillusfoetidus)、烟曲霉（Aspergillusfumigatus)、日本曲霉（Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)、黑曲霉（Aspergillusniger)、米曲菌（Aspergillusoryzae)、黑刺烟管菌（(Bjerkanderaadusta)、干拟錯菌（Ceriporiopsisaneirina)、卡盖尔拟錯菌（Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟錯菌（Ceriporiopsisgilvescens)、培宁辛达拟錯菌（Ceriporiopsispannocinta)、环带拟錯菌（Ceriporiopsisrivulosa)、浅红拟錯菌（Ceriporiopsissubrufa)、虫拟錯菌（Ceriporiopsissubvermispora)、贫乏金抱子霉（Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌属（Chrysosporiumkeratinophilum)、劳肯诺温斯金孢子菌属(Chrysosporiumlucknowense)、章金抱子菌属（Chrysosporiummerdarium)、毯金抱子菌属（Chrysosporiumpannicola)、昆士蘭金抱子菌属（Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌属（Chrysosporiumtropicum)、佐乃特金孢子菌属（Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞（Coprinuscinereus)、毛革盖菌（Coriolushirsutus)、杆抱状嫌抱(Fusariumbactridioides)、禾谷嫌刀菌（Fusariumcerealis)、克地嫌刀菌（Fusariumcrookwellense)、大刀嫌刀菌（Fusariumculmorum)、小麦赤霉病禾谷嫌刀菌属（Fusariumgraminearum)、禾鎌抱菌（Fusariumgraminum)、異抱鎌抱菌（Fusariumheterosporum)、合欢木德抱（Fusariumnegundi)、尖抱鎌刀菌（Fusariumoxysporum)、網鎌抱菌（Fusariumreticulatum)、粉紅嫌刀菌（Fusariumroseum)、接骨木嫌刀菌（Fusariumsambucinum)、肤色嫌抱菌（Fusariumsarcochroum)、拟枝抱嫌抱菌（Fusariumsporotrichioides)、硫色镰刀菌（Fusariumsulphureum)、族囊镰孢菌（Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)、嫌抱霉（Fusariumvenenatum)、特异腐质霉属（Humicolainsolens)、柔毛腐质霉属（Humicolalanuginosa)、米赫根毛霉（Mucormiehei)、嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila)、粗糖脈抱霉（Neurosporacrassa)、产紫青霉(PeniciIliumpurpurogenum)、黄抱平革霉（Phanerochaetechrysosporium)、福身寸身寸脉菌（Phlebiaradiata)、杏鮑燕（Pleurotuseryngii)、太瑞斯梭孢壳霉（Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌（Trametesvillosa)、雲芝（Trametesversicolor)、對木徵菌（Trichodermaharzianum)、纖維素分解菌（Trichodermakoningii)、对长梗木霉（Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉（Trichodermareesei)、或绿色木霉菌(Trichodermaviridecell)。[0042]真菌细胞可以通过本身所现有方法包含原生质体形成、原生质体转形及细胞壁再生的过程而转形。适合将曲霉（Aspergillus)和木霉（Trichoderma)宿主细胞转形的过程在EP238023,叶尔顿等人，1984年，美国国家科学院院刊81:1470?1474,和克里斯滕森等人，1988年，生物/技术6:1419?1422(Yeltonetal.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:1470_1474，andChristensenetal.，1988，Bio/Technology6:1419-1422)中探讨。适合将镰刀菌（Fusariumspecies)转形的方法在马拉迪耶等人，1989年，基因78:147?156(]\&1131(1丨616七31.，1989,6611678:147-156)、和1096/00787中探讨。酵母可以使用贝克和瓜伦特，于阿伯尔森J.N.和西蒙M.I.编辑，酵母遗传学和分子生物学指南，酵素学方法，第194卷182?187页，学术出版社，纽约；伊藤等人，1983年，细菌学杂志153:163;以及埃南等人，1978年，美国国家科学院院刊75:1920(BeckerandGuarente，InAbelson，J.N.andSimon,Μ.I.,editors,GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,MethodsinEnzymology,Volumel94,ppl82-187,AcademicPress,Inc.,NewYork;Itoetal.,1983,J.Bacteriol.153：163；andHinnenetal.,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75：1920)中所述的过程而转形。[0043]本发明的各种其他实施形态提供了生产乳酸的方法。