用于核酸特异性杂化合物的模板化装配的方法和组合物的制作方法
【专利说明】用于核酸特异性杂化合物的模板化装配的方法和组合物
[0001] 领域
[0002] 本公开涉及模板化装配的方法和包括核酸特异性杂化合物的模板化装配反应物 的组合物。
[0003] 背景
[0004] 药物开发的一个目标是将强效的生物治疗干预递送至病原细胞，例如病毒感染细 胞、瘤性细胞、产生自体免疫反应的细胞和其它调节异常或功能不良的细胞。能够对抗病原 细胞的强效生物治疗干预的实例包括毒素、促凋亡剂和重定向免疫细胞来消除病原细胞的 免疫治疗方法。遗憾的是，开发这些药剂极为困难，因为存在对邻近的正常细胞或患者的总 体健康具有毒性的尚风险。
[0005] 已经出现的允许将强效干预递送至病原细胞同时减轻对正常细胞的毒性的方法 是治疗剂的靶向，这是通过将它们针对对病原细胞具有特异性的分子标记物定向实现的。 靶向治疗剂已经在有限的情况下显示出非同寻常的临床结果，但是由于缺少可用于靶向治 疗的标记物，目前其适用性有限。发现许多病原细胞类型的蛋白质标记物是极为困难的且 经常是不可能的。
[0006] 最近，已经开发出靶向对病原细胞具有特异性的核酸标靶的疗法。现有的核酸靶 向疗法例如siRNA能够下调潜在危险基因的表达，但是不递送强效的细胞毒性干预或细胞 抑制干预，且因此在消除危险细胞本身方面不是特别有效。
[0007] 因此，存在对抗现有生物治疗干预的不良效率和/或严重副作用的需求。
[0008] 概要
[0009] 本公开涉及用于制备和使用靶向模板化装配反应物的方法和产物。在一个方面， 靶向模板化装配反应物可以包括结合靶核酸序列的至少一个核酸识别部分、结合核酸识别 部分的至少一个选择性反应性部分和至少一个效应物局部部分，其中该效应物局部部分和 该选择性反应性部分能够结合而产生活性效应物结构。在另一个方面，靶向模板化装配 反应物可以包括至少一个核酸识别部分、至少一个生物正交部分和至少一个效应物局部部 分。还公开了一种合成靶向模板化装配反应物的方法，所述合成是通过产生能够结合靶核 酸序列的至少一个核酸识别部分、产生能够结合相应的选择性反应性部分的至少一个选择 性反应性部分以及产生能够结合相应的效应物局部部分以生成活性效应物结构的至少一 个效应物局部部分。合成活性效应物结构的方法还包括产生至少两种模板化装配反应物、 使靶向模板化装配反应物与靶核酸序列接触以及生成活性效应物结构。本文还包括将至少 两种靶向模板化装配反应物递送至病原细胞的方法。所述方法可以包括向病原细胞施用治 疗有效量的革G向模板化装配反应物并在病原细胞中生成至少一个活性效应物结构。
[0010] 在一些实施方案中，公开了靶向模板化装配组合物。核酸识别部分可以是核酸结 合寡聚物和可以与靶核酸序列杂交的核酸寡聚物。此类寡聚物的实例可以包括选自由以下 所组成的组的寡聚物：DNA核苷酸、RNA核苷酸、经硫代磷酸酯修饰的核苷酸、2-0-烷基化 RNA核苷酸、卤代核苷酸、锁核酸核苷酸（LNA)、肽核酸（PNA)、吗啉代核酸类似物、假尿苷核 苷酸、黄嘌呤核苷酸、次黄嘌呤核苷酸、2-脱氧肌苷核苷酸、能够形成碱基对的其它核酸类 似物和其组合。核酸结合部分可以结合选自由以下所组成的组的靶核酸序列：致癌基因、突 变基因、致癌病毒基因、病毒核酸序列、微生物核酸序列、差异表达基因及其片段、部分或核 酸基因产物。
