专利名称：华支睾吸虫乳酸脱氢酶，其编码核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明描述了一种新的多肽——华支睾吸虫乳酸脱氢酶，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及此多核苷酸和多肽的应用。
背景技术：
华支睾吸虫是人畜共患病，成虫寄生在肝胆管内，成虫会破坏胆道上皮和粘膜下血管，并产生分泌排泄抗原，引起胆管和胆管周围的炎症反应，导致胆管局限性扩张和胆管上皮细胞增生。一些抗原成分还能够通过胆管上皮细胞进入肝组织，引起炎症反应和肝功能损伤。长期的严重感染会导致纤维组织增生和肝细胞的萎缩变性，甚至引起癌变、腹水和肝硬化。华支睾吸虫占据胆管，使得胆汁流出不畅，易合并细菌感染和出现胆石症。
华支睾吸虫病的防治主要依靠综合防治措施。在流行区强化对人群的普查普治，并加强疫苗的研制，以减少传染源和保护易感人群。目前，华支睾吸虫病防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机理研究。
脱氢酶类是生物体内氧化还原反应中重要的催化剂之一，在生物体内的氧化产能、解毒以及某些生理活动(如Cori循环)中起着很重要的作用，在生产实践中也应用广泛，因而，对脱氢酶类的研究相当多。其中，L2乳酸脱氢酶作为具有多形性的同工酶的典型代表，在酶的生物学研究、临床检验以及病理与治疗机制的研究中意义重大，因此，研究其催化反应的微观机理具有重要的理论价值和实际意义。
乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)主要存在于动物的肌肉中。该酶的分子中含有四个亚基(subun it)，分子量130000～145000。LDH实际上是一个具有五种分子形态的同工酶族，其中有两种形态分别由同一种亚基组成，这两种LDH是主要分布于心肌中的H4和主分布于骨骼肌中的M4；另三种LDH分别由混合亚基组成，它们分别为H3M、H2M 2和HM3。在任何形态的LDH中，每一个H或M亚基均含一个具有催化功能的活性中心[Laidler K.J，Bunting P.S.The chemical kinetics of enzyme action.LondonOxfordUniversity Press，1973342.]。对于混合亚基的四聚体，如H3M，它的催化动力学性质与3∶1的H4、M4的混合物是相同的，这表明不同种类LDH分子中相同亚基的活性中心非常相似，并且每个亚基上的催化反应之间没有显著的相互作用[Anderson V.E，LaReau R.D.J.Chem.Soc，1998，1103695-3697]。
E.Silverstein等[Laidler K.J，Bunting P.S.The chemical kinetics of enzymeaction.LondonOxford University Press，1973342.]证实该反应按如下机理进行，即酶(E)总是首先与辅酶(NAD+)结合为二元复合物。与此同时，酶的构象发生改变，然后再结合底物L2乳酸(S)进行反应。反应时先释放出产物丙酮酸(P)，然后酶与还原辅酶(NADH)分离，反应中生成的H+首先转移到酶的残基(His2195)上，反应后再由酶释放出去，完成催化反应。
1994年Ranganathan等[Ranganathan S，Gready J.E.J.Chem.Soc Faraday Trans，1994，90(14)2047-2056.]在研究LDH催化丙酮酸还原反应的过渡态及其中的电荷分布时，发现在所有的过渡态中，底物22位羰基均呈质子化态，而HR尚未与底物成键，这说明反应应该是H+转移先于H-转移的分步机理，且其计算结果显示限速步骤是H-转移这一步。后来，A ndrés等[Andros J，Moliner V，Krechl J，et.al.J.Chem.Soc Perkin Trans2，19951551-1558.]再次使用PM 3和AM 1两种方法对过渡态结构进行研究，所得结论完全一样，并且他们所得跃迁矢量(transition vector)和反应路径表明H+和H-的转移在动力学上同步(kineticallycoupled)，但在动态学上不同步(dynamicallyuncoupled)，亦即，H+和H-应该是同时向底物移动的，但是当H+已经与底物成键时，H-却仍在反应途中。不久前，Ranganathan等使用QM^MM计算(quan tum m echan ical and mo lecu lar mechan icalcalcu lat ion s)方法又对反应的势能面进行了探讨，结果虽然支持分步机理，但却是H-在H+之前转移到底物上。在他们的计算中，QM计算部分仍然是采用半经验的AM1方法。
本发明人经过广泛而深入的研究，从华支睾吸虫中分离了编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶DNA，并表达纯化了华支睾吸虫乳酸脱氢酶，并进一步揭示了基于此多核苷酸与多肽的应用。
发明内容
本发明的一个目的是提供分离的新的多肽——华支睾吸虫乳酸脱氢酶以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一个目的是提供编码该多肽的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供针对本发明的多肽——华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抗体。
本发明的另一个目的是提供了抑制本发明多肽表达的多核苷酸。
本发明的另一个目的是提供本发明的多肽应用于筛选华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抑制剂；或者用于肽指纹图谱鉴定。
本发明的另一个目的是提供本发明的核酸分子作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列的应用。
本发明的另一个目的是提供一种检测华支睾吸虫的试剂盒，其含有特异性检测华支睾吸虫乳酸脱氢酶的引物、抗体或多肽本身。
本发明的另一个目的是提供一种用于预防华支睾吸虫病的疫苗，其含有华支睾吸虫乳酸脱氢酶或编码该酶的多核苷酸的真核表达载体。
本发明的另一个目的是提供一种用于治疗华支睾吸虫病的药物组合物，其含有用本发明多肽筛选出的华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抑制剂。
在本发明的第一方面，本发明涉及一种分离的多肽，该多肽是华支睾吸虫源的，它包含具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。更佳地，该多肽不含信号肽序列。
