一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用毛细管电泳技术筛选甲胎蛋白特异性核酸适配体的方法，包括以下步骤：设计并构建随机寡核苷酸文库，联合毛细管电泳技术与SELEX筛选方法，富集到能与甲胎蛋白结合的寡核苷酸，经克隆、测序、毛细管电泳分析以及免疫荧光验证，最终获得能与甲胎蛋白特异性结合的寡核苷酸，即适配体。本发明提供了一种高效、特异的适配体筛选方法。本发明的优点在于：依赖于毛细管电泳技术的优势，缩短了筛选时间，仅用4轮循环即可完成；同时减少了由基质作用引起的非特异性筛选。
【专利说明】一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析化学【技术领域】，具体地说，是一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法。
【背景技术】
[0002]核酸适配体(aptamer)是一种通过结构特异性识别祀分子的单链寡核苷酸(ssDNA或RNA)。其作用原理与抗体相似，同时又具有无免疫原性、可化学合成、易改造、成本低、稳定性好等优点，在临床诊断、新药开发以及基础研究中有着广阔的应用前景。
[0003]Aptamer筛选技术被命名为指数富集的配体系统进化技术，简称SELEX(Systematic evolut1n of ligand by exponential enrichment),是在 20 世纪 90 年代初发展起来的一种组合化学新技术。其基本思路是:体外构建寡核苷酸文库并与靶分子结合，通过特定的方法分离出与靶分子结合的核酸，借助PCR技术指数富集，经过反复筛选与扩增(一般为5-18个循环)，最终获得与靶分子高亲和力、高特异性结合的aptamer。
[0004]SELEX筛选过程中的关键步骤是游离核酸与能同靶分子结合核酸的分离。靶分子的性质不同，分离方法也相应不同。经过十几年的研究，在结合了其它新技术的基础上，发展出了许多新的SELEX筛选方法，为高效获得特异性aptamer提供了更多选择。
[0005]甲胎蛋白(AF P)是肝肿瘤最常用的标志物之一，其血清水平的升高通常预示着肝癌的发生。目前临床和科研中对AFP定性和定量的检测大都借助于抗体，灵敏度和特异性虽较高，但抗体存在着如成本高、具有免疫原性等缺点。Aptamer被称为“人工替代抗体”，若能筛选到特异性结合AFP的aptamer并取代抗体,就可以降低成本，同时还可以解决抗体批间差异大、不易保存和运输等问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
所述的筛选方法包括以下步骤:设计并构建大容量随机寡核苷酸文库以及用于PCR扩增的上游引物和下游引物，通过以毛细管电泳为基础的SELEX方法，富集能与AFP结合的寡核苷酸，最终经克隆、测序以及验证后得到与AFP特异性结合的寡核苷酸，即aptamer。
[0008]所述的随机寡核苷酸文库以及上、下游引物序列为:
随机寡核苷酸文库的序列如SEQ ID N0.1所示；
上游引物的序列如SEQ ID N0.2所示；
下游引物的序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]随机区域为35个碱基的寡核苷酸文库的容量理论上为435，构象丰富，可以筛选出任何祀分子的aptamer。
[0010]所述的以毛细管电泳为基础的SELEX方法包括以下步骤:随机寡核苷酸文库与AFP共同孵育，混合物进行毛细管电泳，寡核苷酸与AFP结合后所形成的复合物在毛细管柱中的迁移率不同于未与靶分子结合的寡核苷酸，因此与AFP特异性结合的寡核苷酸被分离出来，收集与AFP结合的寡核苷酸，常规PCR扩增，制备单链DNA文库，文库纯化后用于下一轮筛选。
[0011]所述常规PCR扩增条件为:94°C, 3 min ；94 °C, 30 s，58 °C，30 s，72 °C，30 s，扩增10个循环；72 °C, 5 min。扩增循环数的确定应在预实验中进行优化,选取条带亮度和特异性好的循环数。
[0012]所述单链DNA文库制备方法包括以下步骤:在链霉亲和素偶联的磁珠中加入常规PCR扩增产物，常温孵育，通过双链DNA上的生物素与磁珠上的链霉亲和素的相互作用将双链DNA吸附到磁珠表面，洗涤磁珠后加入碱液，常温变性，含有单链DNA的上清液用弱酸中和，产物PAGE切胶纯化。
[0013]所述的SELEX筛选的次数为4次。
[0014]所述的磁珠与PCR产物的孵育时间控制在20-30 min，碱变性时间控制在5_10min。
[0015]本发明优点在于:
本发明提供的筛选方法依赖于毛细管电泳本身的高效性，由此每次分离都获得了具有强相互作用的寡核苷酸；其次，由于靶目标为自由态，不存在基质的干扰，不必为由基质引起的非特异作用而增加工作量。因此，常规筛选需要通过8~15次循环才能达到的选择性，本发明经过4次循环就可以实现，仅需2~4天即可完成。经毛细管电泳检测和免疫荧光验证，筛选到的aptamer能与AFP特异性结合。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]附图1是本发明实施例中毛细管电泳筛选AFP特异性aptamer的第一轮电泳图
