用于检测无细胞的病原体特异性核酸的方法和试剂盒的制作方法

用于检测无细胞的病原体特异性核酸的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种用于检测受试者中的病原体的靶核酸的方法。该方法包括(a)扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且产生双链DNA，并且(b)检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。还提供了用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的试剂盒。
【专利说明】用于检测无细胞的病原体特异性核酸的方法和试剂盒
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年4月I日提交的申请号为61 / 470774的美国临时专利申请的优先权，其内容均通过引用全部并入本文，并可用于所有目的。
[0003]发明的【技术领域】
[0004]本发明总体涉及用于检测受试者中病原体的特异性核酸的方法和试剂盒。
[0005]发明背景
[0006]许多病原体的感染都会引起严重的疾病。对病原体的早期检测在和这些病原体相关的疾病的诊断和治疗中起重要作用。结核病是一种由各种分枝杆菌菌株(通常为一种结核杆菌)引起的常见感染性疾病。这种感染性疾病在许多情况下是致命的。结核病的明确诊断是通过微生物采样培养以识别在临床样本(如痰或脓)中的结核分枝杆菌而得出。其他测试，如放射显影(如，胸部X光检查)，结核菌素皮肤试验，以及伽玛干扰素释放试验(IGRA)可以得出一个非确定性的诊断。
[0007]聚合酶链式反应(PCR)技术已被用于检测样本(例如痰,尿，胃液抽吸物,脑脊液，胸膜液，血，并脓肿，骨髓，活检样本，切除的组织或支气管活检材料)中的结核分枝杆菌(TB)，以提供结核病的早期诊断。已经有报道在一项研究中从所有8例确诊的肺结核患者的外周血白细胞里检测到结核分枝杆菌的DNA。而在另一项研究中，41例确诊的结核病患者中有39例检测到结核 分枝杆菌的DNA。请参见Schluger等，Lancet344:232-3 (1994)；Cordos等，Lancet347:1082-5 (1996)。然而，这些实验的结果遭到了其他使用血液PCR检测结核病的研究人员的批评。参见，Kolk 等，Lancet344:694(1994) ;Palenque 等,Lancet344:1021(1994) ;Aguado等，Lancet347:1836-7(1996)。虽然在过去二十年中已经为使用“血液结核分枝杆菌PCR”方法检测结核病作出了巨大努力，但仍只获得了非常有限的成功。
[0008]在体内，大部分的核酸(如DNA和RNA)都存在于细胞内，但是也有少量的核酸被发现自由流动于个体的血浆中。这些DNA和RNA分子被认为是由接近死亡的细胞在分解过程中释放到血液中的。
[0009]通过检测来源于DNA病原体的靶RNA可以区分潜伏性感染和活动性感染。例如，通过检测来源于结核分枝杆菌(TB)的靶RNA可以区分活动性结核感染和潜伏性结核感染并用于结核病的诊断。循环核酸(CNA)是在血液中发现的DNA或RNA。自从可以通过孕妇外周血检测胎儿DNA，已经可以在宿主外周血中检测来源于肿瘤、异种移植、器官移植和寄生虫的无细胞DNA和RNA。作为一种非侵入性诊断方法，CNA检测已被尝试应用于各种临床状况的诊断。但是，它还没有被成功应用于高灵敏度和高特异性地检测病原体特异性循环核酸。
[0010]因此，仍然需要一种具有高灵敏度和高特异性的用于检测个体内病原体(例如，结核分枝杆菌)的早期检测方法。
[0011]发明概述
[0012]本发明涉及用于检测受试者中无细胞的病原体特异性核酸的方法及相关的检测试剂盒。[0013]根据本发明的一个方面，提供了一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的方法。该方法包括扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且由此产生双链DNA。该方法进一步包括检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。所述无细胞组分优选为血清，血浆，胸腔积液，或CSF，更优选为血清或血衆。
[0014]所述病原体可以选自以下组:细菌，真菌和寄生虫。优选地，所述病原体是结核分枝杆菌(TB)。
[0015]所述靶核酸可以是DNA或RNA。靶核酸的核酸序列可以是来源于结核分枝杆菌(TB)H37Rv 的 DNA，例如，所述 DNA 序列选自以下组:IS6110, IS1084, MPT64, rrs, esat6，类esat6, MDR, rpoB, katG, iniB 和它们的片段。
