专利名称：检测尿液中病毒特异性核酸的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及跨肾病毒核酸在制备用于诊断病毒感染的药物中的用途。还涉及检测跨肾病毒存在的试剂盒。
背景技术：
目前存在三种类型的体外诊断系统，广泛用于检测病原体。这些是生物样品的病原体的直接培养；基于传染剂产物或抗原检测的免疫测定；和可以检测传染过程中对抗传染剂产生的抗体的间接免疫测定。在第一个系统中，主要缺陷是认为生物样品存在传播病原体的危险。在第二个和第三个系统中，缺陷包括样品提取，这通常是入侵性的并在收集时可能是传染性样品。在第三个系统中，一个主要的缺陷是在过去和现在传染之间通常存在很小的区分可能性。最近，基于取自个体的血液或血浆样品，或细胞培养物中的病原体核酸检测，已经产生了分子诊断方法。这些测定通常比免疫测定灵敏得多。然而，它们需要特定设备和专业人员的存在。此外，生物样品——在血浆、血液或细胞培养物的情况中——难以存储而没有发生变化，除非在受控的温度条件下，并且认为对操作人员是有生物危害性的。最近，已经描述了基于跨肾(transrenal)DNA(Tr-DNA)的分子诊断方法，用于监控异源移植的进展、诊断胎 儿的性别和检测肿瘤标记的存在。(Botezau等，ClinicalChemistry 46(8) :1078-84(2000) ;Su 等，Ann. NY Acad. Sc1. 1022 :81-89 (2004))。例如，U.S.专利No. 6，251，638描述了在怀孕妇女尿液中检测男性胎儿DNA的分析方法。U.S.专利No. 6，287，820描述了目的在于诊断肿瘤的系统，特别是结肠和胰腺的腺癌。U.S.专利No. 6, 492, 144教导了可以用于监控异源移植进展的Tr-DNA核酸分析方法。Al-Yatama等(2001)中，Prenat Diagn, 21 :399-402 ;和 Utting，Μ.等(2002)，Clin Cancer Res, 8 35-40o Keiko Koide,等，Prenat Diagn, 2005 ;25 :604-607 ;Mengiun Wang,等，ClinicalChemistry, 2004, 50 :211-213 ；Y. -H. Su，等，J. Mol. Diagn.，2004，6 :101-107 中还描述了跨肾DNA以小于1000个碱基对的核酸片段的形式存在于尿液中。已经将跨肾DNA的存在解释为凋亡现象的结果。在凋亡或程序化细胞死亡的过程中，核DNA分裂成核小体和寡聚物，其随后，作为凋亡过程的一部分，被吞噬并从生物体中排出。(Umansky, S. R.,等(1982) ;Biochim. Biophys. Acta, 655 :9_17)。尽管该降解 DNA的一部分避开了吞卩遼作用，但出现于血流中(Lichtenstein, A. V.等(2001), Ann NY AcadSci, 945 :239-249),并且，如上述提及的专利中所证实的，也存在于尿液中。在本申请之前，还没有描述尿液中存在来源于尿道外来源的病毒DNA。已经表明了从血浆中转染细胞基因组释放的病毒DNA的循环。例如，在鼻咽癌个体的血浆中检测到EB病毒 DNA 的片段(Chan, K. C.，等(2002)，Cancer Res 63 :2028-2032)。此外，在宫颈癌个体的血浆中已经检测到人乳头状瘤病毒(HPV)的病毒DNA(Pornthanakasem，W.，等(2001)；BMC Cancer 1:2)。然而，在个体尿液中没有检测到这些病毒DNA。本发明描述了通过检测个体尿液中那些病原体的DNA序列来检测个体中病毒病原体存在的方法。
发明内容
本发明涉及通过检测和定量个体尿液中跨肾病毒(transrenal virus)核酸特异性序列来诊断和监控个体病毒感染的方法。一实施方案中，核酸是分离的或纯化的。可以使用化学或物理方法来进行该纯化。这些方法包括有机溶剂提取、过滤、沉淀、具有核酸亲和性的固体基质的吸附和色谱。这些方法中使用的固体基质可以由硅胶基的树脂、离子交换树脂或羟磷灰石构成。另一个实施方案中，固体基质是硅胶基树脂，且所述分离和纯化在离液剂(chaotropic agent)存在下进行。另一个实施方案中，将一种或多种抑制核酸降解的试剂加入尿样中。这些试剂包括离子螯合剂、变性剂和离子去污剂。本发明方法中使用的离子螯合剂实例是EDTA。本发明方法中使用的变性剂实例是盐酸胍或异硫氰酸胍。本发明方法中使用的离子去污剂实例是N-月桂酰肌氨酸或十二烷基硫酸钠。一实施方案中，将分离或纯化的核酸用于病毒核酸的检测。另一实施方案中，该方法还包括尿样的分级分离，例如，通过离心或过滤，从细胞体相连的部分分离出无细胞级份。使用以下技术中的一种来进行核酸的分析核酸杂交、循环探针反应、聚合酶链式反应、巢式聚合酶链式反应(PCR)、半巢式PCR、单链构象多态性、连接酶链式反应、链置换扩增和限制性片段长度多态性。另一实施方案中，使用一个或多个HIV-1 GAG或POL基因特异性的引物来进行PCR。这些引物的实例在说明书中描述为SEQ ID NO =1-1l0`