在本发明的第二方面，本发明还涉及一种分离的多核苷酸，它包含选自下组的一种核苷酸序列或其变体(a)编码具有SEQ ID No.2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸；更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种(a)具有SEQ ID NO1中211-1194位的序列；和(b)具有SEQ ID NO1中1-1358位的序列。
在本发明的第三方面，本发明还涉及一种能与本发明多肽特异性结合的抗体。
在本发明的第四方面，提供了抑制本发明多肽表达的多核苷酸。
在本发明的第五方面，提供本发明的多肽和编码序列的用途。例如，利用多肽应用于筛选华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抑制剂，所筛选出的抑制剂以安全有效剂量与药物上可接受的赋型剂组成治疗华支睾吸虫病的药物组合物；或者用于肽指纹图谱鉴定。利用编码序列或其片段作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列的应用。
在本发明的第六方面，提供了一种检测华支睾吸虫的试剂盒，其含有特异性检测华支睾吸虫乳酸脱氢酶的引物、抗体或多肽本身。
在本发明的第七方面，提供一种用于预防华支睾吸虫病的疫苗，其含有华支睾吸虫乳酸脱氢酶或编码该酶的多核苷酸的真核表达载体。
在本发明的第八方面，提供一种用于治疗华支睾吸虫病的药物组合物，其含有用本发明多肽筛选出的华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抑制剂。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的，例如，利用本发明可以涉及一种含有本发明多核苷酸的载体，特别是表达载体；一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞；一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法。
本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，它们可以是单链或双链的，代表有义链或反义链。类似地，术语“氨基酸序列”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列及其片段或部分。当本发明中的“氨基酸序列”涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关的完整的天然氨基酸。
蛋白质或多核苷酸“变体”是指一种具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列。所述改变可包括氨基酸序列或核苷酸序列中氨基酸或核苷酸的缺失、插入或替换。变体可具有“保守性”改变，其中替换的氨基酸具有与原氨基酸相类似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸。变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。类似地，术语“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力。
“抑制物”是指当与华支睾吸虫乳酸脱氢酶结合时，一种可封闭或调节华支睾吸虫乳酸脱氢酶的生物学活性的分子。抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合华支睾吸虫乳酸脱氢酶的分子。
“调节”是指华支睾吸虫乳酸脱氢酶的功能发生改变，包括蛋白质活性的升高或降低、结合特性的改变及华支睾吸虫乳酸脱氢酶的任何其它生物学性质、功能或免疫性质的改变。
″基本上纯″是指基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化华支睾吸虫乳酸脱氢酶。基本上纯的华支睾吸虫乳酸脱氢酶在非还原性聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。华支睾吸虫乳酸脱氢酶多肽的纯度可用氨基酸序列分析。
“互补的”或“互补”是指在允许的盐浓度和温度条件下通过碱基配对的多核苷酸天然结合。例如，序列“C-T-G-A”可与互补的序列“G-A-C-T”结合。两个单链分子之间的互补可以是部分的或全部的。核酸链之间的互补程度对于核酸链之间杂交的效率及强度有明显影响。
“同源性”是指互补的程度，可以是部分同源或完全同源。“部分同源”是指一种部分互补的序列，其至少可部分抑制完全互补的序列与靶核酸的杂交。这种杂交的抑制可通过在严格性程度降低的条件下进行杂交(Southern印迹或Northern印迹等)来检测。基本上同源的序列或杂交探针可竞争和抑制完全同源的序列与靶序列在的严格性程度降低的条件下的结合。这并不意味严格性程度降低的条件允许非特异性结合，因为严格性程度降低的条件要求两条序列相互的结合为特异性或选择性相互作用。
“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的核苷酸序列。“反义链”是指与“有义链”互补的核酸链。
“衍生物”是指HFP或编码其的核酸的化学修饰物。这种化学修饰物可以是用烷基、酰基或氨基替换氢原子。核酸衍生物可编码保留天然分子的主要生物学特性的多肽。
“抗体”是指完整的抗体分子及其片段，如Fa、F(ab’)2及Fv，其能特异性结合华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抗原决定簇。
“分离的”一词指将物质从它原来的环境(例如，若是自然产生的就指其天然环境)之中移出。比如说，一个自然产生的多核苷酸或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来，但同样的多核苷酸或多肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。这样的多核苷酸可能是某一载体的一部分，也可能这样的多核苷酸或多肽是某一组合物的一部分。既然载体或组合物不是它天然环境的成分，它们仍然是分离的。