[0016]所述双链DNA可以少于100个碱基，优选为40_60个碱基。
[0017]所述来源于受试者的血液样本的量可以为0.2-10毫升，优选为2-5毫升。
[0018]所述靶核酸的核酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，转录介导的扩增技术(TMA)，或连接酶链式反应(LCR)进行扩增。优选地，所述核酸序列通过PCR扩增。
[0019]所述双链DNA可用检测试剂进行检测。检测试剂可以是荧光标记的探针(例如，Taqman探针,分子信标(Molecular beacon),或蝎型探针(Scorpin),嵌入性突光染料或延伸发光(Light Upon Extension) (LUX)引物。优选地，所述检测试剂是嵌入性突光染料。所述嵌入性荧光染料可以选自以下组:SYBR绿，CytoGreen, Eva Green, Β0ΧΤ0和SYT09。
[0020]该方法还可以进一步包括浓缩在无细胞组分中的所述靶核酸。
`[0021]该方法可以进一步包括从血液样本中制备所述无细胞组分。
[0022]该方法可以进一步包括在受试者中诊断结核感染。该结核感染可以是活动性的或潜伏性的。
[0023]根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的试剂盒。该试剂盒包含一种或多种用于扩增所述靶核酸序列以产生双链DNA的试剂或材料，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分。该试剂盒进一步包含了一种或多种用于检测所述双链DNA的试剂或材料。所述病原体可以选自以下组:细菌，真菌和寄生虫。优选地，所述病原体是结核分枝杆菌(TB)。所述靶核酸可以是DNA或RNA。靶核酸的核酸序列可以是来源于结核分枝杆菌(TB)H37Rv的DNA，例如，所述DNA序列选自以下组:IS6110, IS1084, MPT64, rrs, esat6，类 esat6，MDR, rpoB, katG, iniB 和它们的片段。
[0024]所述一种或多种用于扩增靶核酸序列的试剂或材料包括一对引物，并且所述双链DNA具有40-60个核苷酸。所述引物可以具有序列GGTCAGCACGATTCGGAG(SEQ ID NO:1)和GCCAACACCAAGTAGACGG(SEQ ID NO:2)。
[0025]所述一种或多种用于检测所述双链DNA的试剂或材料包括荧光标记的探针(例如，Taqman探针，分子信标，或蝎型探针)，嵌入性荧光染料或延伸发光(LUX)引物。优选地，所述检测试剂是嵌入性荧光染料。所述嵌入性荧光染料可以选自以下组=SYBI^lCytoGreen, Eva Green, Β0ΧΤ0 和 SYT09。
[0026]附图的简要说明
[0027]图1显示了使用TB基因组DNA作为模板的短qPCR产物的㈧扩增曲线和⑶熔解曲线。
[0028]图2显示了用于检测猴血浆中TB的短qPCR产物的(A)扩增曲线和⑶熔解曲线。
[0029]图3显示了用于检测人个体血浆中TB的短qPCR产物的(A)扩增曲线和⑶熔解曲线。所述人个体的血浆来源于6例被确诊感染结核(TB，箭头A)或2例没有临床诊断为肺结核(非结核，箭头B)的个体。
[0030]图4显示了用于检测人个体样本中TB的短qPCR产物的㈧扩增曲线和⑶熔解曲线。所述人个体样本来源于胸腔积液的无细胞组分(箭头A)和沉淀物(箭头B)。
[0031]图5显示了用于检测两例被确诊感染TB的人个体(A和B)样本中TB的短qPCR产物的(A)扩增曲线和(B)熔解曲线。所述人个体样本分别来源于A和B的血浆的无细胞组分(PS)和CSF。
[0032]本发明的具体描述
[0033]本发明基于一种新的核酸扩增试验(NAAT)，该试验可以用于检测受试者中的来源于病原体如结核分枝杆菌的靶核酸。本发明提供了用于检测受试者中来源于病原体的靶核酸的方法。该方法包括扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且由此产生双链DNA。该方法进一步包括检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。
[0034]所述受试者可以是动物,包括哺乳动物,例如,人,小鼠，牛，马，鸡，狗，猫和兔子。该动物可能是农业动物(如马，牛，鸡)或宠物(例如狗和猫)。受试者优选是人或小鼠，更优选为人。受试者可以是男性或女性。该受试者也可能是一个新生儿，儿童或成人。受试者可能已经患有某种疾病或医疗状况或对某种疾病或医疗状况易感。