在本发明的这些方法中，现有的细菌、真菌或酵母细胞以在这里所公开的编码变体甘油脱氢酶的多核苷酸转形并接着用于生产D-乳酸。在各种实施例中，这些方法包含在允许D-乳酸生产的条件下培养含有在这里所公开的编码变体甘油脱氢酶的多核苷酸的细菌、真菌或酵母细胞。[0044]如在这里所使用的，"隔离"代表使细菌、真菌或酵母细胞部分地或完全地不受其他细菌的污染。被隔离的细菌、真菌或酵母细胞（细菌、真菌或酵母细胞）可以在不会影响被隔离的细菌、真菌或酵母细胞的功能和特性（例如具有提升的D-乳酸脱氢酶活性的细菌、真菌或酵母细胞）的小比例的其他细菌存在下存在。被隔离的细菌、真菌或酵母细胞将普遍纯度至少为30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。优选地，根据本发明的受隔离的细菌、真菌或酵母细胞的纯度将至少为98%或至少为99%。"重组细胞"是内含异源性多核苷酸序列的细菌、真菌或酵母细胞（例如将在这里所公开的编码变体甘油脱氢酶的多核苷酸）。[0045]野生型的细菌、真菌或酵母细胞是有机体或菌株的典型型态，举细菌细胞的例子来说，当它存在于自然中时是不存在有变体的。野生型是指最普通的自然群体的表型。"亲细菌、真菌或酵母菌株"、"亲细菌菌株"、"亲真菌菌株"或"亲酵母菌菌株"是给定细菌、真菌或酵母细胞的基因型或表型的标准参考并且可以指称为等同于"参考菌株"或"参考细菌、真菌或酵母细胞"。"亲细菌、真菌或酵母菌株"可以曾被基因操纵或为依照所使用的术语中的内文的"野生型"细菌细胞。增加D-乳酸脱氢酶表达在基因修改的细菌、真菌或酵母细胞中，参考菌株或参考细菌、真菌或酵母细胞将会是野生型细菌、真菌或酵母细胞。[0046]在各种实施例中，提供包含例如以在这里所公开的编码变体甘油脱氢酶多肽的聚核苷酸而转形的细菌、真菌或酵母细胞的微生物细胞的组成物。这些组成物可以包含适合用于以在这里所公开的编码变体甘油脱氢酶多肽的聚核苷酸而转形的特殊微生物细胞的培养介质。[0047]"增加"、"提升"、"提高"或"增多"等术语是代表增加至少5%，举例来说，具体活性（例如提升D-乳酸脱氢酶活性或提升D-乳酸生产率）的5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%、95%、99%、100%或更高。[0048]本发明的各种实施形态提供各种用于生产D-乳酸的水解产物，其包含但不限于，来自生物质、半纤维生物质、木质纤维素生物质或纤维素类生物质的水解产物。本发明的其他实施形态更提供具提升D-乳酸脱氢酶活性的细菌、真菌或酵母细胞且生产D-乳酸。[0049]本发明的另一个实施形态提供设计并产生相较于亲多肽具有修改功能的甘油脱氢酶（GlyDH)变体的方法。本发明更提供编码相较于亲多肽而具有修改功能的甘油脱氢酶多肽变体的核酸（例如自然甘油脱氢酶多肽在宿主细胞内的改变，或使得对应苯丙氨酸的序列号第3号位置245的苯丙氨酸改变成丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸或天冬酰胺、及/或对应天冬氨酸的序列号第3号位置121天冬氨酸而改变成天冬酰胺或谷氨酰胺的另一个甘油脱氢酶多肽）。包含编码甘油脱氢酶变体的聚核苷酸的宿主细胞以及生产乳酸的方法也被提供在本发明的各种实施形态中。[0050]本发明的一个实施形态提供设计及产生相较于亲多肽而具有修改功能的甘油脱氢酶变体的方法。该方法普遍包含：a)提供甘油脱氢酶多肽的数据库并比对胺基酸序列；b)选择一个或多个甘油脱氢酶多肽；c)将对应苯丙氨酸的序列号第3号位置245的胺基酸改变成丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸或天冬酰胺，及/或将对应序列号第3号位置121天冬氨酸的胺基酸改变成天冬酰胺或谷氨酰胺，以及；d)选择性的测试被改变的甘油脱氢酶多肽产生乳酸的能力。在一些实施例中，决定在甘油脱氢酶多肽的功能上单体胺基酸取代基的个体影响（在序列号第3号对应位置245的苯丙氨酸或对应位置121的天冬氨酸）。在其他实施例中，决定在甘油脱氢酶多肽的功能上的二个胺基酸取代基的影响（在序列号第3号对应位置245的苯丙氨酸或对应位置121的天冬氨酸的取代）。[0051]在本发明的另一实施形态中，变体甘油脱氢酶多肽相较于亲甘油脱氢酶多肽而具有改变的底物特异性及/或改变的活性。具体来说，变体甘油脱氢酶多肽可以被用于产生D-乳酸（D-乳酸）。本发明的该实施形态的一个实施例提供包含序列号第1号的多肽，或催化D-乳酸形成或具有D-乳酸脱氢酶活性的其中片段。[0052]最后，"包含"、"以…组成"或"实质上以…组成"等术语是根据它们的标准涵义而定义。这些术语可以为了附接相互关联的特定术语而在整篇申请书中以另一个取代。词组"隔离"或"生物学纯度"是代表原料实质上或本质上不具有在其原生状态中被发现时通常伴随原料的成分。因此，根据本发明的被隔离肽类优选地不含有正常相关于在其原位（insitu)环境中的肽类的原料。[0053]在这里所讨论的实施例及实例应被理解为仅用于说明的目的，且依照其的各种修改或变化本领域中的普通技术人员将提出而包含在本申请书的精神及范围以及所附权利要求书的范畴内。另外，在这里所公开任何发明或其中实施例的任何要素或限制可以与任何及/或所有的其他要素或限制（单一的或任何组成）、或在这里所公开的任何其他发明或其中实施例、以及考虑在本发明的范畴而不限制其的该类组成进行组合。[0054]在这里所提及或引用的所有专利、专利申请书、临时专利申请书以及公告书应整体合并于本文中作为参考，包含所有的附图和表格，它们与本发明说明书的明确教导不会不相符。[0055]以下是说明实施本发明的程序的实施例。这些实施例不应被解释成限制。除非另有说明，否则所有的百分比是基于重量且所有的溶剂混合物比例是基于体积。[0056]实施例1原料及方法细菌菌株及质粒在该研究中所使用的细菌菌株、质粒及引物列出在表3及表4中。凝结芽孢杆菌菌株P4-102B使用作为前文所述的野生型菌株（17)。质粒pGK12在一些革兰氏阳性细菌及大肠杆菌（30,31)中进行复制且其复制自然受限制于温度彡42°C。