如本发明所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的华支睾吸虫乳酸脱氢酶”是指华支睾吸虫乳酸脱氢酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化华支睾吸虫乳酸脱氢酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。华支睾吸虫乳酸脱氢酶多肽的纯度能用氨基酸序列分析。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种新的多肽——华支睾吸虫乳酸脱氢酶，其基本上是由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列组成的。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括华支睾吸虫乳酸脱氢酶的片段、衍生物和类似物。如本发明所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的华支睾吸虫乳酸脱氢酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明多肽的片段、衍生物或类似物可以是(I)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；或者(II)这样一种，其中一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代包含取代基；或者(III)这样一种，其中成熟多肽与另一种化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；或者(IV)这样一种，其中附加的氨基酸序列融合进成熟多肽而形成的多肽序列(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)通过本文的阐述，这样的片段、衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的知识范围之内。
在本发明的第二方面，本发明提供了分离的多核苷酸，基本由编码具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽的多核苷酸组成。本发明的多核苷酸序列包括SEQ ID NO1的核苷酸序列。本发明的多核苷酸是从华支睾系成虫的全长cDNA文库中发现的。它包含的多核苷酸序列全长为1358个碱基，其开放读框(211-1194)编码了328个氨基酸。根据氨基酸序列同源比较发现，此多肽与Anguilla rostrata乳酸脱氢酶有76％的同源性，可推断出该蛋白就是华支睾吸虫乳酸脱氢酶。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本发明所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质或多肽，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”是指包括编码此多肽的多核苷酸和包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述描述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片断、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ IDNO2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与以上所描述的序列杂交的核酸片段。如本发明所用，”核酸片段”的长度至少含10个核苷酸，较好是至少20-30个核苷酸，更好是至少50-60个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段也可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的多核苷酸。
本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的特异的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源的多核苷酸序列，2)表达文库的抗体筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段，3)表达序列标签(EST)技术分离的多核苷酸片段。
本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以获得所述多肽的双链DNA。
上述提到的方法中，分离基因组DNA最不常用。DNA序列的直接化学合成是经常选用的方法。更经常选用的方法是cDNA序列的分离。分离感兴趣的cDNA的标准方法是从高表达该基因的供体细胞分离mRNA并进行逆转录，形成质粒或噬菌体全长cDNA文库。提取mRNA的方法已有多种成熟的技术，试剂盒也可从商业途径获得(Qiagene)。而构建cDNA文库也是通常的方法(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory.New York，1989)。当结合使用聚合酶反应技术时，即使极少的表达产物也能克隆。
可用常规方法从这些cDNA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(1)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(2)标志基因功能的出现或丧失；(3)测定华支睾吸虫乳酸脱氢酶的转录本的水平；(4)通过免疫学技术或测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。
在第(1)种方法中，杂交所用的探针是与本发明的多核苷酸的任何一部分同源，其长度至少10个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸。此外，探针的长度通常在2000个核苷酸之内，较佳的为1000个核苷酸之内。此处所用的探针通常是在本发明的基因序列信息的基础上化学合成的DNA序列。本发明的基因本身或者片段当然可以用作探针。DNA探针的标记可用放射性同位素，荧光素或酶(如碱性磷酸酶)等。
在第(4)种方法中，检测华支睾吸虫乳酸脱氢酶基因表达的蛋白产物可用免疫学技术如Western印迹法，放射免疫沉淀法，酶联免疫吸附法(ELISA)等。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的多核苷酸序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法如双脱氧链终止法测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列，测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接成全长的cDNA序列。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或直接用华支睾吸虫乳酸脱氢酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