[0035]病原体可以选自以下组:细菌，寄生虫和真菌。所述细菌可能是布鲁氏菌，梅毒，结核分枝杆菌，李斯特菌，军团菌，幽门菌，链球菌，奈瑟氏菌，梭状芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌或芽孢杆菌，更优选为梅毒螺旋体，结核杆菌，麻风杆菌，李斯特菌，嗜肺军团杆菌，幽门螺旋杆菌，肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟菌，梭状芽孢杆菌诺氏梭菌，肉毒杆菌，金黄色葡萄球菌和炭疽芽孢杆菌，最优选地，结核分枝杆菌。所述寄生虫可能是滴虫，弓形体，贾第虫，隐孢子虫，疟原虫，利什曼原虫，锥虫，阿米巴，血吸虫，丝虫，Ascaria，或肝片吸虫；更优选阴道毛滴虫，弓形体，肠贾第鞭毛虫，隐孢子虫麦穗鱼，疟原虫，利什曼原虫，克氏锥虫，阿米巴，血吸虫，丝虫，Ascaria和肝片吸虫。
[0036]本说明书使用的术语“核酸”是指包含两个或更多个核苷酸的多核苷酸。它可以是DNA或RNA。“变体”核酸是指一多核苷酸，该多核苷酸具有至少一个核苷酸修饰，例如，缺失，插入，或替代，除此之外的其他部分具有与它的原始核酸相同的核苷酸序列。所述变体可以具有至少约80 %，90 %，95 %或99 %，优选至少约90 %，更优选至少约95 %，与原始核酸相同的核苷酸序列。
[0037]本说明书所使用的“来源于”一词是指一种起源或来源，并且可以包括天然存在的，重组的，未纯化的或纯化的分子。来源于原始核酸的核酸可以包括原始核酸的部分或全部，也可以是原始核酸的片段或变体。
[0038]根据本发明的方法，“靶核酸”是一种待检测的核酸，DNA或RNA。来源于一个生物体的靶核酸是指一多核苷酸，其具有来源于该生物体的特定的序列。来源于病原体的靶核酸是指一多核苷酸，其具有来源于该特定病原体的多核苷酸序列。例如，靶核酸可以来源于结核分枝杆菌(TB)的H37Rv菌株，并包括特定于H37Rv菌株的序列。合适的结核分枝杆菌H37Rv 菌株的特定序列的例子包括 156110，151084，]\0^64，1^8，683七6，类683七6，]\?1?，印08，katG, iniB和它们的片段。靶核酸可以是任意长度的，优选具有约30-150个核苷酸，优选约40-100个核苷酸。
[0039]生物样本可以是从受试者获得的任何样本。生物样本的实例包括体液，细胞和组织。体液可以是血清或血浆，粘液(包括鼻腔引流和痰)，腹膜液，胸膜液，胸腔液，唾液，尿，滑液，脑脊髓液(CSF)，胸腔液，腹液，腹水，或心包积液。优选地，所述生物样本是血液样本。来源于受试者的生物样本可以是任意量，例如为约0.2-10毫升，优选大约0.5-10毫升，更优选约2-10毫升，最优选约2-5毫升。无细胞组分优选血清，血浆，胸腔积液，或CSF，更优选为血清或血衆。
[0040]本说明书所用的生物样本的“无细胞组分”的术语是指生物样本中基本不含细胞的部分。术语“基本上不含细胞”在本文中是指从生物样本中制备的含有少于每毫升约20，000个细胞的组分，优选少于每毫升大约2000细胞，更优选少于大约每毫升200个细胞，最优选地少于大约每毫升20个细胞。无细胞组分可以基本上不含宿主基因组DNA。宿主基因组DNA是来源于受试者的DNA大片段(例如，大于约10，20，30，40，50，100或200kb)。例如，来源于受试者的生物样本中的无细胞组分可包含小于约1000纳克每毫升的基因组DNA，优选小于约100纳克每毫升，更优选小于约10纳克每毫升，最优选小于约I纳克每毫升。本发明的方法可以进一步包括从血液样本中制备所述无细胞组分。无细胞组分可以使用本领域中已知的常规技术来制备。例如,血液样本的无细胞组分可通过低速离心血液样本约3-30分钟获得，优选约3-15分钟，更优选约3-10分钟，最优选约3_5分钟。离心速度约 200-20，OOOg,优选约 200-10，OOOg,更优选约 200-5，OOOg,最优选约 350-4，500g。生物样本可以通过超滤以将细胞及细胞片段，与含有可溶性的DNA或RNA的无细胞组分分离开来。超滤一般使用一个0.22 微米的膜过滤器。
[0041]本发明的方法可以进一步包括浓缩(或富集)在无细胞组分中的所述靶核酸。浓缩靶核酸可以使用本领域中已知的常规技术，如在高盐浓度下的固相吸收，通过苯酚-氯仿有机萃取，接着用乙醇或异丙醇沉淀，或直接在高盐浓度下或70-80%乙醇或异丙醇中沉淀。浓缩后的靶核酸可以比在未浓缩无细胞组中高至少约2，5，10，20或100倍。不论是否浓缩，靶核酸都可以根据本发明的方法用于扩增。
