专利名称：氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备，属于酶学领域。
近年来，酶学在临床诊断与治疗中的应用发展非常迅速，现已分别发展为医学中的两个新领域，即诊断酶学和治疗酶学。目前已有上百种酶试验可用于临床诊断。临床酶学的这一发展，部分是由于测定技术的发展，使许多酶的测定已日益精确和简便，可用于常规测定。部分是由于认识到某些疾病发展过程中酶活力必然发生改变这一客观事实，特别是在疾病的早期，用X光片、CT还未能发现病灶时，而体内的酶活性已开始发生变化。如果能定期查体，可做到对疾病的早期发现。值得一提的是，目前临床上诊断酶学的应用多数是对酶的总活性的测定，并且市场上已有相应试剂盒销售，其缺点是缺乏器官特异性。目前有关酶活性测定的试剂盒约有20～30种，同工酶检测试剂盒约有3～5种，但多数用的是化学抑制法或免疫抑制法。而同工酶是指酶蛋白结构不同而具有相同的催化特性的一类酶，不同的同工酶来自不同的组织和细胞。当某一组织或器官发生病变时，由于组织受损或细胞膜通透性的变化，引起细胞内酶大量释入血液而引起血清酶活性的改变。通过同工酶的检测可确定患病部位，从而提高酶学诊断的特异性和敏感性，还可判断预后。目前由于自行配制酶显示液，因所用试剂品种繁多，规格不一，致使酶显示结果不稳定，结果判定不统一，且同工酶检测操作较繁琐，费时等等，特别是大型生化分析仪的应用，使临床生化检测的操作更简便，省时、省力，但其是对总酶活性的测定，缺乏组织特异性，相比较，同工酶的检测使病变早期定性和定位就精确的多了。
本发明的目的在于提供一种质量优良、性能稳定、重复性能好，同时大大简化了检测的操作过程且使用该试剂盒可使同工酶的检测操作规范化，从而使酶活性的检测及质量控制达到统一标准的氧化还原酶诊断试剂盒的制备。
本发明的目的由如下技术方案实施做醋酸纤维素薄膜电泳时的试剂配制，其包括有(1)、配制0.04～0.1mol/L电极液，PH为7.5-9.0；(2)、配制0.04～0.2mol/L泡显色膜缓冲液；(3)、冰乙酸做为固定液，用时加水稀释；其中如(2)所述的泡显色膜缓冲液分装安瓿B；如(3)所述固定液分装安瓿F；(4)、配制泡电泳膜缓冲液分装安瓿A按重量百分比，其是取三羟甲基氨基甲烷7.4～83.3％、乙二氨四乙酸8.3～78.4％、氯化钠4.2～68.6％加水溶解，加盐酸调pH 7.0～9.0，加水100～1000ml，用时加水稀释5～25倍；(5)配制显色液(a)、将0.5～1.5mol/L底物和0.05～0.5mol/L缓冲液，底物与缓冲液混合分装安瓿C，按其体积比分别为2.0％～50％∶50.0％～98.0％；若显示乳酸脱氢酶同工酶，底物可以是乳酸或多种乳酸盐类物质，如乳酸钠、乳酸锂等；若显示苹果酸脱氢酶同工酶，底物可用苹果酸或苹果酸盐类物质，如苹果酸钠等；若显示乙醇脱氢酶同工酶，底物可用乙醇、丙醇、n-丁醇或n-戊醇；若显示异柠檬酸脱氢酶同工酶，底物可用异柠檬酸或其盐类，如异柠檬酸钠等；若显示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶同工酶，底物可用葡萄糖-6-磷酸或其盐类，如葡萄糖-6-磷酸钠等；若显示谷氨酸脱氢酶同工酶，底物可用谷氨酸或其盐类，如谷氨酸钠等；(b)、将辅酶I的固体粉末和硝基兰四氮唑的固体粉末分装安瓿D，(c)、将吩嗪甲酯偏硫酸固体粉末分装安瓿E，所述辅酶I的固体粉末、硝基兰四氮唑的固体粉末、吩嗪甲酯偏硫酸的固体粉末，按重量百分比，其比例分别为5.8％～93.7％，6.2％～94.0％，0.5％～9.0％，用时安瓿C的内容物、安瓿D的内容物、安瓿E的内容物混合即为显色液。