质粒pGK12在50°C进行复制的这种温度敏感性质提供选择凝结芽孢杆菌的染色体DNA整合体可在50-55°C生长的机会介质及成长条件生长及发酵的条件已在前文讨论（15,21-23)。如所需要的，培养基在pH值5.0或7.0的L-培养液（LB)中生长。在接种前加入无菌葡萄糖。[0057]在凝结芽孢杆菌中的基因删除凝结芽孢杆菌的删除突变体的建构是根据前文所述的方法（32)。使用质粒pGK12作为用于删除建构（deletionconstruction)而传输DNA到凝结芽孢杆菌的第一载体。各细胞中的质粒在37°C的群体中的存在（109CFUπιΓ1)帮助解决了质粒DNA进入该细菌的低转形效率，而在50?55°C生长而消除质粒时群体中染色体整合体得以轻易辨识。[0058]代谢进化通过在小型pH-控制发酵槽中在指定条件下依序传代培养进行代谢进化。如生长允许的，每1?3天进行依序传继（2%接种体；v/v)。[0059]酶测定培养生长（在pH-控制发酵槽中的LB-葡萄糖介质）成为中期指数期，收获并如前文所述用于酶测定（23)。来自菌株QZ19的甘油脱氢酶使用差分硫酸铵沉淀而被纯化，接着通过阴离子交换和疏水相互作用层析。甘油脱氢酶（GlyDH)及甘油脱氢酶（GlyDH*)也被N-末端His-标记酶纯化（33)。甘油脱氢酶及乳酸脱氢酶（LDH)使用标准方法被测定（34，35)。[0060]分析方法如前文所述，葡萄糖及发酵产物通过高效液相色谱法（HPLC)进行测定（36)。D型（-)及1^型（+)乳酸的光学异构物通过!^(：(〇^1^3126(0)-青霉胺柱；150\4.6111111，5微米；菲罗门（Phenomenex)公司）使用2mM硫酸铜作为流动相进行测定，并使用D-乳酸脱氢酶(西格玛（Sigma)化学公司，密苏里州圣路易斯）。[0061]在凝结芽孢杆菌中的乳酸脱氢酶基因凝结芽孢杆菌菌株P4-102B典型地以D-异构物（表1)低的（15,17)或无法侦测的程度产生L-乳酸。使用所诠释的关联凝结芽孢杆菌菌株36D1的基因组序列（基因库号码CP003056)作为引导物，在菌株P4-102B中编码L-乳酸脱氢酶（ldh)及D-乳酸脱氢酶(ldhA)活性二者的同源基因通过反转录聚合酶连锁反应（PCR)放大并通过测序而确认。在菌株P4-102B中编码D-乳酸脱氢酶的基因也通过其抑制大肠杆菌突变株（ldhA，pflB)的厌氧生长缺陷的能力而确认，接着将对应复制的ldhA基因进行测序。通过适当的删除以阻止竞争性途径（图1)，该有机物具有仅使用内源基因生产D型（-)乳酸或L型（+)乳酸的潜力。[0062]自然L型（右旋）乳酸脱氢酶（ldh)及乙酰乳酸合成酶（alsS)基因的删除凝结芽孢杆菌菌株P4-102B在pH值5.0下以少量乙酸乙酯和乙醇混合产生L-乳酸作为第一发酵产物（表1;图6)。编码L型⑴乳酸脱氢酶（L-LDH)(菌株QZ4)的ldh基因的删除使用发展用于凝结芽孢杆菌的方法消除NADH氧化反应的主要途径，减缓生长反应以及糖的代谢。然而，伴随D型（-)乳酸的少量增加而大幅增加2,3-丁二醇的产物（表1;图6)。在pH值7.0,有关菌株36D1的ldh变体的发酵作用的第一产物是如同前面看过的乙醇（23)。[0063]通过删除乙酰乳酸合成酶（alsS)而进一步修改菌株QZ4,对2,3-丁二醇产物来说是必要的（图1)。所得的菌株（QZ5)在pH值7.0下以乙醇、乙酸及甲酸迅速代谢葡萄糖作为第一产物（表1)。在该菌株并在该pH值下，流通D-乳酸的丙酮酸仅约为全部分量的5%。然而，当培养在pH值5.0的相同介质中时，菌株QZ5在无氧条件下不会生长。菌株QZ5在pH值5.0下的发酵特性通过在气相中以空气开始培养以支持生长而被测定。由于细胞密度的增加，启动了介质中的氧气的消耗并维持细菌的无氧代谢作用。菌株QZ5在限制氧气相（0.9mm〇leSPgcells，期间pH值5.0下消耗葡萄糖的特定速率约为相似条件下pH值7.0培养基（5.9mmolesPgcells4)的15%。低于特定葡萄糖的消耗速率的6倍且甲酸滴度（表1)表明丙酮酸甲酸裂解酶（PFL)活性会在pH值5.0下限制菌株QZ5的厌氧生长。菌株QZ5也具有较高的D-LDH活性及相较于菌株QZ4而对应增加ldhAmRNA(表2)。然而，无论培养pH值，在QZ5培养液中D型（-)乳酸滴度仅约为10mM，每个葡萄糖代谢乳酸的产率<0.15(理论上每个葡萄糖的产率为2)。[0064]由于二倍突变体产生显著数量的甲酸及其他PFL活性的产品，建构缺少PFL的三倍突变体。然而，缺少L-LDH、ALS及PFL活性的该三倍突变体未能在厌氧性的所有测试条件下生长且没有进一步的研究。[0065]以生长为基础的选择增加D型（_)乳酸产品糖代谢、ATP产品及厌氧生长显然在菌株QZ5中受到限制，尤其在pH值5.0下，通过用于NADH氧化的不充足途径（表1;图1)。在L型（+)乳酸生产期间，预期增加通过菌株QZ5产生的D型（-)乳酸的程度到相似于亲代的程度以恢复二倍变体的厌氧生长。以生长为基础的代谢进化是用于选择优势变体（24)的有力工具但是这需要合适选择的设计。由于菌株QZ5在pH值5.0下产生低程度的PFL活性，通过相关甲酸浓度在培养液中的测定（表1)，该菌株在该pH值用于厌氧生产的代谢进化提供共同选择增加D乳酸的产品的途径。[0066]菌株QZ5在LB+葡萄糖发酵中在pH值5.0下为了较高细胞产量的代谢进化在选择113天之后得到具提升成长的衍生物。该菌株（QZ13)的细胞产量高于野生型，以20倍增加D型（-)乳酸的产品（表1;图7)。为进一步增加D-乳酸的产率及滴度，进一步在LB+葡萄糖发酵中在pH值7.0下用碳酸钙演化菌株Q13。将碳酸钙添加到介质中已显示于前文以解决凝结芽孢杆菌发酵作用的乳酸抑制并允许滴度在补料分批发酵中接近2M(22)。由于碳酸钙固体对介质的缓冲效果在pH值7.0比在pH值5.0还好，进一步的代谢进化在该较高的pH值。在选择的42天之后，菌株QZ14被隔离并测试。以菌株QZ14,D型（-)乳酸代表总量90%以上的发酵产物以及发酵葡萄糖的88%的产率（表1)。[0067]菌株QZ15随着增加葡萄糖浓度在pH值7.0下移植传代（serialtransfers)额外60天之后被隔离（图7及8)。菌株QZ15在pH值7.0的D型㈠乳酸滴度很接近于72小时内1M(表1)。