-1'TfeP曰。
[0017]附图2是本发明实施例中毛细管电泳验证aptamer-273与AFP蛋白的结合能力及特异性的检测结果。
[0018]附图3是本发明实施例中免疫突光检测aptamer-273、Ant1-AFP、aptamer-Library对人肝癌细胞H印G2以及aptamer-273、Ant1-AFP对人肺癌细胞A549的结合能力及特异性的检测结果。
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明，实施例中未详细说明的操作步骤请参阅《分子克隆》及所用试剂的说明书。
[0020]实施例1核酸适配体的筛选
1.仪器与材料:p/ACE MDQ毛细管电泳仪(美国Beckman-Coulter公司),配备二极管阵列(PDA)和激光诱导荧光(LIF)检测器；PVA涂层弹性石英毛细管柱全长40 cm，有效长度30 cm,内径 50 μ m,外径 360 μ m。
[0021]2.电泳缓冲液配制:使用超纯水配制30 mM NaH2PO3，用I M NaOH溶液调节pH值至7.5, 0.45 μ m滤膜过滤。
[0022]3.设计并合成全长75个碱基的随机寡核苷酸文库，序列如SEQ ID N0.1所示，5’ -GTGACGCTCCTAACGCTGAC-35N-CCTGTCCGTCCGAACCAATC-3’，其中两端分别为 20 个碱基的固定序列，中间35个碱基为随机序列。
[0023]4.合成用于PCR扩增的上游引物和下游引物，序列为:
上游引物 5’-GTGACGCTCCTAACGCTGAC-3’ (SEQ ID N0.2),
下游引物 5’-B1tin-GATTGGTTCGGACGGACAGG-3’ (SEQ ID N0.3)。
[0024]5.寡核苷酸文库和AFP标准溶液的配制:使用超纯水溶解寡核苷酸文库，浓度为10 μ M ;使用PBS配制AFP标准溶液，浓度为0.1 mg/ml。
[0025]6.毛细管电泳分离条件:电泳缓冲液为30 mM NaH2PO3^pH 7.5 ;PVA涂层毛细管柱内径50 μπι,全长度40 cm,有效长度30 cm;分离电压_8 kV,加压34 mbar ;温度25 V ;压力34 mbar进样随机寡核苷酸文库与AFP混合物(体积比1:1) 10 s ;检测波长256 nm。电泳结果如图1所示，收集游离寡核苷酸峰后至蛋白峰间的结合寡核苷酸。
[0026]新毛细管在使用前需用超纯水水化10 min。每次开机运行前依次以超纯水和电泳缓冲液依次冲洗5、10 min，每针样品间分别用超纯水和电泳缓冲液依次冲洗5、5 min。每进样3次更换I组电泳缓冲液。实验结束后，使用超纯水冲洗10 min，然后将毛细管两端保存于超纯水中。
[0027]7.常规PCR扩增:取步骤6中收集到的与AFP结合的寡核苷酸进行扩增，扩增条件为:94 °C, 3 min ；94 °C, 30 S，58 °C, 30 S，72 °C, 30 S，扩增 10 个循环；72 °C，5 min。
[0028]8.制备单链DNA文库:取100 μ I链霉亲和素偶联的磁珠置于磁力架上，吸去上清，用 500 μ I B&ff Buffer (5 mM Tris-HCl, pH 7.5,0.5 mM EDTA, I M NaCl)洗涤 2 次，去上清。将步骤7中获得的PCR扩增产物加入磁珠中，常温孵育20 min,通过双链DNA上的生物素与磁珠上的链霉亲和素的相互作用将双链DNA吸附到磁珠表面。用500 μ I B&ffBuffer洗涤磁珠3次，去上清。加入150 mM NaOH溶液100 μ 1，常温变性5 min,收集上清。上清用150 mM HAc溶液中和，中和产物PAGE切胶纯化，纯化产物用于下一轮筛选。
[0029]9.根据步骤6、7、8循环4次，富集能与AFP特异性结合的寡核苷酸。
[0030]实施例2核酸适配体的克隆与测序
在微量离心管中配制下列溶液，全量为5 μ I:pMD19-T Vector I μ 1，寡核苷酸PCR产物 0.2 pmol，ddH20 补充至 5 μ I。加入 5 μ I 的 Solut1n I。16 °C 反应 30 min。全量(10 μ I)加入至100 μ I Trans5 α感受态细胞中，冰中放置30 min。42 °C加热45 s后，再在冰中放置I min。加入890 μ I LB培养基，37 1:振荡培养60 min。在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上37 °C培养，形成单菌落。挑选白色单克隆菌落至2 mlLBCAmp 80 μ g/ml)液体培养基中，200 rpm、37 °〇振荡培养16 h，菌液交由上海生工测序。
[0031]实施例3核酸适配体的验证
