专利名称：编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法
技术领域：
本发明涉及一种编码抗菌肽的核酸及其原核表达方法。
背景技术：
传统抗生素应用产生的负面效应日益严重，滥用抗生素对人类的危害、细菌耐性增强和耐药菌株增加、对环境的潜在危害等问题已受到全世界的关注。抗菌肽是机体在 受到病原体感染时产生的一类小分子多肽，作为一种先天性免疫因子，在保护机体不受病 原体的侵害中发挥重要作用，不易产生菌株耐药性。牛乳铁蛋白活性多肽(Lactoferricin B或LfcinB)首先由Bellamy等在1992年于牛乳铁蛋白的酶解产物中分离得到的一段N端 多肽，其抗菌活性比牛乳铁蛋白强400多倍。LfcinB来源于牛乳铁蛋白的17 41位氨基 酸，由25个氨基酸残基组成，分子结构以两亲性的β-折叠为主。LfcinB具有广谱抗菌活 性，具有强大的抑菌杀菌作用，同时具有抗病毒、抑制肿瘤生长、调节免疫及消炎、抗寄生虫 等多种生物学功能。LfcinB在医药、保健、食品保鲜等领域具有广泛的应用前景，然而来源 昂贵限制了 LfcinB的应用。
发明内容
本发明的目的是为了降低LfcinB的成产成本，而提供的一种编码抗菌肽 Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法。本发明编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸序列如下GGATCCTTCAAATGCCGCCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCGCCGTCTATTACCTGCGTG CGTCGCGCGTTCTAAGTCGAC。本发明编码抗菌肽Lactoferricin B核酸的原核表达按以下步骤实现一、将编 码抗菌肽Lactoferricin B的核酸序列连接到pGHX载体上，构建载体pGHX_LCB ；二、用 限制性内切酶BamH I和Sal I切割质粒pGHX_LCB，然后回收碱基长度为84bp的基因片 段连接到原核表达载体PGEX-4T-2的BamH I和Sal I酶切位点之间，构建重组表达质粒 PGEX-4T-2-LCB ；三、用重组表达质粒pGEX_4T-2_LCB转化感受态细胞DH5a ；四、提取被转化 的阳性感受态细胞DH5a的质粒转化E. coli BL21(DE3)；五、经转化的Ε. coli BL21菌落接 种于氨苄青霉素浓度为50 μ g/mL的LB液体培养基37°C培养8 12h，然后吸取500 μ L菌 液转接入氨苄青霉素浓度为50 μ g/mL、体积为50mL的LB液体培养基中37°C培养至OD6tltl = 0. 6，再加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷至培养液中异丙基-β -D-硫代半乳糖苷终浓度为 0. 3mmol/L,然后置于33°C环境中诱导4h，之后取菌液100°C煮沸lOmin，再在12000转/min 条件下离心5min，取离心上清液，即实现编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸的原核表达。本发明对抗菌肽Lactoferricin B的编码核酸进行偏爱性改造，然后采用基因重 组技术将编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸导入原核表达宿主，进行表达。本发明编码 抗菌肽Lactoferricin B的核酸的原核表达方法具有抗菌肽LactoferricinB产量高、易纯 化、纯化条件温和、并且大部分以可溶性形式存在的特点。
图1是具体实施方式
二步骤二中酶切后的琼脂糖凝胶电泳图，图1中“4”泳道标样为Marker，“ 1 ”泳道标样为pGH-X_LCB，“2”泳道标样为BamH I和Sal I双酶切后的 pGHX-LCB，“3”泳道标样为pGEX-4T-2。图2是具体实施方式
二步骤三将被转化的阳性感受 态细胞DH5a双酶切的凝胶电泳图，图2中“ 1 ”泳道标样为Marker，“2”泳道标样为BamH I 和Sal I双酶切后的pGEX-4T-2-LCB。图3是具体实施方式
二步骤五中不同诱导时间原核 表达样品的SDS-PAGE分析结果图，图3中“1”泳道标样为样品1 (诱导时间为5h)，图3中 “2”泳道标样为样品2 (诱导时间为4h)，图3中“3”泳道标样为样品3 (诱导时间为3h)， 图3中“4”泳道标样为样品4 (诱导时间为2h)，图3中“5”泳道标样为样品5 (诱导时间 为Ih)，图3中“6”泳道标样为蛋白分子量标准，图3中“7”泳道标样为PGEX-4T-2转化的 E. coli Rosetta(DE3).图4是转化的E.coli BL21裂解液上清中各种蛋白含量的检测图。 图5是具体实施方式
二中表达的融合蛋白GST-L fcinB进行亲和层析纯化的洗脱曲线图。 图6是具体实施方式
二中脱峰进行SDS-PAGE分析图，图6中“ 1”泳道标样为蛋白分子量标 准，图6中“2”泳道标样为裂解液上清，图6中“3” “6泳道标样为纯化后GST-LfcinB融 合蛋白ο