另一实施方案中，病毒核酸大小小于约lOOObp。优选实施方案中，病毒核酸为约100至约200bp大小。本发明的方法适用于所有病毒病原体，包括RNA、DNA、游离基因和整合病毒。它们还适用于重组病毒，如基因治疗中使用的腺病毒或慢病毒。特别地，该方法适用于以下病毒逆转录病毒，包括重组的和天然的HIV-1、HIV-2，天花病毒，脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)和腺病毒(AAV)。一些实施方案中，病毒剂是EB病毒(EBV)和HIV-1。一实施方案中，本发明的方法是在体外进行的。另一实施方案中，本发明涉及监控个体病毒感染的方法，包括以下步骤定量所述个体第一次尿样中跨肾病毒核酸的含量；定量所述个体第二次尿样中所述跨肾病毒核酸的含量；和比较所述个体所述第一次和所述第二次尿样中所述跨肾病毒核酸的含量，因此监控所述个体中的所述病毒感染。该实施方案的另一方面中，该方法进一步包括将减轻或抑制所述病毒感染的化合物给药于所述个体的步骤。任选地，病毒感染是HIV感染和所述化合物是抗病毒剂。该实施方案的另一方面中，通过选自以下的方法来进行定量与那些病原体特异性的分子探针配对、杂交、PCR、巢式PCR、半巢式PCR、SSCP、LCR和SDA。该实施方案的另一方面中，该方法进一步包括将所述尿样分离成含有所述跨肾核酸的无细胞级份的步骤。可以使用离心来进行该分离。该实施方案的核酸为100至200bp。该实施方案的另一方面中，个体处于产生重复病毒感染的风险中。
另一实施方案中，本发明涉及用于检测尿液中病毒核酸的试剂盒，该试剂盒包括用于从尿液分离和/或提取跨肾病毒核酸的试剂和/或材料、DNA探针或至少一种病毒剂特异性寡核苷酸对(引物)。该实施方案的一方面中，探针是HIV-1 GAG或POL基因特异性的用于PCR反应的引物。这些引物的实例在说明书中描述为SEQ ID NO =1-1l0除非另外限定，在此使用的所有技术和科学术语具有本发明涉及领域中普通技术人员通常理解的相同含义。尽管在本发明的实践和实验中可以使用在此所述那些相似或相等的方法和材料，以下描述了合适的方法和材料。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以其整体引入作为参考。在冲突的情况中，将以本说明书为准，包括定义。此外，材料、方法和实施例只是说明性的并不是用来限制。本发明的其他特征和优势将从以下的详述和权利要求变得清楚。
图1是摄影图像，显示了通过感染HIV-1个体的非分级尿样的跨肾DNA的巢式PCR获得的扩增产物的凝胶电泳的结果(使用468/602引物对[134bp]的20个循环，接着使用518/596 [79bp]的35个循环)。引物是HIV-1GAG片段特异性的。图2是摄影图像，显示了通过从8E5 LAV细胞提取的基因组DNA的巢式PCR获得的扩增产物的凝胶电泳的结果(使用468/602引物对[134bp]的20个循环，接着使用518/596 [79bp]的35个循环)。引物是HIV-1GAG片段特异性的。图3是摄影图像，显示了通过感染HIV-1个体尿样的跨肾DNA的巢式PCR获得的扩增产物的凝胶电泳的结果(CP :全部；SN :上清液；PT :沉淀)。A-102bp/60bp(HIV-l POL片段的特异性引物);B-317bp/60bp(P0L特异性的);C_569bp/132bp (TAT特异性的)；NI 非感染的；IN 1-3 :感染HIV的个体。
具体实施例方式为了本发明，提供现在的定义扩增子任何相对小的DNA片段的术语，例如通过PCR复制的。扩增可以在体内或体外发生的特定DNA片段的拷贝数量的增加。凋亡细胞健康和状况的年龄或状态支配时正常起作用的人和动物细胞的程序化细胞死亡。需要垂死细胞的代谢活动的活性过程，特征在于DNA分裂成片段，获得所谓核小体大小的DNA片段及其寡聚物的阶梯模式。离液(Chaotropic):干扰水热力学结构的化学物质(例如，离子，如SCN_、C104_和胍)的特性。这使得较小极性和较大疏水性物质在水中变得更可溶。在生物水平的效果是蛋白质的变性。游离基因可以独立于细胞染色体复制或作为染色体的一部分整合和复制的环状DNA分子。基因含有编码mRNA和控制那些序列表达必需的序列的DNA片段。基因组在真核生物中，染色体结构包围的生物体的一整套基因。循环探针反应在恒定的特定温度下进行CPT反应，这使得嵌合探针与其互补的单链目标DNA杂交。