做琼脂糖凝胶电泳试剂配制如下其包括有(1)、配制0.04～0.1mol/L电极液，PH为7.5-9.0；(2)、冰乙酸做为固定液分装安瓿F，用时加水稀释；(3)、配制泡电泳膜缓冲液分装安瓿A按重量百分比，其是取三羟甲基氨基甲烷7.4～83.3％、乙二胺四乙酸8.3～78.4％、氯化钠4.2～68.6％加水溶解，加盐酸调pH 7.0～9.0，加水100～1000ml，用时加水稀释5～25倍；(4)、配制琼脂凝胶内装琼脂糖也可以为琼脂、如(3)所述的安瓿A内的泡电泳膜缓冲液、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮分装安瓿B，按重量百分比，琼脂、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮分别为7.0％～36.4％、52.6％～91.0％、1.4％～19.4％，然后再加入80～120ml的泡电泳膜缓冲液，加热溶解，趁热分装，制备安瓿B；(4)所述的琼脂凝胶的配制，也可以是内装琼脂糖也可以为琼脂、如(3)所述的安瓿A内的泡电泳膜缓冲液、琼脂为0.5g～1g，加入80～120ml的缓冲液，加热溶解，趁热分装，制备分装安瓿B；(5)配制显色液(a)、将0.5～1.5mol/L底物和0.05～0.5mol/L缓冲液，底物与缓冲液混合分装安瓿C，按其体积比分别为2.0％～50％∶50.0％～98.0％；此处若显示乳酸脱氢酶同工酶，底物可以是乳酸或多种乳酸盐类物质，如乳酸钠、乳酸锂等；若显示苹果酸脱氢酶同工酶，底物可用苹果酸或苹果酸盐类物质，如苹果酸钠等；若显示乙醇脱氢酶同工酶，底物可用乙醇、丙醇、n-丁醇或n-戊醇；若显示异柠檬酸脱氢酶同工酶，底物可用异柠檬酸或其盐类，如异柠檬酸钠等；若显示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶同工酶，底物可用葡萄糖-6-磷酸或其的盐类，如葡萄糖-6-磷酸钠等；若显示谷氨酸脱氢酶同工酶，底物可用谷氨酸或其盐类，如谷氨酸钠等；(b)、将辅酶I的固体粉末和硝基兰四氮唑的固体粉末分装安瓿D，(c)、将吩嗪甲酯偏硫酸固体粉末分装安瓿E。
此处辅酶I的固体粉末、硝基兰四氮唑的固体粉末、吩嗪甲酯偏硫酸的固体粉末，按重量百分比分别为5.8％～93.7％，6.2％～94.0％，0.5％～9.0％，用时安瓿C、安瓿D、安瓿E的内容物混合即为显色液。
所述安瓿C中的缓冲液可以是磷酸盐缓冲液，也可以用Tris-HCL或Tris-顺丁烯二酸缓冲液。
所述安瓿D中的辅酶I可用辅酶II代替，硝基兰四氮唑可有噻唑兰、碘代硝基四唑代替。
所述安瓿D也可混合溶解后制备为冻干试剂，所述冻干试剂的制备将辅酶I和硝基兰四氮唑按重量百分比，为5.8％～93.7％、6.2％～94.0％，加水溶解后分装于安瓿内，进行冷冻干燥后再加入0.5％～9.0％吩嗪甲酯偏硫酸，制备为安瓿F。
本发明的优点是将试剂分装于安瓿内，便于保存，性能稳定，重复性好，减轻了劳动强度，改变了传统的人工配制试剂的繁琐。并由此而引起的操作过程中个体间存在的差异，从而使操作规范化，使酶的检测及质量控制达到统一的标准，同时使用试剂盒简化了操作过程，省时、快速、便于推广。尤其是当做大量样品检测时试剂盒更方便适用，为临床疾病的诊断和鉴别诊断提供依据。
实施例实施例1、做醋酸纤维素薄膜电泳时的试剂配制，其包括有(1)、配制0.1mol/L巴比妥-HCL缓冲液为电极液，PH为8.0；(2)、配制0.06mol/L泡显色膜缓冲液分装安瓿B；(3)、冰乙酸做为固定液，取2ml分装安瓿F，用时加水稀释；(4)、配制泡电泳膜缓冲液分装安瓿A取三羟甲基氨基甲烷3g、乙二胺四乙酸1.2g、Nacl7g，加水溶解，用盐酸调PH8.5。然后加水至1000ml，用时稀释5倍。(5)配制显色液(以乳酸脱氢酶(LDH)为例，其它与乳酸脱氢酶相类似)安瓿C内装0.5M的底物乳酸钠0.2ml、磷酸缓冲液1.8ml；安瓿D内装辅酶I3mg、硝基兰四氮唑8mg；安瓿E内装吩嗪甲酯偏硫酸0.1mg。用时安瓿C的内容物、安瓿D的内容物、安瓿E的内容物混合即为显色液。