使用lOOgl^HO.56M)的葡萄糖的菌株QZ15的连续代谢进化导致进一步增加流通到乳酸的葡萄糖。菌株QZ19在传代的63天之后被隔离（图8)且该菌株在48小时内在pH值7.0下生产约1.0M的D型㈠乳酸（表1)。通过菌株QZ19在pH值5.0下进行的葡萄糖发酵在72小时内的1.1M乳酸的滴度的短期延迟后开始（图2)。在生产高程度乳酸的菌株QZ15和QZ19的发酵培养液中未侦测到甲酸。由于这些菌株缺少甲酸氢裂解酶活性，因此甲酸是PFL活性的指标。通过菌株QZ19而产生的少量乙醇和乙酸（<5%的葡萄糖碳）大多是衍生自通过丙酮酸脱氢酶复合产生的乙酰辅酶（acetyl-CoA)(25)。[0068]该结果显示以代谢进化结合的ldh与alsS基因的删除导致了凝结芽孢杆菌的第一发酵产物从L型（+)乳酸改变成D型（-)乳酸。虽然pfl基因仍然存在并以比较于菌株QZ4的程度（约全部RNA的1.2ngπιΓ1)而转录在菌株QZ19中，通过不存在于发酵培养液中的甲酸而使流通到PFL的葡萄糖如所见为最少的。这显然是将任何流通PFL到乙酰辅酶的丙酮酸在根据生长的选择期间进行取代而增加D-乳酸的代谢通量的结果（表1)。[0069]产生菌株QZ19的D-乳酸的发酵性质菌株QZ19在葡萄糖的pH值5.0的补料分批发酵中产生接近于2M的D-乳酸（图9)。在该补料分批发酵中，虽然生产乳酸的速率在该相期间是线性的，首批l〇〇gΡ(0.56Μ)的葡萄糖在约50小时内被发酵而第二批100g1^(0.56Μ)的葡萄糖的发酵则需要额外的72小时。菌株QZ19也在短暂迟滞后将木糖发酵成D-乳酸。大约80g1^(0.53M)的木糖在72小时内依重量百分率为90%的产率被转化成D型（-)乳酸（图10)。[0070]纤维素通过菌株QZ19而同时糖化和发酵（SSF)成D-乳酸使用凝结芽孢杆菌作为产生乳酸的微生物催化剂的其中一个优点就是由于符合优化的商业纤维素活性（50°C及pH值5.0)的较高的操作温度以及较低的pH值，以减少装载于纤维素的SSF至乳酸的纤维素酵素（14,15)。以约7.5FPU(g纤维素Γ1的结晶纤维素作为原料的菌株QZ19达到最高的D-乳酸的体积生产率（图3)。利用该酵素的装载，典型乳酸细菌的乳酸球菌（Lactococcuslactis)在40°C下的产量仅为菌株QZ19的1/3。这个结果符合先前关于为通过比较于其他乳酸细菌未改变的凝结芽孢杆菌而进行优化L-乳酸的生产而减少纤维素需求的研究（21)。菌株QZ19更佳地适合用于纤维素成D-乳酸的SSF并且对於具成本效益的这种非食品碳水化合物的代谢需要显著较低程度的纤维素。[0071]在菌株QZ19中作为D型（_)LDH活性的来源的甘油脱氢酶的辨识菌株QZ19的无细胞萃取在野生型凝结芽孢杆菌未具侦测到D-LDH活性时具有D型（-)乳酸脱氢酶活性（每毫克蛋白质〇.2单位）（表2)。比较于菌株QZ5在菌株QZ19中所观察到的D-LDH的活性以30倍增加，无关于被确定为编码D-LDH的ldhA基因的mRNA以1.3倍增加。为了确定可能掌控异常高的D-乳酸脱氢酶活性的D-LDH蛋白质中的潜在变体，自菌株P4-102B及QZ19将ldhA和两侧DNA进行比对。然而，序列皆相同表示出编码D-LDH的ldhA与D型（-)乳酸生成在菌株QZ19中的大量增加无关。仅ldhA的单体复制也在菌株QZ19和P4-102B的染色体中被发现，消除基因复制成用于D型（-)乳酸生产的潜在基础。该结论被进一步地通过比较菌株QZ19的ldhAmRNA程度以及其前代亲代，菌株QZ5而被支持（表2)。在这些菌株中比较于野生型的较高程度的ldhAmRNA可导致由菌株QZ5和其他发展的菌株生产的少量D型（-)乳酸，但无法解释在菌株QZ19观察到的高D乳酸滴度及产量。在亲代的第一发酵途径，在菌株QZ19中最高程度的ldhAmRNA(D-LDH)仅为约10%的编码L型（+)-LDH的ldhAmRNA的程度（图1;表2)。这些结果建议具D-LDH活性的另一个酵素存在于菌株QZ19中促成高D-乳酸滴度。[0072]从菌株QZ13到QZ19的无细胞萃取（明显分子质量为37KDa)含有不存在于野生型菌株P4-102B中以及前代菌株QZ5中的丰富蛋白质（图4)。在这些菌株的萃取中的这些蛋白质被计算有代表全部蛋白质的11%。具有D-LDH活性的蛋白质从菌株QZ19被纯化。该被纯化的蛋白质的大小，37KDa，是可比较于演化菌株中发现的新丰富蛋白质。在具有D-LDH活性的蛋白质的胰蛋白酶消化之后，通过LC-MS/MS隔离片段并确认。产生的22个肽中，9个相同于从凝结芽孢杆菌菌株36D1基因组（Bcoa_1919;登录号AEP01106.1)中的蛋白质预测的胰蛋白酶肽，通过比较序列分析（26)而确认为甘油脱氢酶（gldA)(图11)。根据凝结芽孢杆菌菌株36D1的gldA基因序列，菌株P4-102B及QZ19的gldA基因被增幅、复制并测序。比较于原生基因，来自菌株QZ19的gldA基因具有两处变异：G361A及T734C。这些二个变异导致胺基酸的改变，D121N及F245S及等位基因被指定为gldAlOl且蛋白质为甘油脱氢酶（GlyDH*)(图12)。除了在编码区中的这些二个变体之外，1821bp的DNA片段被发现为插入QZ19中gldA基因的上行-62(在ATG中作为+1的"A"）（图5)。二个ORFs被确认在该插入件中（长度中的103及232胺基酸），皆相似于来自瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus)菌株H10(25%相同及48%相似）的假定转座子（ISLhel5)(27)。[0073]从菌株QZ19在SDS-PAGE凝胶中对应于37KDa蛋白质的纯化蛋白质同时具有氧化甘油及还原丙酮酸的活性。GDH活性（甘油氧化成二羟基丙酮）为每毫克蛋白质1.2单元(ymolemirT1)且丙酮酸还原成D-乳酸活性为每毫克蛋白质0.8单元。从大肠杆菌重组体纯化的原生酵素具有每毫克蛋白质7.1单元的甘油脱氢酶活性及0.01单元的LDH活性。这些结果建议在凝结芽孢杆菌基因组中的甘油脱氢酶在菌株QZ19进行代谢进化的期间通过二个变异获得D-LDH活性。该蛋白质的表达的高程度显然是由于上行转座子的插入所致。