在所得到的目标-探针双链体内，RNase H识别DNA-RNA杂交体并特异性地分裂探针的RNA部分。分裂的片段在反应温度不稳定并且从目标分离出来。目标然后与另一个探针分子自由杂交，重复该循环。探针片段累积，作为目标检测的基础。随着时间，分裂探针片段的累积遵循线性动力学并因此可以定量目标的含量。杂交广泛使用的技术，其利用了单链DNA或RNA互补序列相互配对来形成双链体的能力。杂交可以发生在两个互补DNA序列之间，单链DNA和互补RNA之间，或两个RNA序列之间。使用该技术来检测和分离特定序列，测量同源性，或限定一条或两条链的其他特征。感染身体组织中的微生物入侵和扩增，其可以在临床上是不明显的或由于竞争性代谢、毒素、胞内复制或抗原抗体应答导致局部细胞损伤。连接酶链式反应与PCR相似的DNA扩增方法。LCR不同于PCR，因为其扩增探针分子而不是通过核苷酸的聚合产生扩增子。每条DNA链使用两个探针并连接在一起来形成单个探针。LCR使用DNA聚合酶和DNA连接酶来驱动反应。和PCR —样，LCR需要热循环仪来驱动反应，每个循环导致目标核酸分子的倍增。LCR可以具有比PCR更大的特异性。巢式PCR :使用最初内部的引物在早些PCR产物上进行的第二种PCR。这显著提高了 PCR的灵敏度和特异性。巢式引物使用第一个PCR循环获得的扩增子内部的选定引物。使用至少一个巢式引物的扩增过程提高了特异性，因为第一个循环的非特异性产物在第二个循环中没有得到扩增。核酸通过3’5’磷酸二酯键连接的核苷酸的线性聚合物。在DNA (脱氧核糖核酸)中，糖基是脱氧核糖，核苷酸的碱基是腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶。RNA (核糖核酸)具有核糖作为糖和尿嘧啶替代胸腺嘧啶。DNA作为碱基序列形式的遗传信息的稳定存储。RNA在一些病毒中具有相似的功能，但更常见的是，在结构能力中，作为信息媒介(mRNA)、氨基酸的转运者(tRNA)，或在一些新发现的情况中，作为酶。
寡核苷酸/多核苷酸通过磷酸二酯键连接的两个或多个核苷酸的线性序列。超过约20个核苷酸长度时，通常使用术语“多核苷酸”。病原体病原体是可以引起宿主疾病的生物物质。病原体的同义词是“传染剂”。术语“病原体”最常用于破坏多细胞生物体的正常生理学的物质。沉淀沉淀物，细胞存在时，通常包括细胞级份，或可以通过离心生物样品获得。聚合酶核酸扩增中使用的酶。该术语包括各种DNA聚合酶的变体。引物短的预先存在的多核苷酸链，通过DNA聚合酶可以将新的脱氧核糖核苷酸添加至该链上。PCR:涉及两个合成寡核苷酸引物的聚合酶链式反应，这两引物与待扩增的目标DNA的两个片段是互补的(每条链一个)，在过量的脱氧核苷酸和Taq聚合酶(一种热稳定性DNA聚合酶)存在下，添加至目标DNA(不需要是纯的)。在一系列(通常30个)的温度循环中，目标DNA重复变性(约90°C )、与引物退火(通常60°C )和子链从引物的延伸(72 0C )。因为子链自身作为随后循环的模板，与两个引物配对的DNA片段按指数规律扩增，而不是线性地扩增。探针已经放射性标记或用一些其他检测分子如生物素、digoxygenin或荧光素标记的对应于目标基因或序列的DNA或RNA片段的一般术语。
纯化/去杂/灭菌指的是从样品除去污染物的过程，其中结果是样品含有60%，优选75%，更优选90%纯化程序所针对的物质。限制性片段长度多态性(RFLP):允许通过比较扩增(通常通过PCR)特定基因组DNA片段并用特定限制性酶切割时获得的特征性多态模式来建立遗传相关性的方法。通过形成或消除这些酶的识别位点的突变来产生这种模式的变化。样品广义地解释该术语并包括在溶液中含有核酸(DNA或RNA)或连接固体物质的任何形式，其中“核酸”的定义包括基因组DNA(例如，与固体物质连接时，如在DNA印迹中，或在溶液中)、cDNA和其他形式。通过杂交形成两个核酸序列的结合归功于G和C或A和T碱基或这些碱基类似物之间的氢键。这些结合是互补性的，且DNA螺旋是反平行的。可以使用溶液中的一个序列(或螺旋)和另一个连接固相的序列来形成该杂交结合(如，例如，在FISH[原位荧光杂交]方法中)，要不两个序列都在溶液中。单链构象多态性(SSCP) :SSCP是基于序列中微妙差异(通常是一个碱基对)的单链核酸的电泳分离，该微妙差异导致不同的二级结构和通过凝胶的迁移率的可测量差异。链置换扩增(STA) :STA是等温的体外核酸扩增技术，基于HincII切断其识别位点半硫逐磷酸酯形式的未修饰链的能力，和DNA聚合酶的外切核酸酶缺乏Klenow片段(外-klenow)在缺口延伸3’ -端并置换下游DNA链的能力。由结合正义和反义反应获得指数扩增，其中从正义反应置换的链作为反义反应的目标，反之亦然。