[0011] 在一些实施方案中，选择性反应性部分结合至核酸识别部分。选择性反应性部分 可以连接至核酸识别部分。选择性反应性部分还可以是生物惰性的，例如生物正交反应性 分子。选择性反应性部分的实例可以包括叠氮化物、环辛炔、硝酮、降冰片烯、氧杂降冰片二 烯、膦、二烷基膦、三烷基膦、膦基硫醇、膦基苯酚、环辛烯、氧化腈、硫酯、四嗪、异腈、四唑、 四环烷和其衍生物。
[0012] 效应物局部部分还可以包括与选择性反应性部分结合的第一效应物局部部分以 及与第一效应物局部部分结合以生成活性效应物结构的第二效应物局部部分。效应物局部 部分还可以包括能够与选择性反应性部分相互作用以生成活性效应物结构的化学连接子。 效应物局部部分可以是肽、拟肽结构的非活性部分、药物的非活性部分或小于20kDa的其 它生物活性化合物。
[0013] 在一些实施方案中，公开了一种活性效应物结构。该活性效应物可以包括至少一 个选择性反应性部分结构与结合至该选择性反应性部分的至少一个效应物局部部分的反 应产物。该活性效应物结构还可以包括结合至该反应产物的至少一个核酸识别部分。活性 效应物可以调节酶活性、基因/蛋白质表达（例如调节靶基因的表达）、分子信号传导和分 子相互作用中的至少一个和/或相较于效应物局部部分的活性具有靶向活性。活性效应物 还可以诱导以下各项中的至少一个：免疫反应、程序性细胞死亡、凋亡、程序性非特异性或 程序性坏死、裂解、生长抑制、病毒感染的抑制、病毒复制的抑制、致癌基因表达的抑制、基 因表达修饰、微生物感染的抑制和微生物复制的抑制。在一个实施方案中，活性效应物结构 为抗体。
[0014] 所述化学连接子还可以位于核酸识别部分与选择性反应性部分之间和/或选择 性反应性部分与效应物局部部分之间和/或为柔性部分、裂解位点和/或化学修饰位点。化 学连接子可以通过改善靶向模板化装配组合物的溶解度、疏水性、电荷、细胞渗透性、毒性、 生物分布和稳定性中的至少一个使核酸识别部分、生物正交部分和/或效应物局部部分官 能化。化学连接子的实例可以包括烷基、烯基、酰胺、酯、硫酯、酮、醚、硫醚、二硫化物、乙二 醇、环烷基、苄基、杂环基、马来酰亚胺基、腙、尿烷、唑类、亚胺、卤代烷基、氨基甲酸酯和其 组合。靶核酸序列可以包括癌症特异性核酸序列、病毒核酸序列、微生物特异性核酸序列、 差异表达基因、疾病特异性核酸序列和其片段、部分或核酸基因产物。
[0015] 在一些实施方案中，公开了一种合成模板化装配反应物的方法和一种合成活性效 应物结构的方法。所述方法还可以包括测定核酸识别部分、选择性反应性部分和效应物局 部部分生成活性效应物结构的能力。
[0016] 在一些实施方案中，公开了一种将至少两种靶向模板化装配反应物递送至病原细 胞的方法。该方法还可以包括在施用靶向模板化装配组合物之前检测是否存在靶核酸序 列。在另一个实施方案中，该方法包括诱导下列各项中的至少一个：病原细胞的程序性细胞 死亡、病原细胞的凋亡、病原细胞的非特异性或程序性坏死、病原细胞的裂解和病原细胞的 生长抑制。
[0017] 所施用的组合物还可以包括两组或更多组模板化装配反应物，其中一组模板装配 反应物包括靶向模板化装配反应物和相应的靶向模板化装配反应物。所述组还可以包括能 够结合两个或更多个靶核酸序列的两组或更多组核酸识别部分。两个或更多个靶核酸序列 可以被发现在相同的基因转录物内或在不同和分开的转录物上。识别相同细胞转录物中的 不同核酸靶序列的两组或更多组相应的模板化装配反应物可以独立地携带相同的效应物 局部结构，它们以模板导向方式反应形成相同效应物产物的额外拷贝。
