专利名称：日本血吸虫l-乳酸脱氢酶基因、其编码蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种日本血吸虫蛋白，特别是涉及一种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶基 因、其编码蛋白及应用。
背景技术：
血吸虫病由血吸虫的感染引起，在世界上有76个国家，受感染者约1.5亿。致病 的血吸虫有3种，既日本血吸虫(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸虫(S. mansoni)和埃 及血吸虫(S. haematobium)。在我国流行的是日本血吸虫。血吸虫病的流行给人民身体健 康和经济发展都造成巨大的损失，因此，防治血吸虫病、开发研制血吸虫临床诊断试剂和抗 血吸虫的药物具有巨大的社会和经济效益。日本血吸虫作为寄生虫能在人体和动物体内存在很多年而不被宿主的免疫机制 杀死，与它的免疫逃避能力有关。其免疫逃避机制有抗原模拟、抗原伪装和免疫调节。其中 免疫调节指的是血吸虫的蛋白能够调节、干扰(主要是抑制)宿主的免疫系统，使其不能发 挥正常的免疫攻击效能，从而有利于血吸虫的生存。血吸虫的排泄/分泌抗原(Excretory/Secretory protein, ESP)就是一类可以 发挥免疫调节作用的蛋白质。这些蛋白来自血吸虫的表皮和肠道上皮，或者是特化的排泄 /分泌器官。血吸虫各个虫期都产生这类蛋白。ESP是潜在药物靶点和疫苗分子，因为抑制 这些蛋白可以干扰血吸虫的免疫逃避机制从而增强宿主的免疫杀灭功能；ESP是潜在的诊 断分子，因为这些蛋白游离于宿主的血液中，可以很方便地用现有手段检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶基因、其编码蛋 白及应用，该蛋白能成为很好的诊断标记分子。为解决上述技术问题，本发明的日本血吸虫L-乳酸脱氢酶的基因，包括具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。所述的SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID N0. 2所示序列的蛋白。本发明的日本血吸虫L-乳酸脱氢酶，包括具有SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的 置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，该蛋白是具有SEQ ID NO. 1序列编码的蛋白。利用蛋白质组学手段，通过直接分析感染动物(兔子)的血液，发现日本血吸虫的 L-乳酸脱氢酶蛋白(L-lactate dehydrogenase, LDH, Accession number :AY814177. 1)在 宿主血液中也存在，是其ESP的成分之一，表明该蛋白可能在血吸虫的免疫调节、免疫逃避 方面发挥重要作用；这也使它成为很好的诊断标记分子。这是国际上首次发现L-乳酸脱氢 酶出现在日本血吸虫的ESP中。本发明的日本血吸虫L-乳酸脱氢酶作为免疫原，在制备血吸虫疫苗方面的应用；作为潜在的药物作用靶点，在筛选化学和其他种类药物方面的应用；作为特异性血吸虫抗 原，在制备抗血吸虫抗体方面的应用；在血清学诊断方面的应用；日本血吸虫L-乳酸脱氢 酶的编码基因，在基因治疗方面的应用。
具体实施例方式一、方法1、感染动物，制备感染血清在血吸虫流行区中收集自然感染的阳性湖北钉螺(Oncomelania hupensis hupensis)，将钉螺浸入水中，加以光照，收集浮在水面上的尾蚴。新西兰大白兔剃去腹部的 毛，露出皮肤；取日本血吸虫1000条尾蚴，经裸露的兔子皮肤感染兔子。收集感染后第42 天的动物血液，制备血清。2、感染动物血清蛋白的提取用6倍体积的冷丙酮加入到血清中，沉淀血清中的蛋白，离心收集蛋白沉淀 (5000rpm, 5 分钟)，溶解沉淀用 50mM Tris-HCl (pH 8. 3), 5mM EDTA, ImM phenylmethyl sulfonylfluoride (PMSF), 0. 5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0. 5mM二硫苏糖醇(DTT)，
0.5% SDS，利用超声波促进蛋白溶解。3、血清蛋白的酶解过程血清蛋白混合物加入终浓度IOmM DTT,室温反应30分钟，再加入终浓度55mM的碘 乙酰氨置暗处反应15分钟，用去离子水稀释5-10倍，按1 50的体积比例加入修饰的测 序级牛胰酶，37°C酶解过夜。4、血清蛋白酶解肽段混合物用强阳离子交换柱(Strong Cation Exchange, SCX) 进行分级SCX柱的平衡和清洁SCX柱在每次使用前，先用高盐溶液(500mM/25% ACN, pH 3.0)过柱，然后用(H20/25% ACN，pH 3.0)平衡。清洗柱则用高盐溶液。酶解后的肽段样品用SCX平衡溶液(水，30%乙腈pH3.0)稀释，预先配制好不同 浓度的NH4HCO3盐溶液(IOmM 500mM)，用注射器将样品推过SCX色谱柱4. OmmX 150mm P0R0S 50HS column (Sciex-Applied Biosystems)，再依次用配好的盐溶液，按照浓度从 低到高的顺序，洗脱SCX柱上结合的肽段，分别收集各个洗脱的组分，用真空浓缩仪将溶液 体积抽减20-30 μ 1左右。5、质谱鉴定每个组分的肽混合物上样到一个反相捕获柱(C18，5 μ m, 300 A, 300 μ m