测序得到83条寡核苷酸序列。对测序结果进行整理和结构预测，选出14条结构具有代表性的序列进行毛细管电泳分析，从中挑选出I条特异性高的序列aptamer-273。
[0032]Aptamer-273 的序列如 SEQ ID N0.4 所不。
[0033]考察1:毛细管电泳检测本实施例中荧光标记aptamer-273与AFP蛋白的结合特异性。
[0034]电泳缓冲液为30 mM NaH2PO3^ pH 7.5，AFP 浓度为 0.1 mg/ml, aptamer 浓度为 10μ M。PVA涂层毛细管柱内径50 μ m，全长度40 cm，有效长度30 cm;分离电压_8 kV，加压34 mbar ;温度25 V ;压力34 mbar进样荧光(FAM)标记的aptamer-273与AFP混合物(20:1)10 s;LIF检测器488 nm激发，520 nm发射。检测到AFP蛋白出峰时间处AFP特异性aptamer产生的信号峰。峰面积大于10倍性噪比，即认定为特异性结合峰。采用不加入AFP蛋白的FAM标记的aptamer-273作为阴性对照。检测结果如图2显示:本实施例的适配体aptamer-273能与AFP特异性结合,在AFP极端稀释的情况下仍具有极强的检测定量能力，能有效检测到极低浓度的AFP蛋白。
[0035]考察2:免疫荧光检测本实施例中荧光标记aptamer-273与H印G2细胞的结合能力及特异性。
[0036]在玻底皿中分别培养人肝癌细胞!fepG2和人肺癌细胞A549(阴性对照)，4%多聚甲醛室温固定 30 min，PBS 洗 3 次，5 % BSA 封闭 30 min,与 500 nM FAM 标记的 aptamer-273(Library)室温孵育60 min (aptamer用I % BSA稀释)，PBS洗3次，DAPI染色细胞核30 s，PBS洗3次，观察绿色荧光信号及其定位。检测的同时以抗AFP抗体作为阳性对照，比较aptamer与抗体识别AFP能力的差异。检测结果如图3所示:本实施例的适配体aptamer-273能够识别人肝癌细胞H印G2中表达的AFP，而对无AFP表达的人肺癌细胞A549没有信号显不；同时，未经筛选的aptamer-Library在HepG2细胞中也没有信号显不,表明筛选到的aptamer-273具有特异性；与抗体相比，分子量小的aptamer-273更容易进入细胞，绿色荧光信号更强。
[0037]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法，其特征在于，所述的筛选方法包括以下步骤:设计并构建大容量随机寡核苷酸文库以及用于PCR扩增的上游引物和下游引物，通过以毛细管电泳为基础的SELEX方法，富集能与甲胎蛋白结合的寡核苷酸，最终经克隆、测序以及验证后得到与甲胎蛋白特异性结合的寡核苷酸，即适配体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的随机寡核苷酸文库以及上、下游引物序列为: 核苷酸文库的序列如SEQ ID N0.1所示； 物的序列如SEQ ID N0.2所示； 物的序列如SEQ ID N0.3所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的以毛细管电泳为基础的SELEX方法包括以下步骤:随机寡核苷酸文库与甲胎蛋白共同孵育，混合物进行毛细管电泳，收集与甲胎蛋白结合的寡核苷酸，常规PCR扩增，制备单链DNA文库，文库纯化后用于下一轮筛选。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述常规PCR条件为:94°C, 3 min ；94°C, 30 S，58 °C, 30 S，72 °C, 30 S，扩增 10 个循环；72 °C，5 min。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述单链DNA文库制备方法包括以下步骤:在链霉亲和素偶联的磁珠中加入常规PCR扩增产物，常温孵育，通过双链DNA上的生物素与磁珠上的链霉亲和素的相互作用将双链DNA吸附到磁珠表面，洗涤磁珠后加入碱液，常温变性，含有单链DNA的上清液用弱酸中和，产物PAGE切胶纯化。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的SELEX筛选的次数为4次。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的磁珠与PCR产物的孵育时间控制在20-30 min，碱变性时间控制在5-10 min。
【文档编号】C12Q1/68GK104131105SQ201410390057
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月11日 优先权日:2014年8月11日
【发明者】吴伟忠, 胡洪卫, 郭玮, 冬黎黎, 谈绮文 申请人:复旦大学附属中山医院, 上海艾津生物医药科技有限公司