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸序列如SEQID NO 1所示。
具体实施方式
二 本实施方式编码抗菌肽Lactoferricin B核酸的原核表达按以 下步骤实现一、将编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸序列连接到pGHX载体上，构建载 体pGHX-LCB ；二、用限制性内切酶BamH I和Sal I切割质粒pGHX_LCB，然后回收碱基长 度为84bp的基因片段连接到原核表达载体pGEX-4T-2的BamH I和Sal I酶切位点之间， 构建重组表达质粒PGEX-4T-2-LCB ；三、用重组表达质粒pGEX_4T-2_LCB转化感受态细胞 DH5a;四、提取被转化的阳性感受态细胞DH5a的质粒转化E.coli BL21(DE3)；五、经转化 的E. coli BL21菌落接种于氨苄青霉素浓度为50 μ g/mL的LB液体培养基37°C培养8 12h，然后吸取500 μ L菌液转接入氨苄青霉素浓度为100 μ g/mL、体积为50mL的LB液体培 养基中37°C培养至OD6tltl = 0.6，再加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至培养液中异 丙基- β -D-硫代半乳糖苷终浓度为0. 3mmol/L，然后置于33°C环境中诱导4h，之后取菌液 100°C煮沸lOmin，再在12000转/min条件下离心5min，取离心上清液，即实现编码抗菌肽 Lactoferricin B的核酸的原核表达。本实施方式步骤二酶切质粒PGHX-LCB后得到一条碱基长度为84bp的清晰DNA条 带，其大小与预计结果相同，2%琼脂糖凝胶电泳图如图1所示。用牙签挑取步骤三将被转化的阳性感受态细胞DH5a置于LB液体培养基中培养， 然后用BamH I和Sal I限制性内切酶双酶切，结果如图2所示，84bp处存在一清晰条带。 经过序列验证，重组质粒中含有LfcinB的基因片段，并经DNAMAN分析与设计的基因片段完全吻合。按诱导时间不同分别取原核表达样品进行15% SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分析结果如图3所示。样品1、2、3和4在29KDa处存在一条蛋白条带，为GST-L fcinB融合蛋白， 特别是样品2蛋白条带最为清晰明亮。转化的E.coli BL21裂解后裂解液上清中各种蛋白的含量如图4所示(图4中箭头为表达的融合蛋白所在位置)，经测定所表达的融合蛋白占总蛋白含量的20%以上，并 且所表达的蛋白是以可溶形式表达。将含有阳性重组子pGEX-4T-2-LCB的E. coli BL21 (DE3)接种于抗生素Amp浓度为50 μ g/mL的LB液体培养基中，37°C摇床培养过夜；取上述过夜培养物0. 5mL接种于新鲜 的LB (含50 μ g/mL Amp)液体培养基中；37°C振荡培养至OD600 = 0 . 6，加IOOmmol/L IPTG 至终浓度为0. 6mmol/L，33°C继续培养4h，5000r/min离心IOmin收集菌体；按IOOmL培养物 的菌体沉淀加入4mL PBS缓冲液重悬菌体，-20°C冷冻后，冰浴融解；加入溶菌酶至终浓度 lmg/mL，冰上放置30min ；加入Triton X-100至体积浓度为1%，剧烈震荡；4°C、12000转/ min离心30min，收集上清液；加入DNA酶和RNA酶至终浓度为5 μ g/mL, 4°C温浴IOmin ；力口 入DTT (二硫苏糖醇)至终浓度lmmol/L。GST-LfinB融合蛋白纯化GST_LfinB融合蛋白通过GST (谷胱甘肽-S转移酶)标 签亲和层析进行分离纯化，上样体积为100 μ L0纯化条件流速0. 5mL/min，压力0. 25MPa, Binding Buffer (1XPBS,140mmol/L NaCl,2. 7mmol/LKCl,lOmmol/L Na2HPO4,1.8mmol/L KH2PO4,pH 7. 3)处理预装柱，UV28tl调零，基线稳定后上载样品，待流出峰经过，基线完全回归 零点后更换 Elution Buffer (50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L 还原性谷胱苷肽，pH 8.0)进 行洗脱。回收洗脱峰样品经SDS-PAGE电泳分析，方法参照分子克隆实验指南(萨姆布鲁克 J.，拉塞尔D.W.2002.学出版社，P1713-1720)进行实验。样品制备参照蛋白质纯化与鉴定 实验指南(马歇克D. R.，门永J. T.，布格斯R. R.等，科学出版社，P259-261)。利用GEAKTA蛋白分离纯化系统对表达的融合蛋白GST-LfcinB进行亲和层析 纯化，洗脱曲线如图5所示，获得P 1、P2和P3三个洗脱峰，Pl和P2为流出峰，P3则为洗 脱峰。将洗脱峰进行SDS-PAGE分析，结果如图6所示，收集获得的样品在29KDa位置有一 清晰条带，是纯化后的GST-LfcinB融合蛋白，其纯度大与95%。