[0074]来自菌株QZ19的甘油脱氢酶（GlyDH*)在大肠杆菌中产生D-LDH活性为了确认在菌株QZ19中编码D-LDH活性的gldAlOl等位基因，基因从菌株QZ19被复制（质粒PQZ115)且引入大肠杆菌菌株AH242。由于在糖酵解期间消除了氧化所产生的NADH的能力的ldhA及pflB中的变异，大肠杆菌菌株AH242是负厌氧的（anaerobicminus)(25)。菌株AH242的厌氧成长通过具D型（-)乳酸的质粒pQZ115作为发酵产物而恢复。携带缺少C-末端10胺基酸的甘油脱氢酶（GlyDH*)的质粒pQZ109的菌株AH242不进行厌氧生长，表示该蛋白质的截短缺少形式缺少D-LDH活性。该结果建立从凝结芽孢杆菌菌株QZ19的甘油脱氢酶（GlyDH*)具有D型（-)-LDH活性。[0075]为了进一步确认从菌株QZ19的gldAlOl编码具D-LDH活性的蛋白质，基因从菌株QZ19(质粒pQZl13)进行复制并为蛋白质的纯化而以N-末端His-标记而于重组大肠杆菌表达。重组甘油脱氢酶（GlyDH*)也具有甘油脱氢酶及D-LDH活性。具甘油及NAD+的酵素的特定活性为每毫克蛋白质〇.68单元。利用丙酮酸及NADH作为底物（LDH反应），蛋白质的特殊活性为非预期的高的每毫克蛋白质6.9单元且反应产物通过HPLC被确认为D-乳酸。在逆反应中，酵素仅在D型（-)乳酸及NAD+作为底物时呈活性（每毫克蛋白质0.17单元的特殊活性）。具L型（+)乳酸活性作为底物为不可侦测的。[0076]这些结果显示在菌株QZ5的代谢进化期间，原生甘油脱氢酶获得D-LDH活性。来自嗜热脂肪芽孢的原生甘油脱氢酶据称缺少LDH活性（28)，且与其相符，从重组大肠杆菌纯化的凝结芽孢杆菌原生甘油脱氢酶的LDH活性低于甘油脱氢酶活性的0.15%。[0077]通过DNA插入于D-乳酸产生菌株而提升gldA转录除了酶为D-LDH的进化外，gldAlOl在菌株QZ19中的表达程度在这项研究所分析的基因中是最高的（表2)。在转录中的提升显然是由于为促进gldAlOl表达将1821bp的DNA插入于于演进菌株的强启动子的gldAlOl基因的上行（图5)。[0078]虽然对应于沙恩-达尔加诺（GGAG)及-10区域（TATGAT)的共识序列可在野生型的gldA基因的上行DNA进行确认，却无法辨别对应的-35区域。以6个碱基对茎和11个碱基环的反向重复在投射-35区域被发现，表示该基因的表达仅为中等的，最多在原生菌中，插入于菌株QZ19中的gldA基因的上行区域1821bp序列引入共识-35序列到gldA(图5)。gldA基因和⑶H*蛋白质在菌株QZ19(表2)的高程度表达显然是由于该菌株QZ13中gldA上行区域的重建及其衍生物产生强启动子。[0079]乳酸产物于菌株QZ19的进化途径显然有三个开创性的事件发生于凝结芽孢杆菌菌株QZ5到菌株QZ19的进化途径中，在约48小时以内产生超过90克的D-乳酸；在甘油脱氢酶中的二处变异（D121N及F245S)以及在gldAlOl的启动子结构中通过插入而致使改变。在进化途径中的各种中间产物菌株的DNA序列分析显示转座子DNA的插入首先发生于菌株QZ13中。该符合菌株QZ13中的gldAmRNA及甘油脱氢酶的提昇程度（分别为约100倍及50倍的菌株QZ5的程度）以及其他这种菌株的衍生物（表2)。在菌株QZ13中的较高的甘油脱氢酶活性也导致了D-LDH活性的轻微增加。然而，在该菌株中D-LDH到甘油脱氢酶活性的比率仅为0.003,表示甘油脱氢酶仍缺少重要的D-LDH活性。第一甘油脱氢酶变体（F245S)在提升gldA的转录后在菌株QZ15中被侦测到，且该变体显然提升了约7倍的D-LDH/甘油脱氢酶的比率而到0.02(表2)。第二变体（D121N)发生在从菌株QZ15进化的菌株QZ19期间，且该第二变体提升了约10倍的D-LDH/甘油脱氢酶的比率而增加到0.22。值得注意的是，由于D-LDH活性的增加，酵素失去其部分的甘油脱氢酶活性。在菌株QZ19中由于二个变体（QZ19对QZ14)增加10倍的酵素的D-LDH活性而从菌株QZ14减少了约7倍的甘油脱氢酶活性（表2)。在菌株QZ19的萃取物中甘油脱氢酶活性中的这些损失显然不是由于在细胞中较低的蛋白质程度，因为该蛋白质带仍然大约占了整体蛋白质的11%(图4)。[0080]在菌株QZ19的甘油脱氢酶中的变体发生在九个形成深口袋的关键胺基酸中的二个，其中从嗜热脂肪芽孢杆菌（B.stearothermophilus)与酵素中的NAD+的烟酰胺环的结合（29)。凝结芽孢杆菌的甘油脱氢酶的模型也显示了在具突变胺基酸于边缘中的酵素二域之间的深裂（图13)。甘油C1及C3被报告为通过凡得瓦力交互作用于Phe247的苄基环而稳定于嗜热脂肪芽孢杆菌甘油脱氢酶中。预计消除该作用而改变对应的凝结芽孢杆菌甘油脱氢酶的Phe245为丝氨酸导致了所观察到的从菌株QZ19的酵素的甘油氧化活性的减少。Asnl21及Ser245可能通过与丙酮酸的C1与C2(图13)的作用而使丙铜酸稳定于活性位点，导致了观察到的LDH活性。[0081]这些结果显示了甘油脱氢酶通过二个变体的gldA的表达程度及D-LDH活性的获得的增加有关于在凝结芽孢杆菌菌株QZ19发酵作用的D-乳酸滴度的增加（表1)。[0082]原生物的生物化学性质及从凝结芽孢杆菌变体的甘油脱氢酶的各种变体形式在产生凝结芽孢杆菌衍生物（菌株QZ19)的D-乳酸的发展过程期间，具有二变体(D121N及F245S)的甘油脱氢酶（GDH)发展成催化还原丙酮酸为D-乳酸（表1和图7)。产生显著D-乳酸滴度的第一衍生物，菌株QZ15,搭载在位置245改变胺基酸苯丙氨酸成为丝氨酸的单体变体。当菌株QZ15被进一步选择用于较高的乳酸生产率时，GDH蛋白质获得在胺基酸位置121(D121N)的第二变体（图15)。这二个变体的结合导致了菌株QZ19在pH值5.0及50°C的pH值控制的发酵作用中于48小时内以接近100g/L的滴度而产生D-乳酸。为了评估这二个变体各别在丙酮酸还原成D-乳酸的催化反应中所扮演的角色，具有二个取代基（D121N或F245S)的GDH/LDH酵素及具有双重改变的蛋白质在大肠杆菌纯化中表达，并决定其生物化学性质。