目标序列通过杂交、扩增或其他方法或方法组合来分析的核酸序列。Tm(解链温度)特异性双链DNA群分解成单链聚合物的温度。计算多核苷酸片段的该温度的公式是本领域公知的Tm = 81. 5+0. 41 ( % G+C) (Anderson &Young, “Quantitative Filter `Hybridization，，(定量滤膜杂交)，在 Nucleic AcidHybridization[1985]中)。对于少于40个碱基对的寡核苷酸,可以使用简化的公式Tm =3°C X (G+C) +2X (A+T)。Tr-DNA/RNA :跨肾DNA/RNA，或已经穿过肾脏屏障的尿液中存在的DNA/RNA。尿道包括参与尿从身体排出的器官和导管。病毒病原体感染中的尿核酸本发明是基于以下发现在病毒感染后，病毒或病毒来源的核酸分裂成在尿液中发现的相对短的片段。许多这些病原体特异性核酸穿过跨肾屏障(这些核酸通常称为TrNA，或TrDNA或TtRNA)并且通过分子方法可以作为无细胞低分子量片段(其长度小于1000个核苷酸，但优选小于500bp长，更优选短于250-300bp长或短于250bp长)在尿液中检测到。这些跨肾核酸源自位于个体尿道外的病毒。如在此所用的，术语“病毒核酸”包括病原来源的核酸。其他病毒特异性核酸可以通过肾脏内的病毒或细胞流出，并因此不必定穿过跨肾屏障以便在尿液中得到检测。此外，可以在尿液中发现一些通过穿过跨肾屏障以外的其他机制或通过肾脏内的病毒产生的病毒特异性核酸。之前只在经历过异种组织或器官移植宿主中，在怀有男性胎儿妇女的情况中以及在特征在于特异性标记基因的肿瘤的情况中，检测到尿液中跨肾核酸(Tr-NA)的存在。根据本发明，还优选在非尿道感染的情况中检测到病毒感染情况中病毒来源的跨肾核酸的存在，甚至在血尿症或导致肾脏屏障破裂的病理学不存在的情况中或改变肾脏屏障正常完整性的情况中检测到。病毒来源的跨肾核酸(Tr-NA)与尿道中流失或释放并且在尿液中发现的病毒的基因组不相关，并且不是源自这些病毒的基因组。替代的是，跨肾核酸是通过肾小球-肾脏过滤机制过滤的。因此，跨肾核酸片段的大小通常小于约1000个碱基对，例如，小于约500，小于约300，小于约250，或在约100至约200个碱基对之间，与DNA通常具有高分子量和长度超过1000个碱基或碱基对的其他情况相反。因此，在本发明中，病毒来源的跨肾核酸(TrNA)通常没有在尿液沉淀物中发现，而是在可溶性部分中，尽管痕量的TrNA在离心过程中与细胞一起沉淀。该发现证实了源自尿液中病原体病毒的尿核酸或跨肾核酸的存在，因此适用于诊断所有由病毒病原体引起的传染病。·因此，在实施方案中，本发明涉及诊断或监控病毒感染的方法，通过测定尿样中病毒核酸的存在，优选病毒DNA或病毒来源的RNA。该方法包括测定跨肾病毒核酸存在的步骤，使用实验室操作中常用的方法，如杂交、PCR、巢式PCR、半巢式PCR、SSCP, LCR和SDA。在特定实施方案中，根据本发明的方法包括在测定跨肾病毒核酸存在之前尿样的初步处理。一实施方案中，本发明包括用抑制DNA或RNA降解的试剂预处理尿样。这些试剂包括酶抑制剂，如螯合剂、去污剂或变性剂、DNase或RNase抑制剂，其优选选自EDTA、盐酸胍、异氰酸胍、N-月桂酰肌氨酸和十二烷基硫酸钠。另一实施方案中，跨肾病毒核酸存在的测定任选地在为了分离尿液的细胞部分与无细胞低分子量核酸(DNA/RNA)的尿样离心或过滤之前。然而，还可以使用没有分级的尿样。优选在2500g至4500g的速度进行离心，更优选3000g至4000g。优选通过具有O.1至5. O μ m孔径的滤器来进行过滤，更优选使用O. 2至1. O μ m的孔径，甚至更优选O. 45至
O.8 μ m。也可以使用从细胞部分分离可溶性部分的等价方法。通过使用本领域已知的化学或物理方法来实现跨肾核酸的任选分离或纯化和定量。这包括至少一个纯化步骤，使用选自以下的方法有机溶剂提取、过滤、沉淀、固体基质吸附(例如，通过离子交换)、亲和色谱或分子排阻色谱或这些方法的组合。然而，纯化方法必须适于分离小于1000个核苷酸长的DNA(单链或双链)，这些DNA具有相应的分子量，假定，作为平均分子量，核苷酸具有330道尔顿的值。在一些实施方案中，纯化对于小于500个核苷酸(nt)长的具有相应分子量的片段是特异性的，如长度小于300nt的片段，长度小于250nt的片段，或长度为100至200个核酸碱基对(nt)的片段。通过使用本领域已知的化学或物理方法来实现跨肾核酸的分离和/或纯化。这包括一个或多个纯化步骤，使用选自以下的方法有机溶剂提取、过滤、沉淀、固体基质吸附(例如，硅胶树脂、羟磷灰石或离子交换)、亲和色谱(例如，通过序列特异性捕获或核酸特异性配体)或分子排阻色谱。然而，纯化方法必须适于分离大小小于1000个核苷酸对的DNA (单链或双链)。