本实施方式中pGEX-T系列载体所表达的融合蛋白标签与目的表达蛋白间的蛋白 酶切位点为凝血酶Thrombin，表达的的谷胱苷肽-S-转移酶(GST)分子量为26kDa，与目标 蛋白融合表达后大部分是可溶的，并存在于胞质中，因此可在无变性剂的条件下用谷胱苷 肽亲和柱进行层析，从细菌裂解物中提纯。GST基因融合表达载体除具有较高诱导表达量，本底表达水平低以及在表达蛋白 纯化过程中纯化条件温和，有利于保持蛋白活性的诸多优点。GST基因融合表达系统表达 LfcinB，获得了理想的表达效果，诱导蛋白表达量占细胞总蛋白的20%以上，并且大部分以 可溶性形式存在，避免了繁琐复杂的包涵体处理操作过程，而可溶性表达方式存在的蛋白 可以直接利用亲和层析进行纯化获得融合蛋白，方便了进一步的分离纯化过程。GST融合蛋白可以直接从细菌裂解液中用固定化谷胱苷肽将它吸附，洗脱条件温 和，整个过程无变性剂的加入，最大限度地保持了蛋白的天然构象。人KTApurifier蛋白纯 化系统是目前比较先进的分离纯化设备，其GSTrp GST系列亲和层析预装柱分离纯化条件稳定，纯化效率高，回收率大，对目标蛋白无影响等优点。因此在本实施方式中采用该设备 对GST-LfcinB融合蛋白的分离纯化，纯化目标蛋白纯度在95%以上，达到了极好的分离效果. 本实施方式步骤五中加入的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的原始浓度为IOOmmol/ L0
权利要求
编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸，其特征在于该核酸的序列如下GGATCCTTCAAATGCCGCCGTTGGCAGTGGCGTATGAAAAAACTGGGTGCGCCGTCTATTACCTGCGTGCGTCGCGCGTTCTAAGTCGAC。
2.编码抗菌肽LactoferricinB的核酸的原核表达方法，其特征在于编码抗菌肽 Lactoferricin B核酸的原核表达按以下步骤实现一、将编码抗菌肽Lactoferricin B的 核酸序列连接到PGHX载体上，构建载体pGHX-LCB ；二、用限制性内切酶BamH I和Sal I切 割质粒pGHX-LCB，然后回收碱基长度为84bp的基因片段连接到原核表达载体pGEX_4T_2 的BamH I和Sal I酶切位点之间，构建重组表达质粒pGEX_4T-2_LCB ；三、用重组表达质粒 PGEX-4T-2-LCB转化感受态细胞DH5a ；四、提取被转化的阳性感受态细胞DH5a的质粒转化 E. coliBL21 ；五、经转化的E. coli BL21菌落接种于氨苄青霉素浓度为50 μ g/mL的LB液体 培养基37°C培养8 12h，然后吸取500 μ L菌液转接入氨苄青霉素浓度为50 μ g/mL、体积 为50mL的LB液体培养基中37°C培养至OD600 = 0. 6，再加入异丙基-β _D_硫代半乳糖苷至 培养液中异丙基- β -D-硫代半乳糖苷终浓度为0. 3mmol/L，然后置于33°C环境中诱导4h， 之后取菌液100°C煮沸lOmin，再在12000转/min条件下离心5min，取离心上清液，即实现 编码抗菌肽LactoferricinB的核酸的原核表达。
3.根据权利要求2所述的编码抗菌肽LactoferricinB的核酸的原核表达方法，其特 征在于步骤五中加入的异丙基- β -D-硫代半乳糖苷的原始浓度为lOOmmol/L。
全文摘要
编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法，它涉及一种编码抗菌肽的核酸及其原核表达方法。它降低了LfcinB的成产成本，而提供的一种编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸及其原核表达方法。编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸的序列如SEQ ID NO1所示。编码抗菌肽Lactoferricin B核酸的原核表达按以下步骤实现一、构建载体pGHX-L CB；二、构建重组表达质粒pGEX-4T-2-LCB；三、用重组表达质粒pGEX-4T-2-LCB转化感受态细胞DH5a；四、提取被转化的阳性感受态细胞DH5a的质粒转化E.coli BL21；五、培养、诱导、煮沸、离心，即实现编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸的原核表达。本发明对抗菌肽Lactoferricin B的编码核酸进行偏爱性改造，然后采用基因重组技术将编码抗菌肽Lactoferricin B的核酸导入原核表达宿主，进行表达。
文档编号C12N15/12GK101812459SQ201010133179
公开日2010年8月25日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者冯兴军, 孟利强, 张云湖, 张先成, 张淑梅, 李晶, 王玉霞, 赵晓宇 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所