[0083]原生⑶Η在约22.5单元（μmolemirT1.mg蛋白质的特定活性在55°C使甘油氧化（表5)。该酵素的特定活性从室温的约8.6单位增加到用于活性的55°C的最佳温度的约22.5单位，那也是用于凝结芽孢杆菌的优化生长温度。原生酵素的GDH活性在约20mM甘油中呈饱和，符合用于该酵素的11.7mM甘油的表现Km(图16;表6)。[0084]该原生酵素也将多个其他底物进行氧化（表5)。虽然具有乙烷-1，2-二醇和丙烷-1，2-二醇的活性的程度是显然低于具有甘油的活性，具有2,3-丁二醇的特殊活性几乎是2倍高于甘油氧化的速率。1，2-丁二醇和1，3-丁二醇同时作为用于原生酵素的底物。这些结果显示从凝结芽孢杆菌的GDH酵素具有较广的底物特异性。虽然该酵素表现丙酮酸还原活性（D-LDH)，该活性仍小于甘油氧化活性（LDH到⑶Η活性的比率0.013)的1.5%。除了减少丙酮酸以外，该酵素也具有非常少但可侦测的2-氧代丁酸还原（到2-羟基丁酸）活性的程度。该酵素的低丙酮酸还原活性可以归因于非常高的于丙酮酸的表观Km(lM;约高于用于甘油的100倍）（表6)。原生酵素在以NAD+作为电子接收子于氧化甘油的效率上约为使用NADH还原丙酮酸的1000倍。[0085]凝结芽孢杆菌菌株QZ15、菌株QZ5的衍生物、在55°C发酵葡萄糖并约在72小时内产生约80g/L的D-乳酸。在该菌株中GDH进行胺基酸的改变，苯丙氨酸到丝氨酸，在位置245(图7)。该改变显著的改变了LDH到GDH的比率，从GDH活性中具有最小还原力用于原生酵素的〇.01为〇.16(表5;图15)。除了获得显著丙酮酸还原活性（LDH)外（图16)，该酵素的F245S形式比较于原生酵素也具有1，2-丙二醇和1，2-丁二醇作为底物的较高活性(表5)。在F245S酵素的GDH及LDH活性的这些变异可归因于用于甘油的表观Km的增加(78.6mM比较于为原生酵素的值11.7)以及为丙酮酸的表观Km中的还原（0.23M对用于原生酵素的1.0M)(表6)。[0086]根据选取凝结芽孢杆菌菌株QZ15的进一步生长及发酵导致菌株QZ19在pH值5.0及55°C下约48小时内产生接近100g/L的D-乳酸。从该菌株的⑶Η酵素携有第二变动，除了F245S的D121N。具有该改变的GDH单独显著具有以甘油及其他测试二醇的较低活性(表5)。用于甘油的表观Km的轻微增加无法解释大约为7倍的特定活性的还原（表6)。虽然D121N变体减少甘油氧化活性，相较于原生酵素，该改变于在酵素的丙酮酸还原活性上（D-LDH)不具有可侦测的效果。[0087]D121N变体在甘油的氧化及其他二醇上的负面效果会残留，即使是在该变体从酵素被引入于F245S中。具有二改变（F245S及D121N)的酵素具有相较于原生酵素0.01的值约1.8的LDH/⑶Η活性比率（表5)。D121N的变体也减少用于丙酮酸的表观Km，从单具F245S的变体对酵素的231mM到具二改变的对酵素的51mM(表6)，更高催化效率的首要原因可能是具丙酮酸作为底物。这些结果显示这二种改变对于酵素作用于为发展生产D-LDH的菌株QZ19中的D-LDH中皆是很重要的。F245S变体在D121N变体大幅减少蛋白质的⑶Η活性时，增加酵素的D-LDH活性而进一步增强D-LDH活性。[0088]根据从嗜热脂肪土芽孢杆菌属（Geobacillusstearothermophilus)(29)⑶Η的结晶结构，和凝结芽孢杆菌GDH胺基酸序列有47%相符，天冬氨酸在位置121处形成氢键与氧在甘油的C2位置上。在甘油的C2位置的该第二乙醇（H-C-0H)是在甘油进行氧化成二羟基丙酮时被氧化成C=0。该天冬氨酸改变为天冬酰胺显然最小化与底物甘油的交互作用。另外，当C2-0与D121反应时，在245的苯丙氨酸被期望与甘油的C1及C3反应。以丝氨酸取代苯丙氨酸可最小化酵素与底物甘油的交互作用，且可导致在酵素的这些修改形式中观察到较高的表观Km。然而，这些观察无法预测到F245S单体或与D121N将支持⑶Η酵素与作为底物的丙酮酸的交互作用且修改的酵素将作为D-LDH。[0089]这些结果推测原生酵素的确是具广底物特异性的多元醇脱氢酶。具各种耦合其嗜热特性（优化55°C)的短链二醇的F245S酵素的较高活性使这些酵素有助于各种二醇及多元醇的生物转化作用以对应具立体选择性的酮类。举例而言，1，3-丁二醇可被氧化成4-羟基-2-丁酮，为化学产业近期生产的具潜在商业利益的药物中间产物。[0090]表1在50°C下的凝结芽孢杆菌衍生物到D型（-)乳酸产物的路径上的发酵作用概况。【权利要求】1.一种隔离的多肽，其特征在于，所述的多肽包含甘油脱氢酶的序列，其中苯丙氨酸被选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸或天冬酰胺的胺基酸所取代，和/或天冬氨酸被选自谷氨酰胺或天冬酰胺的胺基酸所取代，其中所述苯丙氨酸对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸，且所述天冬氨酸对应于序列号第3号的位置121。2.如权利要求1所述的隔离的多肽，其特征在于，所述的多肽包含序列号第1号。3.如权利要求1所述的隔离的多肽，其特征在于，所述的多肽包含甘油脱氢酶的序列，其中苯丙氨酸被选自丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸或天冬酰胺的胺基酸所取代，其中所述苯丙氨酸对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸。4.如权利要求1所述的隔离的多肽，其特征在于，所述的多肽包含甘油脱氢酶的序列，其中天冬氨酸被选自谷氨酰胺或天冬酰胺的胺基酸所取代，其中所述天冬氨酸对应序列号第3号的位置121。5.