再更优选，纯化对于小于500个核苷酸的片段是特异性的，更优选，长度小于300或250nt的片段，或长度为100至200个碱基或碱基对的片段。纯化优选在包括但不限于硅胶树脂的基质上进行。—个优选的实施方案中，通过在室温用变性剂预处理尿样来进行DNA分离方法，变性剂如上所述，例如为脲、盐酸胍或异氰酸胍。优选使用异氰酸胍。然后将样品穿过固相，优选由硅胶树脂构成的基质，在离液盐(异氰酸胍)存在下，结合核酸。然后在缓冲剂如Tris-EDTA(Tris IOmM，EDTA ImM)中或在水中收集或洗脱的样品。在另一个优选的实施方案中，通过选自以下的技术进行跨肾病毒NA存在的表征和测定核酸杂交、循环探针反应(F. Bekkaoui等,在BioTechniques 20 :240-248 [1996])、聚合酶链式反应(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (PCR实验方案方法和应用指南)，M.1nnis等；Elsevier Publication, 1990)、巢式聚合酶链式反应、单链构象多态性、连接酶链式反应(LCR) (F.Barany，在PNAS USA, 88 :189-93 [1991])、链置换扩增(SDA) (G. K. Terrance Walker，等，在 NucleicAcid Res, 22 :2670-77 [1994]和限制性片段长度多态性(RFLP)。本领域技术人员还可以使用这些方法的组合，例如，PCR-限制性长度多态性，其中核酸得到扩增，然后分成等份并用限制酶消化，然后通过电泳分离。聚合酶反应(PCR)是用于检测和/或定量分析核酸的优选方法。再一更优选的是巢式PCR方法，如上所述，或半巢式PCR方法，其中两个引物中只有一个是扩增子内部的。该方法的优势主要与易于收集生物样品；跨肾核酸不是感染性的事实；可以应用至核酸，甚至是片段形式的分子诊断方法的敏感性相关。诊断方法适用于所有病毒病原体，包括RNA、DNA、游离基因或整合的病毒。还适用于重组病毒，如基因治疗中使用的腺病毒或慢病毒。特别地，该方法优选适用于以下病毒重组和天然HIV-l、HIV-2、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)和腺病毒(AAV)。优选将该方法应用于HIV-1病毒，选择GAG、POL或TAT片段中的探针或引物寡核苷酸用于检测。通过聚合酶链式反应(PCR)，特别地，通过巢式(GAG)或半巢式(POL)PCR进行检测时，特别优选的引物对是由HIV GAG片段的特异性序列构成的，并优选对应于IDN1-4序列，和HIV-1P0L片段特异性的，优选对应于IDN 5-7片段。在另一个实施方案中，本发明涉及用于检测和监控尿液中跨肾病毒NA的试剂盒，该试剂盒包括用于从尿样中分离和/或纯化跨肾DNA的试剂和/或材料、DNA探针，或至少一种病毒剂特异性的寡核 苷酸对(引物)。可以任选地存在反应管、预处理样品的试剂、标记探针的酶和用于DNA扩增的酶。在优选的实施方案中，试剂盒包括重组和天然的HIV-1、HIV-2、天花病毒、脊髓灰质炎病毒、单纯疱疹病毒(HSV)、EB病毒(EBV)、丙肝病毒(HCV)、乙肝病毒(HBV)和腺病毒(AAV)特异性的寡核苷酸引物对；或，再更优选，引物选自以下所示序列，和用于聚合酶链式反应优选在巢式或半巢式形式中的特异性试剂。扩增和检测尿核酸的方法术语核酸指的是寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸或其片段/部分以及天然(例如，基因组)或合成来源的DNA或RNA。可以具有双或单螺旋，并还可以表示序列的正义或反义方向。平行螺旋(5，— 3’ );反平行螺旋(3’ 一 5’)。术语寡核苷酸、多核苷酸和核酸聚合物是相等的，并理解为指的是由超过两个的脱氧核糖核酸碱基或核糖核酸碱基构成的分子。核苷酸(碱基)的数目和寡核苷酸片段的长度可以改变。可以以不同的方式合成。序列在传统上定义为起始于5’并终止于3’。这些数字表示序列的方向。为了检测，然后扩增从个体尿液分离的DNA。扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR、半巢式PCR、单链构象多态性分析(SSCP)、连接酶链式反应(LCR)和链置换扩增(SDA)。还可以通过至少一个标记引物的杂交来进行跨肾DNA的检测。