应用首先泡膜打开安瓿A加水至40ml，将醋纤膜泡在该液内至少20分钟。然后将醋纤膜取出，夹在滤纸中间吸去多余水份，膜条无光泽面朝上。用点样片醮血清点在距膜一端2cm处。将配制好的电极缓冲液倒入电泳槽内，使槽内电极缓冲液处于同一水平。在电泳槽的阴、阳极槽内分别用合适尺寸的滤纸折叠4层搭在槽的两侧，做为盐桥。将点样的膜条点样面朝下，点样处朝向阴极端搭在盐桥上，膜条需与盐桥贴紧，绷展。接通电源，调节电压100～260v，10～30分钟后，关闭电源。然后进行同工酶显色打开安瓿B，倒入一器皿内加蒸馏水至20ml，取醋酸纤维素薄膜浸泡在该液内至少10分钟。当电泳时，打开安瓿C、安瓿D，将安瓿C内液体加入安瓿D内充分溶解。然后将泡在B液中的膜条取出用滤纸吸干，取一玻璃板在上面放一张滤纸，将膜条无光泽面朝上放在滤纸上，同时把混合好的安瓿C、安瓿D混合液加入安瓿E内混合后倒在膜条上涂均匀，放在有盖的器皿内(避光)，室温下放置两分钟，即为染色膜。然后将电泳后的膜条点样面朝下，贴在染色膜上，在37℃温育20～30分钟，即可见同工酶谱。
结果显示乳酸脱氢酶同工酶(LDH)，正常人血清LDH同工酶有五条酶带，从正极向负极依次为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。正常人LDH4、LDH5活性很弱，有时几乎没有。心肌梗塞时LDH1活性增强，肝脏疾患时LDH5活性增强，在原发性肝癌时LDH3、LDH4、LDH5活性均增强。
实施例2、做醋酸纤维素薄膜电泳时的试剂配制，其包括有(1)、配制0.04mol/LTris-HCL缓冲液电极液，PH为8.6；(2)、配制0.1mol/L泡显色膜缓冲液分装安瓿B；(3)、冰乙酸做为固定液，取2ml分装安瓿F，用时加水稀释；(4)、配制泡电泳膜缓冲液分装安瓿A取三羟甲基氨基甲烷13g、乙二胺四乙酸4g、Nacl3g，加水溶解，用盐酸调PH8.0。然后加水至800ml，用时稀释20倍；(5)配制显色液(以苹果酸脱氢酶(MDH)为例，其它与苹果酸脱氢酶相类似)安瓿C内装1M的底物苹果酸钠0.1ml、磷酸缓冲液1.5ml；安瓿D内装辅酶I15mg、硝基兰四氮唑10mg；安瓿E内装吩嗪甲酯偏硫酸0.05mg。用时安瓿C的内容物、安瓿D的内容物、安瓿E的内容物混合即为显色液。
应用如实施例1所述，结果正常人血清MDH同工酶有三条酶带，从正极向负极依次为MDH1、MDH2、MDH3。正常人MDH2很弱，有时没有。病毒性肝炎初期和病情极期，血清中MDH3活性增高，其增高幅度与病情严重性呈正相关，MDH3增高表明有细胞线粒体损伤。
实施例3、做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.08mol/LTris-硼酸电极液，PH为7.5；(2)、冰乙酸做为固定液，取2ml分装安瓿F，用时加水稀释；(3)、配制泡电泳膜缓冲液分装安瓿A其是取三羟甲基氨基甲烷7.5g、乙二胺四乙酸4.5g、氯化钠4.2g加水溶解，加盐酸调pH9.0，加水1000ml，用时加水稀释25倍；(4)、配制琼脂凝胶内装琼脂0.6g、如(3)所述的安瓿A内的泡电泳膜缓冲液80ml、蔗糖3.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.3g加热溶解，趁热分装，制备安瓿B；(5)配制显色液(以乙醇脱氢酶为例)(a)、将0.3ml浓度为1mol/L乙醇(丙醇或n-丁醇均可)做为底物和1.5ml浓度为0.3mol/L缓冲液，底物与缓冲液混合分装安瓿C，；(b)、将辅酶I的固体粉末6mg和噻唑兰的固体粉末4mg分装安瓿D，(c)、将吩嗪甲酯偏硫酸固体粉末0.1mg分装安瓿E，用时安瓿C、安瓿D、安瓿E的内容物混合即为显色液。