如权利要求1所述的隔离的多肽，其特征在于，所述多肽包含甘油脱氢酶的序列，其中：对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被丝氨酸所取代，并且对应于序列号第3号的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被谷氨酰胺所取代；对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被苏氨酸所取代，并且对应于序列号第3号的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被谷氨酰胺所取代；对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被苏氨酸所取代，并且对应于序列号第3号的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被天冬酰胺所取代；对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被甘氨酸所取代，并且对应于序列号第3号的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被谷氨酰胺所取代；对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被甘氨酸所取代，并且对应于序列号第3号的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被天冬酰胺所取代；对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被天冬酰胺所取代，并且对应于序列号第3号的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被谷氨酰胺所取代；对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被天冬酰胺所取代，并且对应于序列号第3号的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被天冬酰胺所取代；所述多肽中仅有对应于序列号第3号的位置245上的苯丙氨酸的苯丙氨酸被选自于丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸或天冬酰胺的胺基酸所取代；或所述多肽中仅有对应序列号第3号的位置121上的天冬氨酸的天冬氨酸被选自于谷氨酰胺或天冬酰胺的胺基酸所取代。6.-种组成物，其特征在于，所述的组成物包含携带体及如权利要求1-5任一项所述的多肽。7.-种隔离的核酸，其特征在于，所述的核酸包含编码如权利要求1-5任一项所述的多肽的多核苷酸。8.-种载体或基因架构，其特征在于，所述的载体或基因架构包含如权利要求7所述的多核苷酸。9.一种隔离的微生物细胞，其特征在于，所述的微生物细胞以如权利要求7所述的核酸进行转形。10.如权利要求9所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞包含含有如权利要求7所述的多核苷酸的载体或基因架构。11.如权利要求9至10所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞是革兰氏阴性细菌细胞或革兰氏阳性细菌细胞。12.如权利要求11所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述革兰氏阴性细菌细胞是选自由埃希氏菌属、发酵单胞菌属、不动杆菌属、葡萄糖酸杆菌属、地杆菌属、希瓦氏菌属、沙门氏菌属、肠杆菌属或克雷伯氏菌属的细菌细胞，并且所述革兰氏阳性细菌是选自芽孢杆菌属、梭菌属、棒杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、酒球菌属、链球菌属及真细菌细胞属的细菌细胞。13.如权利要求9至10所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞是大肠埃希氏菌或产酸克雷伯菌。14.如权利要求9至10所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞选自嗜热厌氧菌属、芽孢杆菌属、类芽孢杆菌属或土芽孢杆菌属。15.如权利要求9至10所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞是选自念珠菌属、汉逊酵母、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或耶氏酵母属细胞的酵母细胞。16.如权利要求15所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述的酵母细胞是乳酸克鲁维酵母/aciis)、卡尔酵母酿酒酵母cereFisiae)、糖化酵母斯酵母)、克鲁维酵母^/w_7F6?ri)、诺地酵母卵形酵母〇Fi/b_r?i5·)或脂耶氏酵母{Yarrowialipolytica)。17.如权利要求9至10所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞是选自支顶头抱菌C^cr6?o/?i--)、曲霉菌、短梗霉菌、烟管菌属（5j'6?r^a/7〇fera)、拟錯菌属（Cferi^orio^is)、金抱子菌属（CXrj^c^oria?)、鬼伞属（Cb/Tri/ws)、革盖菌属（Cbrio7w5·)、隐球菌、线黑粉酵母属(filibasidium)、齋J}麗（fusariuni)、腐质霉鳳Ο?ιπ?αο?Μ')、麗H病麗（Magnaporthe')、毛霉菌属（M/cor)、毁丝霉菌、新考玛脂霉菌（AfeocaBiffiasiijr)、脉抱霉菌（Afeamspora)、拟青霉菌、青霉菌属、平革菌属、射脉菌属（/%/ev^ia)、瘤胃壶菌属〇°2>〇?/^(95·)、蛇燕属（/VewoiiAs)、裂裙菌属篮状菌属嗜热子囊菌属（?6?τ?ο<35·--?5·)、梭孢壳菌属（?ie/an'a)、弯颈霉属（7b/_7/7〇c/at/iw?)、栓孔菌属（7>a?e?es)或木霉细胞(7>icAoofe/macell)的真菌细胞。18.