杂交是允许两个核酸序列作相互识别为补体并连接在一起(退火)的方法。互补/补体序列是彼此相互作用的多核苷酸序列，取决于碱基之间的相互作用。例如，根据标准Watson Crick碱基配对,AGTC与TCAG互补。然而,其他组合如Hoogstein碱基配对是本领域普通技术人员公知的。可以具有全部或部分互补序列，并且这决定了两个序列之间的效率或吸引力。平均互补性在允许保持连接的条件下，将防止杂交的强烈互补性。核酸序列杂交的能力是公知现象。第一种杂交方法描述于Marmur& Lane, PNASUSA, 46 =453(1960)和461 (1960)中，但是从那时起已经完全成为分子生物中的技术。现今，术语“杂交”包括，特别是，狭线/印迹和印迹杂交。允许核苷酸序列相互识别(杂交)的条件可以改变，以这样的方式来产生完全杂交(具有高特异性的互补性)或部分杂交(具有平均特异性的互补性)。在本申请中，无论何时使用术语“杂交”，应当将条件理解为指的是允许平均或高互补性的那些。本领域技术人员可以计算需要多少人工序列来促使两个相对方向的互补序列之间的杂交，称为反平行结合。探针是可以人工或天然产生 ，并且与另一核酸序列形成组合的寡核苷酸。探针用于发现含未知DNA样品中的特定序列。在本专利中，所有的探针可以结合信号分子(或报道分子)。报道分子使得可以检测探针(例如，通过酶反应(例如，ELISA(酶联免疫吸附测试))、放射性、荧光或其他系统)。聚合酶链式反应(PCR)是使用互补引物和热敏感性聚合酶的DNA序列扩增方法。特定核酸扩增中所用的一类酶是称为Taq(水生栖热菌(Thermus aquaticus))聚合酶的DNA聚合酶。引物是寡核苷酸，在合适的条件下，可以从其启动多核苷酸序列的合成。引物可以天然存在(例如，在多核苷酸的酶消化中)，或可以通过化学合成获得。PCR中扩增的产物通常称为扩增子。巢式PCR是第二种PCR，其使用第一套引物内部的第二套引物(称为巢式引物)在早先的PCR产物上进行。这显著提高了 PCR的敏感性和特异性。巢式引物是第一个PCR循环获得的扩增子内部的。使用至少一个巢式引物的扩增过程提高了特异性，因为第一个循环的非特异性产物在第二个循环中没有得到扩增，因为它们缺少对应于巢式引物的序列。半巢式PCR是使用一个新引物和一个最初引物的第二种PCR。该方法也提高了特异性。连接酶链式反应(LCR)是与PCR相似的DNA扩增方法。LCR不同于PCR，因为其扩增探针分子而不是通过核苷酸的聚合产生扩增子。每个DNA使用两个探针并连接在一起来形成单个探针。LCR使用DNA聚合酶和DNA连接酶来启动反应。和PCR—样，LCR需要热循环仪来启动反应且每个循环导致目标核酸分子的倍增。LCR可以具有比PCR更高的特异性。在单链构象多态性(SSCP)分析中，使小的PCR产物(扩增子)变性并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。因此，随着PCR产物移动至凝胶中并通过凝胶(并远离变性剂)，将恢复序列依赖性的二级结构(与RNA 二级结构相似)。单链PCR产物的迁移率将取决于它们的二级结构。因此，含有实质性序列差异以及插入和删除的PCR产物具有不同的迁移率。链置换扩增(SDA)是等温核酸扩增方法，基于引物指引的限制酶的缺口活性和外核酸酶-缺失聚合酶的置换活性。术语纯化或分离指的是从样品中除去污染物的过程，其中结果是含有50%、60%、70%>90%或超过90%纯化程序所针对物质的样品。对于核酸杂交情况中的严谨温度条件，这些术语通常指的是最大值和最小值之间的可变温度，对于核酸，最大温度由低于Tm 5°C来表不,最小温度由低于Tm 25°C来表不。本领域中所用的技术利用了严谨温度条件，结合其他参数(例如盐水浓度)，来区分具有拟似精确同源性的序列。严谨条件是本领域技术人员已知的并可以在Ausubel，等(编辑)，⑶RRENTPROTOCOLS IN MLECULAR BIOLGYJohn Wiley &Sons,N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6.3· 6 中找到。优选，条件使得序列彼此至少约65%、70%、75%、85%、90%、95%、98%或99%同源，通常保持彼此杂交。严谨杂交条件的非限制性实例是在含有6X SSC、50mMTris-HCl(pH7. 5) UmMEDTA,O. 02% PVP,O. 02% FicollUO. 02% BSA和 500mg/ml 变性鲑鱼精子DNA 的高盐缓冲剂中在65°C杂交，接着在O. 2X SSC、0. 01% BSA中50°C洗涤一次或两次。在第二个实施方案中，提供了在中度严谨条件下，与包括核苷酸序列或其片段、类似物或衍生物的核酸分子可杂交的核酸序列。中度严谨杂交条件的非限制性实例是在6XSSC、5X Reinhardt’ s 溶液、O. 5% SDS 和 100mg/ml 变性鲑鱼精子 DNA 中 55°C杂交，接着在IX SSC、0. 1% SDS中37°C洗涤一次或多次。可以使用的其他中度严谨条件是本领域公知的。