本发明中，编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的多核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。术语“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体/转录调控元件(如启动子、增强子等)和选择性标记基因。
本发明中，编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该多核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的华支睾吸虫乳酸脱氢酶。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码 华支睾吸虫乳酸脱氢酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，重组多肽可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在本发明的第三方面，本发明提供了用多肽，及其片段、衍生物作为抗原以生产抗体的方法。这些抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还提供了针对华支睾吸虫乳酸脱氢酶抗原决定簇的抗体。这些抗体包括(但不限于)多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库产生的片段。
多克隆抗体的生产可用华支睾吸虫乳酸脱氢酶直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备华支睾吸虫乳酸脱氢酶的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产。而已有的生产单链抗体的技术也可用于生产抗华支睾吸虫乳酸脱氢酶的单链抗体。
抗华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的华支睾吸虫乳酸脱氢酶在虫体中的分布和分泌排泄。
与华支睾吸虫乳酸脱氢酶结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。本发明中的抗体可用于预防或阻断华支睾吸虫乳酸脱氢酶引起的病理改变。
在本发明的第四方面，抑制华支睾吸虫乳酸脱氢酶mRNA的寡核苷酸(包括反义RNA、反义DNA、干扰RNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。干扰RNA(iRNA)是一类能在体内特异降解靶基因mRNA从而使该基因沉默的一小段双链RNA分子，其序列一般是mRNA5’下游70bp以后的一段互补序列。通过将该段序列及其反向序列同时克隆到同一个真核表达载体中，转染华支睾虫体或组织细胞，该质粒转录出来的RNA形成dsRNA，能特异降解靶基因的iRNA。mRNA沉默技术可用于治疗由于华支睾吸虫谷胱苷肽硫转移酶的无表达或异常/无活性表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常，从而确认基因(蛋白质的生理功能)。
在本发明的第五方面，本发明的多肽以及该多肽的抑制剂可直接用于华支睾吸虫病的诊断和治疗。
具体就本发明的新的华支睾吸虫乳酸脱氢酶而言，该蛋白是华支睾吸虫糖类代谢，尤其是厌氧代谢中的关键酶，对主要依赖厌氧代谢产能的华支睾吸虫来说，其意义犹为重要。而且华支睾吸虫能分泌乳酸脱氢酶到体外，进入宿主机体，诱发免疫应答，可以作为一个潜在的靶抗原，用于华支睾吸虫病的免疫诊断。
本发明也提供了筛选化合物以鉴定阻遏华支睾吸虫乳酸脱氢酶活性的药剂的方法，乳酸脱氢酶在华支睾吸虫中无处不在，在蛋白质代谢的早期和晚期都发挥作用，其抑制剂能有效干扰华支睾吸虫蛋白质代谢，导致其代谢紊乱而死亡，因此，它可以作为一个重要的药物靶标。华支睾吸虫乳酸脱氢酶的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。华支睾吸虫乳酸脱氢酶的拮抗剂可以与华支睾吸虫乳酸脱氢酶结合并消除其功能，或是抑制乳酸脱氢酶产生，或是与乳酸脱氢酶的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。
在筛选作为抑制剂的化合物时，可以将华支睾吸虫乳酸脱氢酶加入生物分析测定中，通过测定化合物对华支睾吸虫乳酸脱氢酶和其底物之间相互作用的影响来确定化合物是否是抑制剂。能与华支睾吸虫乳酸脱氢酶结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，一般应对华支睾吸虫乳酸脱氢酶分子进行标记。
本发明还涉及定量和定位检测华支睾吸虫乳酸脱氢酶水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，包括酶比活性的测定和免疫学测定。试验中所检测的华支睾吸虫乳酸脱氢酶水平，可以用作华支睾吸虫病感染程度(虫负)的一个指标。
本发明的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。
编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的多核苷酸也可用于多种治疗目的。重组的基因治疗载体可设计用于表达变异的华支睾吸虫乳酸脱氢酶，以抑制内源性的华支睾吸虫乳酸脱氢酶活性。例如，一种变异的华支睾吸虫乳酸脱氢酶可以是缩短的、缺失了催化中心的华支睾吸虫乳酸脱氢酶，虽可与下游的底物结合，但缺乏乳酸脱氢酶活性。或者根据该基因的多核苷酸序列设计一段小的反义核酸，干扰该基因的转录过程和转录后的翻译过程，同样可起到华支睾吸虫蛋白质代谢和其它生理功能的作用。这种抑制内源性重组乳酸脱氢酶活性的质粒，可以以适当的剂型和方式进入肝胆道中，被华支睾吸虫所吞食，进入其合胞体中而起作用。
编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的多核苷酸可用于华支睾吸虫病的诊断。编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的多核苷酸可用于检测华支睾吸虫的存在和乳酸脱氢酶的表达水平。如根据该多核苷酸序列设计引物，用多聚酶链式反应(PCR)从粪便标本的虫卵中提取核酸模板进行基因扩增，根据扩增的多核苷酸片段的大小是否符合预定值来确定华支睾吸虫的感染。该技术高度敏感特异，能够克服常规形态学检测方法容易发生的漏检和误检。基因检测的方法不仅可以检测是否存在华支睾吸虫的感染，而且还能对华支睾吸虫进行分型，确定其亚种或株。编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的DNA序列还可用于对活检标本进行杂交以判断华支睾吸虫乳酸脱氢酶的表达状况。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用华支睾吸虫乳酸脱氢酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测华支睾吸虫乳酸脱氢酶的转录产物。