i.dX5mm, LC Packings)，在20 μ 1/min的流速下脱盐。然后这个捕获柱和一个分析用的 75 μ mX 150mm C18柱(LC Packings)相连接，肽混合物就在200nl/min的流速下，从这个柱 子上洗脱进入装有Protana NanoES的电喷雾离子源的QSTAR pulseri中。Agilent 1100 毛细液相系统(Agilent Technologies)用来提供流动相A(0. 5 %乙酸/水)和流动相 B(0. 5%乙酸/乙腈)，线性梯度是60分钟内5% B到50% B, 30分钟内50% B到90% B， 然后是在90% B停留15分钟。在分析柱后通过一个不锈钢的两通(Valco Instrument)连 接一个10 μ m直径的PicoTip纳喷雾头(New 0b jective)，加上2500-3000伏的喷雾电压， 以获得稳定的喷雾。
MS/MS串联质谱谱图通过信息依赖的采集(IDA)和任务-循环增强来记录。在每 个测定扫描中，选取3-6个信号最强、带2到3个电荷的离子，用滚动碰撞能量打碎，以获 得串联质谱的信息。喷雾电压=3000, DP = 50，FP = 220，MS扫描范围为m/z 450-1400， MSMS扫描范围为m/z 50-1800，GSl = 20，帘气为10，所用离子源为Protana NanoES电喷 雾离子源。6、质谱数据的生物信息学处理及日本血吸虫排泌蛋白的鉴定质谱搜索用的数据库，包括从11717个从公共数据库NCBI下载的日本血吸虫蛋白 质序列(时间是 2008 年 10 月 16 日)。搜索软件是 MASCOT (http://www. matrixscience. com/, Matrix Science)。搜索参数为最大漏切点，3个；monoisotopic ；肽电荷数， +1/+2/+3 ；修饰，半胱氨酸carbamoylmethylation和methionine氧化。搜索结果合并后， 用下列标准进行过滤筛选1)对每一个串联质谱谱图的搜索结果列表，只提取排位在第一个的结果，其他的 则丢弃；2)搜索得到的肽段中如果有KR，KK, RK, RR等序列，则这个肽段丢弃；3)搜索得到的肽段，长度在8个氨基酸以上的保留，小于8个氨基酸的丢弃；4)重复打到的肽段，只计算其中分值最高的，把这些肽段分值加起来，做为蛋白的 得分；5)蛋白的得分超过60，就认为是可信的结果。低分的蛋白，手工检查后保留或者 丢弃。匹配到宿主或者牛胰酶、角蛋白的肽段，则丢弃。同时进行反向蛋白质序列数据库的搜索。反向蛋白库是将日本血吸虫蛋白质序列 反转，保持长度、组成不变。根据正向库和反向库搜索得到的结果，确定假阳性率。计算方 法假阳性=2*(反向库肽段数)/(正向库肽段数+反向库肽段数)。假阳性控制在0%。二、结果1)从被感染的动物血清中直接鉴定日本血吸虫的排泌蛋白在国际上首次从被感染的动物血清中直接鉴定日本血吸虫的排泌蛋白。鉴定到日 本血吸虫L-乳酸脱氢酶的2个肽段(表1)，证明了日本血吸虫的L-乳酸脱氢酶的确存在 于宿主动物的血清中，可以被检测到，因而可以成为血吸虫临床诊断的靶标分子。表1日本血吸虫L-乳酸脱氢酶在被感染的动物血清中被发现和鉴定
登录号 Accession number名称 L-乳酸脱氢酶肽段得分 Peptide score (Mascot)肽段数 Peptide count肽段序列 PeptidegiI 56755459|gbIAAW25909. l|L-Iactate dehydrogenase56.92YSENSDIVVITAGARgi156755459|gbIAAW25909. l|L-Iactate dehydrogenase72. 37 .2YSENSDIVVITAGAR
5
2)日本血吸虫L-乳酸脱氢酶的序列保守性鉴定到的日本血吸虫L-乳酸脱氢酶的肽段，都经过与宿主动物即兔子的序列的 比较，发现这些肽段都是血吸虫特异的、不同于宿主。3)日本血吸虫L-乳酸脱氢酶的功能L-乳酸脱氢酶能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶。本实施例中的结果表明日本血吸 虫的L-乳酸脱氢酶可以分泌到宿主的血液中，和宿主的免疫系统直接接触，推测可能发挥 重要的免疫调节作用。因此，可以通过在感染动物或人体血液中检测血吸虫L-乳酸脱氢酶 的存在，从而判断是否感染血吸虫，或者判断药物治疗后的驱虫效果。序列表<110>上海人类基因组研究中心<120>日本血吸虫L-乳酸脱氢酶基因、其编码蛋白及应用<130>NP-09-13228<160>2<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>1418<212>RNA<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)<400>1attggttagagactgattattctgaatagaggattttgatccgtatttcgaaaaattggt60
gattcattgctatcagacgcggaagcctattaagagtaaacttttcctgttccgttcata120
gccacttgaaacttaaatcctgctcacaatcgcattatcatctgtgtcgcttgtttgcat180
taataatgccgtcatcttgtaatatgcttatgaaaccagtagctccacaggatactgaac240
cccaatatcgtagcaaagtgactatcattggtgtaggagcagttggaatggcggcagcgt300
tctcaacgatgcaaatagctggagagattgcactaatcgatgtagtggcagataaaatta360
aaggtgaagttctagatcttcaacatggacagcagtttttgaaaaaatgcaaagttgacg420
gaggtactgattacaaatattcggaaaactcagatatcgttgtcatcaccgctggtgcgc480
gacaaaatgaaggagagtcacgattgaacctagtacaacgtaatgtcgatatattcaagc540
atataatcccaaacgttgttaagtacagtccaaactgtatcatagtcgtcgtatcaaatc600