[0042]靶核酸的序列可以用本领域中已知的各种方法扩增以产生双链DNA。例如，该序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，转录介导的扩增技术(TMA)，或连接酶链式反应(LCR)进行扩增。优选地，所述靶核酸的序列是通过实时定量PCR(qPCR)扩增。可以设计一对引物用于扩增靶核酸的目的序列，以产生具有期望长度的双链DNA。例如，该对引物可具有GGTCAGCACGATTCGGAG序列(SEQ ID NO:1)和GCCAACACCAAGTAGACGG (SEQ ID NO:2)。该双链 DNA 的长度可小于约 100，90，80，70，60，50，40或30个核苷酸。例如，所述双链DNA可以具有约30-70个碱基，优选为约40-60个碱基。
[0043]该双链DNA可通过本领域已知的各种技术来检测。例如，双链DNA可通过检测试剂进行检测。所述检测试剂选自以下组:荧光标记的探针(例如，Taqman探针，分子信标，或蝎型探针)，嵌入性荧光染料和延伸发光(LUX)引物。优选地，所述检测试剂是嵌入性荧光染料。所述嵌入性荧光染料可以是SYBR绿，CytoGreen，Eva Green，BOXTO和SYT09。[0044]本发明的方法可以进一步包括对所述靶核酸在受试者中的拷贝数进行定量。例如，靶核酸的序列可以通过实时PCR(qPCR)进行扩增。可以通过已知拷贝数的标准核酸和所检测到的荧光建立一个标准曲线。基于标准曲线，可以根据qPCR后荧光的水平来确定靶核酸的拷贝数。
[0045]本发明的方法可以进一步包括在所述受试者中诊断病原体感染。例如，所述病原性感染(例如，结核感染)可以是活动性的或潜伏性的。检测来源于病原体(如细菌，寄生虫或真菌)的RNA可以区分活动性感染和潜伏性感染。例如，通过检测来源于结核分枝杆菌(TB)的靶RNA可以区分活动性结核感染和潜伏性结核感染，从而有助于诊断活动性或潜伏性结核感染。该方法可以具有高灵敏度，例如，其灵敏度至少约50^,60^,70^,80%,90 %，95 %或99 %，优选至少约80 %，更优选至少约90 %，最优选至少约95 %。该方法可以具有高特异性，例如，其特异性至少约50 %，60 %，70 %，80 %，90 %，95 %或99 %，优选至少约80 %，更优选至少约90 %，最优选至少约95 %。
[0046]本发明还提供了各种检测试剂盒用于本发明的检测方法。本发明提供了一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的试剂盒。该试剂盒包含(a) —种或多种用于扩增所述靶核酸序列以产生双链DNA的试剂或材料，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，和(b) —种或多种用于检测所述双链DNA的试剂或材料。所述生物样本优选是血液样本。
[0047]在本发明的试剂盒中，所述一种或多种用于扩增的试剂或材料包括一对适于产生双链核酸的引物，该双链核酸的长度为约100，90，80，70，60，50，40或30个核苷酸。该双链DNA可具有约30-70个碱基对(bp)，优选40-60个碱基对。设计的引物可用于扩增病原体的特定靶序列。所述靶序列可以特定于结核分枝杆菌(TB)H37Rv，例如，选自IS6110，IS1084，MPT64，rrs, esat6，类esat6，MDR, rpoB, katG, iniB和它们的片段。例如，该对引物可具有序列 GGTCAGCACGATTCGGAG (SEQ ID NO:1)和 GCCAACACCAAGTAGACGG (SEQ ID NO:2)。
[0048]在本发明的试剂盒`中，所述一种或多种检测试剂或材料可以包括一种检测试剂，所述检测试剂选自以下组:荧光标记的探针(例如，Taqman探针，分子信标，或蝎型探针)，嵌入性荧光染料和延伸发光(LUX)引物。优选地，所述检测试剂是嵌入性荧光染料。所述嵌入性荧光染料可以是SYBR绿，CytoGreen, Eva Green, BOXTO和SYT09。
[0049]本发明的试剂盒可以进一步包含一种或多种用于从所述生物样本(如血液样本)中制备无细胞组分的试剂或材料。所述生物样本的量可以是，例如，大约0.2-10毫升，优选约0.5-10毫升，更优选约2-10毫升，最优选约2-5毫升。所述无细胞组分可以基本上不包含细胞，例如，少于每毫升大约20，000个细胞，优选少于每毫升大约2000细胞，更优选少于每毫升大约200个细胞，最优选地少于每毫升大约20个细胞。所述无细胞组分可以基本上不含宿主基因组DNA。宿主基因组DNA是来源于受试者的DNA大片段(例如，大于约10，20，30，40，50，100或200kb)。例如，来源于受试者的生物样本中的无细胞组分可包含小于约1000纳克每毫升的基因组DNA，优选小于约100纳克每毫升，更优选小于约10纳克每毫升，最优选小于约1.0纳克每毫升。