本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。该序列会特异性地针对某条华支睾染色体具体位置且并可以与其杂交。目前，需要鉴定染色体上的各基因的具体位点。现在，只有很少的基于实际序列数据(重复多态性)的染色体标记物可用于标记染色体位置。根据本发明，为了将这些序列与疾病相关基因相关联，其重要的第一步就是将这些DNA序列定位于染色体上。
简而言之，根据cDNA制备PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条华支睾染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。
体细胞杂合细胞的PCR定位法，是将DNA定位到具体染色体的快捷方法。使用本发明的寡核苷酸引物，通过类似方法，可利用一组来自特定染色体的片段或大量基因组克隆而实现亚定位。可用于染色体定位的其它类似策略包括原位杂交、用标记的流式分选的染色体预筛选和杂交预选，从而构建染色体特异的cDNA库。
将cDNA克隆与中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，可以在一个步骤中精确地进行染色体定位。一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。
在本发明的第六方面，华支睾吸虫病的诊断除了除了常规的病原生物学检查，主要的方式是使用免疫学诊断试剂盒。主要有两类酶联免疫试剂盒(ELISA)和快速免疫胶体金试剂盒(ICT)。华支睾吸虫病的诊断即可通过检测血清或尿液中的循环抗原判断现症感染，也可通过检测血清或唾液中的特异性抗体来快速筛查。由于华支睾吸虫主要是寄生在组织外，所产生的抗原成分绝大部分随着胆汁排入肠道，只有感染度高，虫体对胆管阻塞严重，引起胆管上皮严重破损时，其分泌排泄物才能进入肝脏和外周血中。进入外周血中的循环抗原大部分被抗体所中和，只有少量游离的循环抗原可被检测到。因此，检测循环抗原的方法虽然能反映现症感染，但是敏感性较低。目前，临床用于辅助诊断的主要是抗体检测试剂盒。检测抗体的方法分为两种，一是用标记二抗作为检测试剂与被包被在反应板或反应膜上的抗原所捕获得抗体相结合，一种是用标记的抗原作为检测试剂。二抗作为检测试剂，一般只能检测一种抗体，而且非特异性结合比较高；标记抗原作为检测试剂，能检测多种抗体，特异性更高。
本发明可以利用纯化的华支睾吸虫乳酸脱氢酶制备ELISA检测试剂盒，也可以利用纯化的华支睾吸虫乳酸脱氢酶制备胶体金免疫层析检测试剂盒。
在本发明的第七方面，华支睾吸虫是组织外寄生虫，免疫系统难以直接与其作用。它产生的抗原刺激机体粘膜系统产生粘膜免疫反应是其主要的保护性反应。粘膜免疫产生的分泌型IgA，可以阻止分泌排泄抗原通过胆管上皮进入肝细胞，从而降低这些抗原成分对机体的毒害作用，而不是直接对虫体起到攻击杀伤的作用。因此，华支睾吸虫的疫苗以口服型疫苗为主，将重组乳酸脱氢酶蛋白与卵磷脂1∶10混合，加入10倍的生理盐水溶液，超声震荡，制成脂质体，装入缓释胶囊，制成口服型重组蛋白疫苗。
在本发明的第八方面，本发明还提供一种治疗华支睾吸虫病的药物组合物，其含有用本发明多肽筛选出的华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抑制剂，所筛选出的抑制剂以安全有效剂量与药物上可接受的赋型剂组成治疗华支睾吸虫病的药物组合物。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。
抑制剂药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。施用于患者的的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
图1为分离的华支睾吸虫乳酸脱氢酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)，41kDa为蛋白质的分子量，箭头所指为分离出的蛋白条带。
图2为胶体金免疫层析模式图标号1测试线2质控线3玻璃纤维片具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1华支睾吸虫乳酸脱氢酶的克隆用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取华支睾吸虫成虫总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上，转化DH5α，细菌形成cDNA文库。用Dye terminate cycle reactionsequencing kit(Perkin-Elmer公司产品)和ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer公司)测定所有克隆的5’和3’末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库(Genebank)进行比较，结果发现其中一个克隆c007b07的cDNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。结果表明，c007b07克隆所含的全长cDNA为1358bp(如Seq ID NO1所示)，从第211bp至1194bp有一个984bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个新的蛋白质(如Seq ID NO2所示)。我们将此克隆命名为c007b07，编码的蛋白质命名为华支睾吸虫乳酸脱氢酶。
实施例2cDNA克隆的同源检索将本发明的华支睾吸虫乳酸脱氢酶的序列及其编码的蛋白序列，用Blast程序(Basiclocal Alignment search tool)[Altschul，SF et al.J.Mol.Biol.1990；215403-10]，在Genbank、Swissport等数据库进行同源检索。与本发明的多肽同源性最高的基因是一种已知的乳酸脱氢酶，在Genbank的准入号为P33571。结果显示两者高度同源，其相同性为57％；相似性为76％。