[0018] 在一些实施方案中，识别不同和分开的核酸靶序列的两组或更多组相应的模板化 装配反应物可以携带相同的效应物局部结构，其以模板导向方式反应形成效应物产物。
[0019] 在一些实施方案中，识别相同的细胞核酸靶序列的两组或更多组相应的模板化装 配反应物可以携带不同的效应物局部结构，其以模板导向方式反应形成不同的效应物产 物。两组或更多组模板化装配反应物可以包括能够产生两个或更多个活性效应物结构的效 应物局部部分。
[0020] 在一些实施方案中，识别不同和分开的核酸靶序列的两组或更多组相应的模板化 装配反应物可以携带不同的效应物局部结构，其以模板导向方式反应形成不同的效应物产 物。在所述组合物中包含两组或更多组效应物局部部分的实施方案中，可以产生两个或更 多个活性效应物结构以诱导两种或更多种效应物活性。
[0021] 所述病原细胞可以是病毒感染细胞、肿瘤细胞和微生物感染细胞，或产生导致疾 病的分子的细胞，例如产生诱导过敏、过敏反应或自体免疫疾病的抗体或介导疾病的细胞 因子的细胞。在病原细胞是病毒感染细胞的实施方案中，所述方法可以进一步包括诱导下 列各项中的至少一个：病毒感染细胞的程序性细胞死亡、病毒感染细胞的凋亡、病毒感染 细胞的非特异性或程序性坏死、病毒感染细胞的裂解、病毒感染的抑制和病毒复制的抑制。 在病原细胞是肿瘤细胞的实施方案中，所述方法可以进一步包括诱导下列各项中的至少一 个：肿瘤细胞的程序性细胞死亡、肿瘤细胞的凋亡、肿瘤细胞的非特异性或程序性坏死、月中 瘤细胞的裂解、肿瘤细胞生长的抑制、肿瘤细胞中的致癌基因表达的抑制和肿瘤细胞中的 基因表达的修饰。在病原细胞是微生物感染细胞的实施方案中，所述方法可以进一步包括 诱导下列各项中的至少一个：微生物感染细胞的程序性细胞死亡、微生物感染细胞的凋亡、 微生物感染细胞的非特异性或程序性坏死、微生物感染细胞的裂解、微生物感染的抑制和 微生物复制的抑制。在病原细胞产生疾病介导分子的实施方案中，所述方法可以包括诱导 下列各项中的至少一个：疾病诱导细胞的程序性细胞死亡、疾病诱导细胞的凋亡、疾病诱导 细胞的坏死、疾病诱导细胞的裂解和疾病介导分子产生的抑制。
[0022] 附图简述
[0023] 本文已经包含附图以使得本公开的上述特征、优点和目标将变得清楚且可以被详 细理解。这些图示形成本说明书的一部分。然而，应该注意，【附图说明】本公开的实施方案且 不应该被视为限制本公开的范围。
[0024] 图1A是包括两种不同化合物的模板化装配反应物的一个实施方案的图解说明。 图1A示出了在靶核酸模板上的两个核酸识别部分之间的相互作用，指示不同的效应物局 部部分（A和B)和不同的选择性反应性部分（1和2)。
[0025] 图1B是包括两种或更多种不同化合物的模板化装配的另一个实施方案的图解说 明。图1B示出了使用三个效应物局部结构（A、B、C)和两个选择性反应性部分（1和2)的 三方装配。核酸识别部分的5'端连接至具有选择性反应性部分2的双重修饰的效应物局 部部分B，以促进形成三方反应产物。
[0026]图1C是其中模板化装配反应物由化学连接子连接的模板化装配的另一个实施方 案的图解说明。图1C描绘了通过单分子配置进行的模板化装配，其中单一核酸识别部分的 5'端和3'端被选择性反应性部分修饰，且后者仅在特异性核酸标靶的存在下变成空间并 列。
[0027] 图2A是含有特异性靶RNA分子（代表任何一般靶向核酸）的细胞靶隔室和具有 效应物局部结构和5'和3'生物正交反应性部分的两个参与性模板化装配反应物的图解说 明。将模板化装配反应物共递送至靶隔室中用于接近靶RNA。