如权利要求17所述的隔离的微生物细胞，其特征在于，所述真菌细胞是泡盛曲霉（Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉（Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉（Aspergillusnidulans)、黑曲霉（Aspergillusniger)、米曲菌（Aspergillusoryzae)、黑刺烟管菌（（Bjerkanderaadusta)、干拟錯菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡盖尔拟錯菌(Ceriporiopsiscaregiea)、浅黄拟錯菌（Ceriporiopsisgilvescens)、培宁辛达拟錯菌（Ceriporiopsispannocinta)、环带拟錯菌（Ceriporiopsisrivulosa)、浅红拟錯菌（Ceriporiopsissubrufa)、虫拟錯菌（Ceriporiopsissubvermispora)、贫乏金抱子霉（Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌属（Chrysosporiumkeratinophilum)、劳肯诺温斯金孢子菌属(Chrysosporiumlucknowense)、章金抱子菌属（Chrysosporiummerdarium)、毯金抱子菌属（Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金抱子菌属（Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌属（Chrysosporiumtropicum)、佐乃特金孢子菌属（Chrysosporiumzonatum)、灰盖鬼伞（Coprinuscinereus)、毛革盖菌（Coriolushirsutus)、杆抱状嫌抱(Fusariumbactridioides)、禾谷嫌刀菌（Fusariumcerealis)、克地嫌刀菌（Fusariumcrookwellense)、大刀嫌刀菌（Fusariumculmorum)、小麦赤霉病禾谷嫌刀菌属（Fusariumgraminearum)、禾嫌抱菌（Fusariumgraminum)、异抱嫌抱菌（Fusariumheterosporum)、合欢木德抱（Fusariumnegundi)、尖抱嫌刀菌（Fusariumoxysporum)、网嫌抱菌（Fusariumreticulatum)、粉红嫌刀菌（Fusariumroseum)、接骨木嫌刀菌（Fusariumsambucinum)、肤色嫌抱菌（Fusariumsarcochroum)、拟枝抱嫌抱菌（Fusariumsporotrichioides)、硫色镰刀菌（Fusariumsulphureum)、族囊镰孢菌（Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰刀菌(Fusariumtrichothecioides)、嫌抱霉（Fusariumvenenatum)、特异腐质霉属（Humicolainsolens)、柔毛腐质霉属（Humicolalanuginosa)、米赫根毛霉（Mucormiehei)、嗜热毁丝霉（Myceliophthorathermophila)、粗糖脉抱霉（Neurosporacrassa)、产紫青霉(PeniciIliumpurpurogenum)、黄抱平革霉（Phanerochaetechrysosporium)、福身寸身寸脉菌（Phlebiaradiata)、杏鲍燕（Pleurotuseryngii)、太瑞斯梭抱壳霉（Thielaviaterrestris)、长绒毛栓菌（Trametesvillosa)、云芝（Trametesversicolor)、对木霉菌（Trichodermaharzianum)、纤维素分解菌（Trichodermakoningii)、对长梗木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉（Trichodermareesei)、或绿色木霉菌细胞(Trichodermaviridecell)。19.一种制造D-乳酸的方法，其特征在于，所述的方法包含在允许生产乳酸的条件下于培养基介质中培养如权利要求9-18任一项所述的转形的微生物细胞。20.-种组成物，其特征在于，所述的组成物包含培养基介质及如权利要求9-18任一项所述的转形的微生物细胞。21.如权利要求6或20所述的组成物，其特征在于，所述携带体或培养基介质组成物包含从生物质、半纤维素生物质，木质纤维素生物质或纤维素类生物质所派生的水解物。22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述培养基介质包含从生物质、半纤维素生物质，木质纤维素生物质或纤维素类生物质所派生的水解物。23.-种隔离的核酸，其特征在于，所述的核酸包含序列号第56号或tcgagaaaaacttgacacatacCAAAAATAAGTTATGATGGMITGTGCTTGTTATAITTITCAC(序列号第56号的核苷酸84-148)。24.-种隔离的核酸，其特征在于，所述的核酸包含序列号第56号或tcgagaaaaacttgacacatacCAAAAATAAGTTATGATGGAAITGTGCTTGTTATAITTITCAC(序列号第56号的核苷酸84-148)可操作地连接到异源多核苷酸序列。25.-种载体或隔离的宿主细胞，其特征在于，所述的载体或隔离的宿主细胞包含如权利要求23或权利要求24所述的核酸。26.-种组成物，其特征在于，所述的组成物包含二醇和/或多醇以及如权利要求1-5任一项所述的多肽。27.如权利要求26所述的组成物，其特征在于，所述二醇是1，3-丁二醇。28.-种制造4-羟基-2-丁酮的方法，其特征在于，所述的方法包含以如权利要求1-5任一项所述的多肽在导致1，3-丁二醇氧化成4-羟基-2-丁酮的条件下接触1，3-丁二醇。【文档编号】C12P7/02GK104204197SQ201280059613【公开日】2014年12月10日申请日期:2012年10月4日优先权日:2011年10月4日【发明者】王庆昭,基尔纳升·T.尚穆根,朗尼欧尼尔·英格拉姆申请人:美国佛罗里达大学研究基金会公司