ctgttgatattttgacatatgtggctcgaaaactgagtgggtttccagctcacagagtaa660
taggaacaggaacgatgctcgactctgcaagatttcgctttcttcttggtgagaagttgg720
gagtgtctgccaattcagttcatggatatgtaatcggtgaacatggtgattccagtgttc780
cagtttggagtaatgtcaatgttgctggggttcggttggcttcaatgaatccaaagatag840
gatgtaaggatgatcctgaaaactttgaagagatacacaagcaagttgttcaaagtgctt900
atgacataattcgtcttaaaggatatacttcatgggcgatcgggttaacttgtcaatcac960
tttgtaactcaattctgaataatcttcatacggtttatccactttctgtttccgttaaag1020
gactttatggaattgaagaa gacgtttatcttagtttaccgtgtcttgtt acttcagctg1080
gaattagccatgtgattcctcaagaactta gtcaagaaga gctggttagg ttgagaaaaa1140
gtgctgcgactattcatgga gtgataaatg gaattaagtg gtaacataga acacaacgac1200
attttgccaactcacagacagtatagtttg tcttcactaatgtttacccataattttttt1260
gtttttcatcgtgaatttcatatgatataa gactaaccaa￡Ι ￡1￡1￡1￡Ι 0ataattcatg1320
tttattaacattgaaaaatgaatgtttatc tctagaattacaaataaagttttagagcca1380
0￡Ι ￡Ι ￡1￡1￡1SLSLSLSLSLSLSLCSLSL1418
<210>2
<211>332
<212>PRT
<213> 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)
<400>2
MPSSCNMLMKPVAPQDTEPQYRSKVTIIGV GAVGMAMFSTMQIAGEIALIDVVADKIKG60
EVLDLQHGQQFLKKCKVDGGTDYKYSENSD IVVITAGARQNEGESRLNLVQRNVDIFKHI120
IPNVVKYSPNCIIWVSNPVDILTYVARKL SGFPAHRVIGTGTMLDSARFRFLLGEKLGV180
SANSVHGYVIGEHGDSSVPVWSNVNVAGVR LASMNPKIGCKDDPENFEEIHKQVVQSAYD240
IIRLKGYTSffAIGLTCQSLCNSILNNLHTV YPLSVSVKGLYGIEEDVYLSLPCLVTSAGI300
SHVIPQELSQEELVRLRKSAATIHGVINGI Kff33权利要求
一种日本血吸虫L 乳酸脱氢酶的基因，其特征在于包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的日本血吸虫L-乳酸脱氢酶的基因，其特征在于所述的SEQID NO. 1所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO. 2所示序列的蛋白。
3.—种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶，其特征在于包括具有SEQ ID N0.2所示氨基酸 序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功 能的蛋白。
4.一种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶在制备血吸虫疫苗方面的应用。
5.一种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶在筛选药物方面的应用。
6.一种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶在制备抗血吸虫抗体方面的应用。
7.—种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶在血清学诊断方面的应用。
8.—种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶的编码基因在基因治疗方面的应用。
全文摘要
本发明公开了一种日本血吸虫L-乳酸脱氢酶基因、其编码蛋白及应用，该基因包括具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；日本血吸虫L-乳酸脱氢酶，包括具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白、或由该蛋白发生一个或多个氨基酸的置换、缺失或插入而形成的具有相同功能的蛋白，该蛋白是具有SEQ ID NO.1序列编码的蛋白。本发明的日本血吸虫L-乳酸脱氢酶作为免疫原，在制备血吸虫疫苗方面的应用；作为潜在的药物作用靶点，在筛选药物方面的应用；作为特异性血吸虫抗原，在制备抗血吸虫抗体方面的应用；在血清学诊断方面的应用；日本血吸虫L-乳酸脱氢酶的编码基因，在基因治疗方面的应用。
文档编号C12Q1/32GK101921783SQ20091005743
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月17日 优先权日2009年6月17日
发明者冯正, 刘锋, 胡薇, 韩泽广 申请人:上海人类基因组研究中心