[0028] 图2B示出了每个模板化装配反应物杂交至靶RNA上以使得生物正交反应性部分 并列地用于反应。Ν'表示针对每个模板化装配反应物中的每个碱基N的靶RNA链中的互补 喊基。
[0029] 图2C示出了模板化装配连接产物和装配效应物结构的实例：1)非无痕迹连接；2) 无痕迹连接；和3)无痕迹连接和在从载体核酸化学或酶促裂解后的游离效应物结构。
[0030] 图3是模板化装配反应物合成的步骤的流程图；图4示出了一种利用核酸模板化 装配产生所需生物活性的方法的流程图。方框代表需要从业人员的行动的步骤；椭圆代表 在施用后自然发生的步骤。
[0031]图5是描绘受试者内的靶定位和靶向模板化装配产物对定位靶的特异性的图解 说明。
[0032] 图6是用于选择性消除肿瘤细胞的治疗用途的一个实例的图解说明-治疗前。
[0033] 图7是用于选择性消除肿瘤细胞的治疗用途的一个实例的图解说明-治疗期间的 杂交。
[0034] 图8是描绘在靶细胞中产生并通过以下不同的机制起作用来诱导凋亡的效应物 结构的图解说明：细胞毒性Τ淋巴细胞、治疗性抗体、细胞内受体、直接细胞相互作用。
[0035] 图9是使用多个反应物（反应物Α和Β)的靶向模板化装配产物的图解说明。多 个核酸识别部分与靶序列杂交且使得反应物组合产生活性效应物结构。
[0036] 图10是说明模板化装配反应物在受试者样本中的诊断评价的图解。
[0037]图11是示出了由在各种杂交温度下的核酸模板化装配产生的连接产物的凝胶， 其中在模板化后残余极少的非连接产物。
[0038] 图12示出了在抗原特异性免疫效应细胞被经过处理的肿瘤细胞刺激中的IL-2释 放。
【具体实施方式】
[0039] 现在将描述某些示例性实施方案以提供本文所公开的组合物和方法的结构、功 能、制造和使用的原理的全面理解。这些实施方案的一个或多个实例说明于附图中。本领 域技术人员应该理解，本文所明确描述且在附图中说明的组合物和方法是非限制性示例性 实施方案且本公开的范围仅由权利要求书限定。结合一个示例性实施方案所说明或描述的 特征可以与其它实施方案的特征组合。此类修改和变化意图包含在本公开的范围内。
[0040] 传统靶向治疗受到靶抗原的可用性、致病基因的下调表达的能力或消除病原细胞 本身的效率的限制。相反地，所公开的方法和组合物避免了许多与这些疗法相关的最常见 缺点。由于靶向病原细胞中的特异性遗传模板，所公开的方法和组合物避免了脱靶毒性并 增强病原特异性反应性。与免疫治疗方案不同的是，本公开利用病原细胞的独特转录组来 生成可以介导所需结果的新型分子。这些细胞因此被靶定用于定向干预，例如通过自毁或 其它细胞的免疫治疗毁灭，而不引起对正常细胞的毒性。
[0041] 核酸模板化装配
[0042] 本公开允许在特定核酸序列的存在下选择性产生所需化学结构，即使在其它生物 材料的存在下仍是如此。本公开描述了两个或更多个反应物在靶核酸上的模板化装配，这 产生其中存在靶核酸的活性效应物产物。核酸模板化装配通过当存在靶核酸时增加相应反 应物的局部有效浓度改善反应动力学，并且还可以通过正确地定位反应物以参与反应来降 低针对产物形成的活化障碍。本公开允许通过仅在存在靶核酸处产生活性效应物结构来靶 向治疗疾病例如癌症和免疫系统紊乱。
[0043] 核酸模板化装配的基本方案描绘如下：
[0044]