参见，例如，Ausubel 等(编辑)，I"3，CURRENTPR0T0C0LS IN MLECULAR BIOLGY，John Wiley & Sons，NYjPKrieger，1990 ；GENE TRANSFER AND EXPRES SION,ALAB0RAT0RYMANUAL, Stockton Press, NY。在第三个实施方案中，提供了在低严谨条件下，与核酸分子或其片段、类似物或衍生物可杂交的核酸。低严谨杂交条件的非限制性实例是在35%甲酰胺、5X SSC、50mMTris-HCl (ρΗ7· 5)、5mM EDTA,O. 02% PVP.0. 02% Ficoll.O. 2% BSA、lOOmg/ml 变性鲑鱼精子 DNA、10% (wt/vol)硫酸葡聚糖中 40°C杂交，接着在 2XSSC、25mM Tris-HCl (pH7. 4)、5mM EDTA和0.1% SDS中50°C洗涤一次或两次。可以使用的其它低严谨条件是本领域公知的(例如，和用于交叉物种杂交的一样)。参见，例如，Ausubel，等(编辑)，1993，CURRENT PR0T0C0LSIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons，NYjPKrieger，1990 ；GENETRANSFER AND EXPRESSION, ALAB0RAT0RY MANUAL, Stockton Press，NY ;Shilo 和 Weinberg，1981.Proc Natl Acad Sci USA 78:6789-6792。
本发明还提供了用于检测和/或测定需要个体尿样中病毒核酸基因型的试剂盒，包括在相同或分开包装中的至少一个选自SEQ ID N0:l、3、5、9和11的正向引物和至少一个选自SEQ ID N0:2、4、6、8和10的反向引物，以及使用说明书。在一个实施方案中，该病毒核酸源自HIV。在以下的实施例中将进一步描述本发明，这些实施例不是限制权利要求中所述本发明范围。实施例本领域技术人员可以改变在此所述所有方法而没有改变基本原则概念。实施例1.样品的稳定和制备尿样制备和跨肾DNA分析的所有步骤在室温下进行。简而言之，从参与研究的每个个体收集大约50-60ml的样品。在收集后的30分钟内，以IOmM的终浓度加入由0. 5MEDTA和0. 5M Tris-HCl构成的溶液，pH为8. O至8. 5，以便抑制尿样中可能存在的核酸酶。在尿液中鉴定出至少三种分解核酸的酶，DNaseKDNsae II和磷酸二酯酶。EDTA通过螯合二价金属如Mg2+、Ca2+和/或其他对于它们的活性所需的来抑制DNase I和磷酸二酯酶的活性。DNase II在酸性环境中活性最大。尿液补充pH8. O的Tris-HCl提高了尿液的pH，因此抑制了 DNase II的活性。每个个体可以采取更高含量的尿液，例如，100-1000ml。将这些大量的样品浓缩并用于形成尿液中发现的非常稀的病毒核酸的较高浓度。稳定的尿液可以以5ml的等份试样存储于_80°C。任选地，将25ml盐溶液冷冻来作为对照。制备尿样和提取DNA的其它方法描述于PCT专利No. W098/54364中，以其整体引入作为参考。实施例2.尿液分级对于基于Tr-DNA的应用，涉及定量Tr-DNA分析，通常需要尿液分级。这降低了来自尿液中存在的细胞的核蛋白对Tr-DNA/蛋白质复合物、总Tr-DNA或特定遗传标记的精确定量的影响。在我们的实验中，我们使用了两种方法用于尿液分级，离心和过滤。两者都在尿液收集后和在样本补充EDTA-Tris稳定混合物之前立即进行。可以将尿液保持在这种条件，只要尿细胞是完整的并且它们的成分没有漏至尿液中和细胞DNA污染Tr-DNA。对于过滤，可以使用孔径为0.1至5 μ m的具有降低的核酸和蛋白质结合能力的滤器。滤器的选择取决于待分析的目标。在我们的实验中，我们使用了 Iuer-1ock 0. 45 μ m滤器装置(Cat. No. SLHV033RS)或 0. 45 μ m 150ml 滤器装置 STERICAP (Cat. No. SCHVUOI RE)，两者都来自Millipore。过滤后，将样品补充EDTA-Tris保存溶液并进行DNA提取的下游处理或等分并冷冻存储于_80°C。通过使用已知溶解细胞的溶液(高浓度盐或离液剂)从滤器提取来收集尿细胞级分。我们实验中通过离心的`尿液分级在样品收集后和加入保存混合物之前立即进行。在室温在3500至4000Xg的RCF进行离心大约15分钟。在上述每个用于尿液过滤的程序中小心地收集和操作上清液。将主要由细胞和细胞碎片构成的沉淀重悬浮于生理溶液中并存储在_80°C。实施例3.从尿液提取和纯化核酸在我们的实验中，我们使用了两种不同形式的基于硅胶的DNA提取实验方案。