实施例3用RT-PCR方法克隆编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的基因用华支睾成虫总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagene的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增Primer15’-CCGCTGTATACACTGGCATAG-3’(SEQ ID NO3)Primer25’-TTTTTGATGACATAGACATTT-3’(SEQ ID NO4)Primer1为位于SEQ ID NO1的5’端的第1bp开始的正向序列；Primer2为SEQ ID NO1的中的3’端反向序列。
扩增反应的条件在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期94℃ 30sec；45℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO1所示的1-1358bp完全相同。
实施例4Northern印迹法分析华支睾吸虫乳酸脱氢酶基因的表达用一步法提取总RNA[Anal.Biochem 1987，162，156-159]。该法包括酸性硫氰酸胍苯酚-氯仿抽提。即用4M异硫氰酸胍-25mM柠檬酸钠，0.2M乙酸钠(pH4.0)对组织进行匀浆，加入1倍体积的苯酚和1/5体积的氯仿-异戊醇(49∶1)，混合后离心。吸出水相层，加入异丙醇(0.8体积)并将混合物离心得到RNA沉淀。将得到的RNA沉淀用70％乙醇洗涤，干燥并溶于水中。用20μg RNA，在含20mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(pH7.0)-5mM乙酸钠-1mM EDTA-2.2M甲醛的1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后转移至硝酸纤维素膜上。用α-32P dATP通过随机引物法制备32P-标记的DNA探针。所用的DNA探针为图1所示的PCR扩增的华支睾吸虫乳酸脱氢酶编码区序列(211bp至1194bp)。将32P-标记的探针(约2×106cpm/ml)与转移了RNA的硝酸纤维素膜在一溶液中于42℃杂交过夜，该溶液包含50％甲酰胺-25mM KH2PO4(pH7.4)-5×SSC-5×Denhardt’s溶液和200μg/ml鲑精DNA。杂交之后，将滤膜在1×SSC-0.1％SDS中于55℃洗30min。然后，用Phosphor Imager进行分析和定量。
实施例5重组华支睾吸虫乳酸脱氢酶的体外表达、分离和纯化根据SEQ ID NO1和图1所示的编码区序列，设计出一对特异性扩增引物，序列如下Primer35’-GCCCTCGAGATGTCATCAATATTGAAACCC-3’(Seq ID No5)Primer45’-AATGGATCCTTACCATTTGATGCCCTGGAT-3’(Seq ID No6)此两段引物的5’端分别含EcoRI和BamHI酶切位点，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，NdeI和BamHI酶切位点相应于表达载体质粒pET-28a(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的pBS-CS7B07质粒为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为总体积50μl中含pBS-CS7B07质粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分别为10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。循环参数94℃ 20s，59℃ 30s，68℃ 2min，共25个循环。用EcoRI和BamHI分别对扩增产物和质粒pET-28a(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-CS7B07)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-CS7B07)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析，得到了纯化的目的蛋白华支睾吸虫乳酸脱氢酶。经SDS-PAGE电泳，在41kDa处得到一单一的条带(图1)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与SEQ ID NO2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。
实施例6 华支睾吸虫乳酸脱氢酶的物理化学性质将亲和层析纯化的华支睾吸虫乳酸脱氢酶，用enterokinase酶切除载体序列后，经SDS-PAGE电泳，和标准分子量曲线，测得其分子量约为41kDa；该蛋白含酸性氨基酸残基28个，碱性氨基酸残基30个，利用Amerham等电聚焦电泳仪，经pH3-10和pH7-10梯度固定胶的等电聚焦电泳，测得其等电点为8.13。蛋白分子在水溶液环境中，呈球状，易溶于水，其半衰期在哺乳动物线粒体中为30小时，在酵母细胞大于20小时，在大肠杆菌中超过10小时，蛋白质的结构稳定。
实施例7 抗华支睾吸虫乳酸脱氢酶抗体的产生用经亲和层析纯化的华支睾吸虫乳酸脱氢酶加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用该蛋白加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml重组华支睾吸虫乳酸脱氢酶包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与华支睾吸虫乳酸脱氢酶结合。该抗体是多克隆抗体，在琼脂免疫双扩试验中与重组抗原效价在1∶32以上，与虫体粗抗原的反应效价在1∶16以上。该抗体能够检测到重度感染的华支睾吸虫病人的乳酸脱氢酶循环抗原。
实施例8本发明的多核苷酸片段用作杂交探针的应用从本发明的多核苷酸中挑选出合适的寡核苷酸片段用作杂交探针有多方面的用途，如用该探针可与不同来源的正常组织或病理组织的基因组或cDNA文库杂交以鉴定其是否含有本发明的多核苷酸序列和检出同源的多核苷酸序列，进一步还可用该探针检测本发明的多核苷酸序列或其同源的多核苷酸序列在正常组织或病理组织细胞中的表达是否异常。从本发明的多核苷酸SEQ ID NO1中选择寡核苷酸片段用作杂交探针，应遵循以下原则和需要考虑的几个方面探针大小优选范围为18-50个核苷酸；GC含量为30％-70％，超过则非特异性杂交增加；探针内部应无互补区域；符合以上条件的可作为初选探针，然后进一步作计算机序列分析，包括将该初选探针分别与其来源序列区域(即SEQ ID NO1)和其它已知的基因组序列及其互补区进行同源性比较，若与非靶分子区域的同源性大于85％或者有超过15个连续碱基完全相同，则该初选探针一般就不应该使用；此外，再根据已设计好的探针片段或其互补片段的替换突变序列作为第二探针。