[0045]核酸模板化装配使得两个或更多个模板化装配反应物接近以产生模板化装配连 接产物。如本文所使用，术语"模板化装配连接产物"是指由一个或多个核酸模板化装配反 应物的相互作用、结合或反应所形成的产物结构。模板化装配连接产物可以包括能够产生 所需生物活性的活性效应物产物。通过个别模板化装配反应物以位置特异性和/或方向特 异性方式经由与靶核酸的结合相互作用例如杂交和退火来促进模板化装配连接产物形成。 在单一靶模板上靠近以参与模板化装配反应的模板化装配反应物在本文中被称为"一组相 应的反应物"或"相应的模板化装配反应物"。一组相应的模板化装配反应物以序列特异性 方式结合至核酸靶模板的空间上接近的部分，并且容易地相互反应以生成包含活性效应物 结构的模板化装配连接产物。
[0046]模板化装配反应物可以包括核酸识别部分以引导序列特异性结合至靶模板的空 间上接近相应反应物的位置。模板化装配反应物还可以包括选择性反应性部分，以使得一 组相应反应物的选择性反应性部分容易地参与相互的反应，但可以不容易与病原细胞或生 物样本中的其它化合物反应。与不允许反应在复杂环境例如活细胞中进行的其它模板化装 配系统不同，利用选择性反应性部分可以允许核酸模板化装配在高度复杂的化学环境包括 活细胞中进行。模板化装配反应物还可以包括效应物局部部分，这使得当一组相应的反应 物参与靶模板化反应时，可以产生活性效应物产物。效应物局部部分可以包括核酸识别部 分和选择性反应性部分的一些或全部。模板化装配反应物可以任选地包括化学连接子或附 属基团，它们可以促进反应物的合成、改善其化学或生物性质和/或将额外的官能性引入 反应物中。
[0047]本文所公开的模板化装配方法的实践优点的一个实例为分子的固有模块性。例 如，如果由于效应物局部部分装配成完整效应物分子而可以产生特别有效的效应物分子， 则还可以通过在各种不同的核酸标靶上进行模板化而产生相同的效应物分子。这可以通过 使连接至选择性反应性基团的相同效应物局部结构结合至不同的核酸识别部分而实现，所 述核酸识别部分与指定靶核酸的结合使得所述选择性反应性基团在空间上接近。通过这 种方式，完整效应物分子可以通过结合至核酸标靶来装配，以产生相同的最终生物作用。另 外，可以革巴定相同细胞内的若干不同的转录物以避免由于单一特定革巴转录物的可能损失或 后天不可接近性所导致的模板化失败。因此，相同的效应物产物分子可以在相同靶细胞内 的不同核酸标靶上合成。类似地，可以在相同的转录物上装配不同的效应物产物以避免对 可以在靶细胞内产生的任何给定效应物机制的可能抗性。因此，通过识别病原细胞内的各 种靶转录物，可以使用相同的效应物装配物来消除细胞或在相同的转录物上装配不同的效 应物产物。这种模块性的优点为模板化装配技术提供了在现有生物治疗干预中未见到的灵 活性。
[0048] 在一些实施方案中，一组相应的模板化装配反应物是由为两种或更多种不同化合 物的模板化装配反应物组成，如图1A和图1B中所示。在另一个实施方案中，一组相应的模 板化装配反应物可以由化学连接子连接，连接方式为相应的反应物可以物理连接但维持空 间分离，除非存在靶模板以使它们接近来用于模板化装配反应，如图1C中所示。
[0049] 本公开总体上描述模板化装配反应物的方法和组合物，所述反应物包含至少一个 核酸识别部分、至少一个选择性反应性部分和至少一个效应物局部部分。
[0050] 本公开进一步描述了施用一组相应的模板化装配反应物以在靶核酸模板的存在 下产生活性效应物结构的方法。还描述了能够产生所需生物活性的示例性活性效应物结 构。
[0051] -般方法描绘于图2A中，且模板化装配产物的实例示于图2B和图2C中。所述方 法和组合物的进一步细节描述于以下部分中。