应用将安瓿A隔水加热溶解，趁热浇在一玻璃板上，冷却后在距膜一端约2cm处放0.3×1cm的滤纸。约10分钟后取下滤纸，在该处加样8微升，放置5分钟。然后将凝胶板放在加好电极液的电泳槽架上，两端用4层纱布搭桥，电压100v，电泳30分钟，关闭电源。将胶板取出加入上述已混合好的显色液，放在37℃温箱里温育20-30分钟，即可见同工酶显色带。
结果正常人血清ADH同工酶有三条酶带，从正极向负极依次为ADH1、ADH2、ADH3。急性实质性肝损伤，如病毒性肝炎，ADH同工酶均增高，肝癌、肺癌患者血清中ADH1和ADH2显著增高，酒精慢性中毒肝硬化时，酶活性降低。
实施例4、做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制浓度为0.04mol/L巴比妥缓冲液为电极液，PH为7.5；(2)、冰乙酸做为固定液，取2ml分装安瓿F，用时加水稀释；(3)、配制泡电泳膜缓冲液分装安瓿A其是取三羟甲基氨基甲烷10g、乙二胺四乙酸6g、氯化钠5g加水溶解，加盐酸调pH9.0，加水1000ml，用时加水稀释25倍；(4)、配制琼脂凝胶内装琼脂0.6g、如(3)所述的安瓿A内的泡电泳膜缓冲液100ml分装安瓿B，加热溶解，趁热分装，制备安瓿B；(5)配制显色液(以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶同工酶为例)，(a)、将0.1ml浓度为1mol/L葡萄糖-6-磷酸钠做为底物和1.5ml浓度为0.3mol/L缓冲液，底物与缓冲液混合分装安瓿C，；(b)、将辅酶II的固体粉末10mg和噻唑兰的固体粉末6mg分装安瓿D，(c)、将吩嗪甲酯偏硫酸固体粉末0.1mg分装安瓿E，用时安瓿C的内容物、安瓿D的内容物、安瓿E的内容物混合即为显色液。
应用同实施例3。
结果正常人红细胞溶血液G6PD同工酶紧紧位于血红蛋白A之前，为正常B型，呈现深蓝色酶带，G6PD缺乏症者酶带活性减弱，G6PD变异型可出现快B或慢B等的电泳带。血清中G6PD同工酶活性增强，提示有肿瘤的发生。
权利要求
1.一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备，做醋酸纤维素薄膜电泳，其包括有(1)、配制0.04～0.1mol/L电极液，PH为7.5-9.0；(2)、配制0.04～0.2mol/L泡显色膜缓冲液；(3)、冰乙酸做为固定液，用时加水稀释；其特征在于如(2)所述的泡显色膜缓冲液分装安瓿B；如(3)所述的固定液分装安瓿F；(4)、配制泡电泳膜缓冲液分装安瓿A按重量百分比，其是取三羟甲基氨基甲烷7.4％～83.3％、乙二胺四乙酸8.3％～78.4％、氯化钠4.2％～68.6％加水溶解，加盐酸调pH7.0～9.0，加水100～1000ml，用时加水稀释5～25倍；(5)配制显色液(a)、将0.5～1.5mol/L底物和0.05～0.5mol/L缓冲液，底物与缓冲液混合分装安瓿C，按其体积比为2.0％～50％∶50.0％～98.0％；(b)、将辅酶I的固体粉末和硝基兰四氮唑的固体粉末分装安瓿D；(c)、将吩嗪甲酯偏硫酸固体粉末分装安瓿E；其中所述辅酶I的固体粉末、硝基兰四氮唑的固体粉末和吩嗪甲酯偏硫酸固体粉末，按重量百分比，其比例分别为5.8％～93.7％，6.2％～94.0％，0.5％～9.0％，用时将安瓿C、D、E混合即为显色液。