探针1(probe1)，属于第一类探针，与SEQ ID NO1的基因片段完全同源或互补(40Nt)5’-TCAACGTGGCTGGTGTCCGGTTGTCCTCAATCAATCCGCA-3’(Seq ID No7)探针2(probe2)，属于第二类探针，相当于SEQ ID NO1的基因片段或其互补片段的替换突变序列(40Nt)
5’-TCAACGTGGCTGGTGTCCAGTTGTCCTCAATCAATCCGCA-3’(Seq ID No8)核酸探针通常采用滤膜杂交方法，包括斑点印迹法、Southern印迹法、Northern印迹法和复印方法等，它们都是将待测的多核苷酸样品固定在滤膜上后使用基本相同的步骤杂交。
与以下具体实验步骤有关的其它未列出的常用试剂及其配制方法请参考文献DNAPROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆实验手册书籍如《分子克隆实验指南》(1998年第二版)[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社。
步骤1)将新鲜或新鲜解冻的华支睾吸虫用冷匀浆缓冲液(0.25mol/L蔗糖；25mmol/L Tris-HCl，pH7.5；25mmol/LnaCl；25mmol/L MgCl2)悬浮沉淀(大约10ml/g)，4℃用电动匀浆器以全速匀浆组织悬液，直至组织被完全破碎。用苯酚抽提法组织中的DNA，然后用乙醇沉淀。必须除去RNA污染时，可将RNA酶A加到DNA溶液中，终浓度为100ug/ml，37℃保温30分钟消化RNA，然后再重新抽提DNA。样膜的制备2)取4×2张适当大小的硝酸纤维素膜(NC膜)，用铅笔在其上轻轻标出点样位置及样号，每一探针需两张NC膜，以便在后面的实验步骤中分别用高强度条件和强度条件洗膜。吸取及对照各15微升，点于样膜上，在室温中晾干。置于浸润有0.1mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次)，晾干置于浸润有0.5mol/L Tris-HCl(pH7.0)，3mol/LNaCl的滤纸上5分钟(两次)，晾干。夹于干净滤纸中，以铝箔包好，60-80℃真空干燥2小时。
3)探针用磷酸激酶标记32P后过Sephadex G-50柱，用液体闪烁仪监测同位素量，合并第一峰的收集液后即为所需制备的32P-Probe(第二峰为游离γ-32P-dATP)。
4)预杂交将样膜置于塑料袋中，加入3-10mg预杂交液(10×Denhardt’s；6×SSC，0.1mg/ml CT DNA(小牛胸腺DNA)。)，封好袋口后，68℃水浴摇2小时。
5)杂交将塑料袋剪去一角，加入制备好的探针，封好袋口后，42℃水浴摇过夜。
6)洗膜高强度洗膜取出已杂交好的样膜；2×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分钟(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分钟(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，55℃洗30分钟(2次)，室温晾干。
低强度洗膜取出已杂交好的样膜；2×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15分钟(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，37℃洗15分钟(2次)；0.1×SSC，0.1％SDS中，40℃洗15分钟(2次)，室温晾干。
7)X-光自显影-70℃，X-光自显影(压片时间根据杂交斑放射性强弱而定)。
实验结果采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验，以上四个探针杂交斑放射性强弱没有明显区别；而采用低强度洗膜条件所进行的杂交实验，探针1的杂交斑放射性强度明显强于其它三个探针杂交斑的放射性强度。因而可用探针1定性和定量地分析本发明的多核苷酸在不同组织中的存在和差异表达。
实施例9制备诊断试剂盒ELISA检测试剂盒的制备将纯化的华支睾吸虫乳酸脱氢酶用碳酸盐包被缓冲液((pH9.6)配成0.1mg/ml，96孔酶标般的每孔加50ul，4℃过夜，倒掉包被液后，用含10％脱脂奶粉的PBS-Tween20溶液100u1封闭孔壁多余的蛋白结合位点，4℃封闭过夜后倒掉封闭液。在酶标板反应孔中加入待测血清50ul，轻摇5分钟后，静置37℃湿盒中30～60分钟，用PBS-Tween20洗涤液反复震荡洗涤3次，每次3分钟；再加辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG(1∶1000稀释液50ul)，重复上述结合和洗涤过程，然后加底物和显色剂显色，当出现显色明显时，加入2％硫酸溶液终止反应。肉眼观察或用酶标仪测定反应结果。
胶体金免疫层析检测试剂盒的制备常见的免疫层析系统有浸条式(dipstick)、卡片式和盒式三种。盒式免疫层析系统具有图2所示的相同的基本原理和构造由层析系统(层析膜和一个或两个吸收层相连)固相免疫反应系统(抗原或抗体呈线状包被在层析膜特定的位置上作为测试线或质控线)，样品和胶体金标记试剂从一端加入，在膜的毛细管作用下，沿膜表面向另一端移动，并被吸收层吸收。样品中的待测成分与胶体金检测试剂在层析过程中与结合在膜上的捕获试剂发生免疫结合反应，而停留在包被线(包括测试线1和质控线2)上，显示出一条红色的反应线。当样品中不含待测成分，则在测试线1处不显色，而作为阳性对照的质控线2则显红色。浸条式检测试剂盒将测试条下端先后加入待测样品液和标记的胶体金溶液中；卡片式和盒式检测试剂盒中，标记的胶体金以干燥的固体形式保存在一端的玻璃纤维片3上，卡片式只需将待测溶液和缓冲液直接滴加到玻璃纤维片上，合上卡片，几分钟后即可盖面的观察窗判断结果；盒式将检测条装入小塑料盒中，放胶体金的一端对应圆形的加样孔，样品和缓冲液从加样孔加入，几分钟后从长方形的观察窗中判断结果。
本检测试剂盒中，层析膜为孔径8μm的混合纤维素膜，纯化的华支睾吸虫乳酸脱氢酶包被在吸收层的远端作为检测线，华支睾病人的阳性血清包被在吸收层的近端作为质控线，标记华支睾吸虫乳酸脱氢酶的胶体金溶液滴加到玻璃纤维片后干燥，放置在层析膜的另一端。
胶体金的制备及标记将氯金酸盐用去离子的超纯水配成0.01％的浓度，煮沸后，迅速加入1％的柠檬酸三钠溶液，(每100ml加2ml)，不离火迅速振摇混匀，一直煮到溶液颜色变为葡萄酒红色后撤火，用超纯水补足原有体积。制备的胶体金的平均粒径约20nm。将制备好的胶体金溶液用0.25mol/L的碳酸钾溶液调pH8.0，在搅拌情况下按15μg/mL的量加入纯化的乳酸脱氢酶，反应10分钟，15000g的离心力离心30分钟，沉淀用原体积1/10的PBS(pH8.0)重新悬浮。