[0052] 核酸模板化装配反应物的设计和合成
[0053] 为了在靶细胞中选择性产生所需活性，需要合成这样的模板化装配反应物化合 物，其：a)在靶核酸的存在下，生成产生所需活性的活性效应物产物；b)在不存在靶核酸时 不生成活性效应物产物或明显量的活性；以及c)在天然生物分子的存在下不被非生产性 副反应耗尽。具有这些性质的模板化装配反应物化合物可以通过实施以下步骤来合成，其 中可以改变这些步骤的顺序以适应特定情况：
[0054] ?识别病原细胞或样本材料中的合适的靶核酸模板。
[0055] ?确定可以在病原细胞或样本材料中产生所需作用的合适的活性效应物结构。
[0056] ?确定模板化策略。
[0057] ?设计和合成可以结合靶核酸模板的核酸识别部分。
[0058] ?设计和合成与产生合适的活性效应物结构相容的选择性反应性部分。
[0059] ?设计和合成与产生合适的活性效应物结构相容的效应物局部部分。
[0060] ?合成完整的核酸模板化装配反应物。
[0061] 图3描绘了模板化装配反应物合成方法的步骤的流程图。这些步骤中的每一个的 细节描述于以下部分中。
[0062] 靶核酸
[0063] 任何核酸都可以是用于核酸模板化装配的可能的靶核酸，条件是至少一些序列信 息是可用的，足以直接或间接结合核酸识别部分。核酸识别部分单元的一些非限制性实例 可以包括寡核苷酸、肽核酸寡聚物和吗啉代寡聚物。靶核酸序列的一些非限制性实例可以 包括mRNA、基因组或细胞器DNA、附加体或质粒DNA、病毒DNA或RNA、miRNA、rRNA、snRNA、 tRNA或任何其它的生物或人工核酸序列。
[0064] 在一些实施方案中，靶核酸可以存在于靶隔室中，而不存在于非靶隔室中。这个 实施方案的一个实例包括存在于病原细胞或患病细胞中，而不存在于健康细胞中的核酸序 列。如本文所使用，术语"病原细胞"可以指能够引起或促使患病或异常状况的细胞，例如 感染病毒的细胞、肿瘤细胞和感染微生物的细胞。
[0065] 含有靶核酸的样本的任何细胞、病毒、组织、空间区域、裂解物或其它子组分都可 以提供该靶核酸。含有靶核酸的靶隔室可以包括但不限于病原细胞、癌细胞、病毒、被病毒 或其它病原体感染的宿主细胞或有助于自体免疫性的免疫系统的细胞例如适应性或先天 免疫系统、移植排斥或过敏反应的细胞。在一个实施方案中，靶核酸可以存在于病毒或感 染病毒的细胞中，而不存在于健康细胞中。病毒的一些非限制性实例可以包括DNA病毒、 RNA病毒或逆转录病毒。在一个实施方案中，靶核酸可以存在于肿瘤或癌性细胞中，而不存 在于健康细胞中。癌症的一些非限制性实例可以包括由致癌病毒例如人类乳头状瘤病毒、 Epstein-Barr病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、人类嗜T淋巴细胞病毒、Merkel细胞多瘤病毒和 卡波西氏肉瘤（Kaposi'ssarcoma)相关疱疹病毒所引起的癌症。在另一个实施方案中，革巴 核酸可以存在于感染原或微生物中或被感染原或微生物感染的细胞中，而不存在于健康细 胞中。感染原或微生物的一些非限制性实例可以包括病毒、细菌、真菌、原生生物、朊病毒或 真核寄生虫。
[0066] 靶核酸序列还可以是基因例如致癌基因、突变基因、致癌病毒基因、病毒核酸序 列、微生物核酸序列、差异表达基因和其核酸基因产物的片段、部分或局部。
[0067] 病毒特异性靶核酸的一些非限制性实例