[0050]本发明的试剂盒可以进一步包括一种或多种用于从无细胞组分中分离或纯化靶核酸的试剂或材料。靶核酸可以比未浓缩无细胞组分中的相应成分浓缩至少约2，5，10,20或100倍。不论是否浓缩，靶核酸都可以根据本发明的方法用于扩增。[0051]本说明书所用术语“约”指在描述一个可测量的值，如数量，百分比等时，包括与指定值有±20%或±10%的变化，更优选为±5%，更优选±1%，更优选为±0.1%。只要这样的变化是合适的。
[0052]实施例1.引物设计
[0053]所有检测结核病的引物都使用设计程序Primer3 (http: / / frod0.w1.mit.edu / )设计。特异性互补于结核菌基因组DNA的引物的设计参考了完整的结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组(GenBank登录号NC000962)。特异性互补于人基因组DNA的引物的设计则参考了 GenBank中的人类基因组序列。
[0054]所有用于扩增特定的结核病分枝杆菌H37rv菌株的不同大小的扩增子的引物，都经过SYBR qPCR反应进行优化，然后进行熔解曲线分析。它们可以通过琼脂糖凝胶(3% )电泳进一步验证产物具有正确的大小而且没有非特异性的DNA产物或引物二聚体。示范性的结核菌引物列于表1中。
[0055]表1.结核菌引物示例
【权利要求】
1.一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的方法，包括 (a)扩增靶核酸序列，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，并且产生双链DNA，并且 (b)检测所述双链DNA，其中所述双链DNA的存在指示所述靶核酸在受试者中存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述无细胞组分是血清。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述无细胞组分是血浆。
6.根据权利要求1的方法，其中所述病原体是结核分枝杆菌(TB)。
7.根据权利要求1的方法，其中所述核酸序列来源于结核分枝杆菌(TB)H37Rv的DNA序列，所述 DNA 序列选自以下组:IS6110, IS1084, MPT64, rrs, esat6,类 esat6, MDR, rpoB,katG，iniB和它们的片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链DNA具有40-60个碱基。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样本的体积为0.2-10毫升。
10.根据权利要求1所 述的方法，其中所述核酸序列由聚合酶链式反应(PCR)扩增。
11.根据权利要求1的方法，其中双链DNA是由检测试剂检测，所述检测试剂选自以下组:荧光标记探针，嵌入性荧光染料和延伸发光(LUX)引物。
12.根据权利要求11的方法，其中嵌入荧光染料选自以下组:SYBR绿，CytoGreen，EvaGreen, BOXTO 和 SYT09。
13.根据权利要求1所述的方法，还包括浓缩在无细胞组分中的所述靶核酸。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括从血液样本中制备所述无细胞组分。
15.根据权利要求1所述的方法，还包括在所述受试者中诊断结核感染。
16.根据权利要求15的方法，其中所述结核病感染是活动性的。
17.根据权利要求15的方法，其中所述结核病感染是潜伏性的。
18.一种用于检测来源于受试者中病原体的靶核酸的试剂盒，包含 (a)一种或多种用于扩增所述靶核酸序列以产生双链DNA的试剂或材料，其中所述靶核酸来源于受试者血液样本的无细胞组分，和 (b)一种或多种用于检测所述双链DNA的试剂或材料。
19.根据权利要求18的试剂盒，其中所述一种或多种用于扩增靶核酸序列的试剂或材料包括一对引物，其中所述双链DNA具有40-60个核苷酸。
20.根据权利要求18的试剂盒，其中所述病原体是结核分枝杆菌(TB)。
21.根据权利要求18的试剂盒，其中所述核酸序列来源于结核分枝杆菌(TB)H37Rv的DNA 序列，所述 DNA 序列选自 156110，151084，]\0^64，1^8，68&七6，类68&七6，]\?1?，印08，1?^6，iniB和它们的片段。
22.根据权利要求18的试剂盒，其中所述一种或多种用于检测所述双链DNA的试剂或材料包括一种嵌入荧光染料。
【文档编号】C12Q1/68GK103814139SQ201280026842
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年4月2日 优先权日:2011年4月1日
【发明者】钱明伟 申请人:澳康姆生物实验室公司