实施例10制备疫苗华支睾吸虫是组织外寄生虫，免疫系统难以直接与其作用。它产生的抗原刺激机体粘膜系统产生粘膜免疫反应是其主要的保护性反应。粘膜免疫产生的分泌型IgA，可以阻止分泌排泄抗原通过胆管上皮进入肝细胞，从而降低这些抗原成分对机体的毒害作用，而不是直接对虫体起到攻击杀伤的作用。因此，华支睾吸虫的疫苗以口服型疫苗为主，将重组乳酸脱氢酶蛋白与卵磷脂1∶10混合，加入10倍的生理盐水溶液，超声震荡，制成脂质体，装入缓释胶囊，制成口服型重组蛋白疫苗。
实施例11制备药物组合物华支睾吸虫乳酸脱氢酶同人乳酸脱氢酶的5个同工酶在结构上存在明显的差别。利用此差别筛选出了对华支睾吸虫乳酸脱氢酶选择性抑制剂，8-脱氧半棉籽酚酸(2，3-二羟基-6-甲基-4-(1-甲基乙基)-1-萘酸)，该抑制剂与华支睾吸虫乳酸脱氢酶的解离常数低达50nM，选择性高达400倍。该抑制剂能溶于水，以淀粉、甘油等作为赋型剂，制成口服型片剂或将抑制剂装入胶囊，可用于华支睾吸虫病的治疗。
序列表<110>中山大学<120>华支睾吸虫乳酸脱氢酶，其编码核酸及其应用<130>cs007b07<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1358<212>DNA<213>Clonorchis sinensis<400>1ccgctgtata cactggcata gtgtaaattg ggtacgggcc ccccctcgag gtcgatggta 60tcgataagct tgatatcgaa ttcgtatcgg cctagcagtg gtatcaacgc agagtggcca 120ttacggtcgg ggacatttac gcggggatat aaacaactta tcagtttcat cacgactcac 180ctacgactgt gaaatcagac gcagagcaaa atgtcatcaa tattgaaacc cgtagcgcca 240gctgatgcta gatctcgccc gaggacgaag atcactgtga ttggtgtggg atctgtgggc 300atggcctcag ctttcgcatt gatggaaata accggagagc tttgtctaat tgatattgcc 360gtagacaaag tgaaaggcga ggttcttgac ctgcaacatg gacaacaatt tctgaggaga 420tgtcacgtgc acggaagctc tgactacaaa gacagtgcaa attcggatat tgttgtaata 480acagctggtg ctcgtcagaa tgaaggagaa tccaggctaa atctagtcca gaggaatgtt 540gacatcttca aacatatgat tccgaacatc gtgaagtaca gtccaaattg cattattgtc 600gtcgtgtcga atcccgtgga cgtgttgacc tatgttgctg ctaaactcag tggttttcca 660actcatcgag ttattggcac aggtacaatg ctggactctg cccgtttccg ttatctatta 720ggagaaaagt tgggggtgtc agcgaattct gtacatggtt acgtcattgg tgaacatgga 780gattcgagtg tgccgatatg gagtaatgtc aacgtggctg gtgtccggtt gtcctcaatc 840aatccgcaga taggaacagc agctgacccg gaaaagtttg gagaaataca caaagaggtg 900gttgagagtg cgtatgaaat aattagattg aaaggatata cctcctgggc aatcgggctt 960acttgccgtt cattgtgcaa cgcaattctt cataatttac atgcggttta cccacttaca1020acttgtgcca aaggctttca cggtattcaa aatgatgtat acctgagctt accttgtttg1080
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<400>8tcaacgtggc tggtgtccgg ttgtcctcaa tcaatccgca 40
权利要求
1.一种分离的多肽-华支睾吸虫乳酸脱氢酶，其特征在于它包含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸包含选自下组中的一种(a)编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽或其片段、类似物、衍生物的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的序列包含有SEQ ID NO1中211-1194位的序列或SEQ ID NO1中1-1358位的序列。
4.一种能与多肽结合的抗体，其特征在于所述抗体是能与所述华支睾吸虫乳酸脱氢酶特异性结合的抗体。
5.一类调节多肽表达的多核苷酸，其特征在于它们是抑制所述华支睾吸虫乳酸脱氢酶的表达的多核苷酸，且具有SEQ ID NO1所示的多核苷酸序列或其片段的反义序列或者与其序列一致的寡聚双链RNA。
6.如权利要求1所述多肽的应用，其特征在于它应用于筛选华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抑制剂；或者用于肽指纹图谱鉴定。
7.如权利要求2-3中的任一权利要求所述的多核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。
8.一种检测华支睾吸虫的试剂盒，其特征在于它含有特异性检测华支睾吸虫乳酸脱氢酶的引物、权利要求4所述的抗体、权利要求1所述的多肽任一或其组合。
9.一种用于预防华支睾吸虫病的疫苗，其特征在于其含有权利要求1所述的多肽或含有权利要求2或3所述的多核苷酸的真核表达载体。
10.一种用于治疗华支睾吸虫病的药物组合物，其特征在于含有用权利要求1所述多肽筛选出的华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一种编码华支睾吸虫乳酸脱氢酶的基因，基因编码的多肽，多肽的抗体。本发明还公开了此多肽用于筛选华支睾吸虫乳酸脱氢酶的抑制剂，多核苷酸作为引物或者作为探针的应用，尤其公开了此多肽与多核苷酸作为诊断试剂盒、疫苗与药物组合物的用途。
文档编号A61K38/43GK1670200SQ20051002400
公开日2005年9月21日 申请日期2005年2月22日 优先权日2005年2月22日
发明者余新炳, 吴忠道, 徐劲, 陈守义, 张红梅 申请人:中山大学