2.一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备，做琼脂糖凝胶电泳，其包括有(1)、配制0.04～0.1mol/L电极液，PH为7.5-9.0；(2)、冰乙酸做为固定液，用时加水稀释；其特征在于如(2)所述的固定液分装安瓿F；(3)、配制泡电泳膜缓冲液分装安瓿A如权利要求1所述的安瓿A内分装的泡电泳膜缓冲液的配制；(4)、配制琼脂糖凝胶将琼脂糖或琼脂、如(3)所述的泡电泳膜缓冲液、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮分装安瓿B，其中琼脂糖或琼脂、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮，按重量百分比分别为7.0％～36.4％，52.6％～91.0％，1.4％～19.4％，然后再加入80～120ml的泡电泳膜缓冲液，加热溶解，趁热分装，制备为安瓿B；(5)配制显色液(a)、将0.5～1.5mol/L底物和0.05～0.5mol/L缓冲液，底物与缓冲液混合分装安瓿C，按其体积比为2.0％～50％∶50.0％-98.0％；(b)、将辅酶I的固体粉末和硝基兰四氮唑的固体粉末分装安瓿D；(c)、将吩嗪甲酯偏硫酸固体粉末分装安瓿E；其中所述辅酶I的固体粉末、硝基兰四氮唑的固体粉末和吩嗪甲酯偏硫酸固体粉末，按重量百分比，其比例分别为5.8％～93.7％，6.2％～94.0％，0.5％～9.0％，用时将安瓿C、D、E混合即为显色液。
3.根据权利要求1或2所述的一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述底物用乳酸或乳酸盐类物质，显示乳酸脱氢酶同工酶；底物用苹果酸或苹果酸盐类物质，显示苹果酸脱氢酶同工酶；底物用乙醇、丙醇、n-丁醇或n-戊醇，显示乙醇脱氢酶同工酶；底物用异柠檬酸或异柠檬酸盐类，显示异柠檬酸脱氢酶同工酶；底物用葡萄糖-6-磷酸或葡萄糖-6-磷酸的盐类，显示葡萄糖-6-磷酸脱氢酶同工酶；底物用谷氨酸或谷氨酸的盐类，显示谷氨酸脱氢酶同工酶。
4.根据权利要求2所述的一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述的(4)琼酯凝胶的配制内装琼脂糖也可以为琼脂、如(3)所述的缓冲液、其是将0.5g-1g加入80～120ml的缓冲液，加热溶解，趁热分装，制备分装安瓿B；
5.根据权利要求1或2所述的一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿C中的缓冲液可以是磷酸盐缓冲液也可以用Tris-HCL或Tris-顺丁烯二酸缓冲液。
6.根据权利要求1或2所述的一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿D中的辅酶I可用辅酶II代替，硝基兰四氮唑(NBT)可有噻唑兰(MTT)、碘代硝基四唑(INT)代替。
7.根据权利要求1或2所述的一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备，其特征在于所述安瓿D也可混合溶解后制备为冻干试剂，所述冻干试剂的制备将辅酶I和硝基兰四氮唑按重量百分比，为5.8％～93.7％、6.2％～94.0％，加水溶解后分装于安瓿内，进行冷冻干燥后再加入0.5％～9.0％吩嗪甲酯偏硫酸，制备为安瓿F。
全文摘要
本发明公开了一种氧化还原酶同工酶诊断试剂盒的制备,属于酶学领域。其是将试剂分装于安瓿内,便于保存,性能稳定,重复性好,减轻了劳动强度,改变了传统的人工配制试剂的繁琐。并由此而引起的操作过程中个体间存在的差异,从而使操作规范化,使酶的检测及质量控制达到统一的标准,同时使用试剂盒简化了操作过程,省时、快速、便于推广。尤其是当做大量样品检测时试剂盒更方便适用,为临床疾病的诊断和鉴别诊断提供依据。
文档编号G01N33/531GK1381724SQ0111075
公开日2002年11月27日 申请日期2001年4月20日 优先权日2001年4月20日
发明者舍英, 陈必珍, 阎美容, 侯金凤 申请人:呼和浩特同日试剂有限公司