一种是真空驱动的，第二种是离心。基于真空的方法向尿样中加入6M硫氰酸胍(GITC) (AMRESC0, Cat. No. 0380)至不低于3M的终浓度。将该溶液强烈搅拌并每IOml最初的尿液体积补充0.25ml Wizard硅胶悬浮液(PR0MEGA, Cat.No.A7141)。为了捕获DNA，将混合物在室温连续旋转I小时。通过将混合物装载于装配连接真空管道的迷你柱(PR0MEGA，Cat.No.A7211)注射器上来收集带有捕获的DNA的树脂。通过施加真空来收集树脂，用5ml的3M GITC溶液洗涤两次。用80%乙醇和50mM NaCl构成的溶液进一步将树脂洗涤两次。然后分离迷你柱并用96 %乙醇通过在1.5ml管中在台式微离心机上离心将树脂另外洗涤两次。在不超过1/20尿液初体积的体积中用热水简短离心来洗脱DNA。基于离心的方法向尿样中加入6M硫氰酸胍(GITC) (AMRESC0, Cat. No. 0380)至不低于3M的终浓度。将该溶液强烈搅拌并每IOml最初的尿液体积补充0.25ml Wizard硅胶悬浮液(PROMEGA, Cat.No.A7141)。为了捕获DNA，将混合物在室温连续旋转I小时。通过在室温在大约4000xg离心约5分钟来收集带有捕获的DNA的树脂。用GITC溶液将沉淀的树脂洗涤一次，用洗涤缓冲剂洗涤一次，然后转移至迷你柱并用96%乙醇再洗一次。用热水通过简短离心将DNA洗脱至微离心管中。用热水在不超过1/20尿液初体积的体积中通过简短离心来洗脱DNA。实施例4. PCR弓丨物的设计选择用于基于使用PCR的Tr-DNA分析的引物，用于两种不同大小的目标片段，即，一个为60至120bp，另一个为250至400bp。还将所有的引物对完整的人基因组序列进行了比较。使用 FastPCR 软件包(biocenter.helsink1.fi/bi/bare_l_html/oligos)设计引物。使用引物 3 软件包(在 frodo. w1. mit. edu/cg-1-bin/primer3/primer3_www· cgi 网址可以获得)来选择用于巢式PCR分析的引物，这样使得内部的巢式引物的解链温度不低于外部引物的。选择HIV引物用于识别全部9个M型HIV亚型。根据最近修订的命名法(即，1999Nomenclature Proposal [hiv. lanl. gov/content/hiv-db/HTML/reviews/nomenclature/Nomenl])，通过HIV-1序列的系统发生相关组来表示HIV-1M组亚型。将它们命名为Al、A2、B、C、D、F1、F2、G、H、J和K。M组含有表示欧洲全部HIV情况大约95%的病毒。从LosAlamos National Laboratory (NewMexico, hiv. lanl. gov)的数据库获得 HIV-1M 组亚型的完整基因组序列。通过使用BioEdit软件包中(mbio. ncsu. edu/BioEdit/bioedit. html)包括的ClustalX算法来进行各种亚型的共有序列的多重比对和形成。选择以下的引物用于巢式PCR的GAG引物外部 GAG 468-F(SEQ ID NO:1) TGGGTAAAAGTAATAGAGGAGAAGGC ；GAG 602-R(SEQ ID NO :2) AACATTTGCATGGCTGCTT.产物134bp。内部GAG 518-F(SEQ ID NO :3) CAGCATTATCAGAAGGAGCCACC ；GAG 596-R(SEQ ID NO :4) TGCATGGCTGCTTGATGTCC.产物79bp。用于半巢式-PCR,短扩增子的POL引物外部引物POL 4368-F(SEQ ID NO :5) =GGRGAAGCCffTGCATGGAC ；POL 4468-R(SEQ ID NO :6) GCTACATGRACTGCTACCAG.产物102bp。内部引物POL 4368-F(SEQ ID NO :5) =GGRGAAGCCffTGCATGGAC ；POL 4427-Rn(SEQ ID NO :7) TGTRCAATCTARTTGCCATATYCCTGG.产物60bp。用于半巢式-PCR,长扩增子的POL引物
外部引物POL 4368-F(SEQ ID NO :5) =GGRGAAGCCffTGCATGGACPOL 4678-R(SEQ ID NO :8) ACTCCYTGRCTTTGGGGATTG产物31Ibp。内部引物(巢式)POL 4368-F(SEQ ID NO :5) =GGRGAAGCCffTGCATGGACPOL 4427-Rn(SEQ ID NO :7) TGTRCAATCTARTTGCCATATYCCTGG.产物60bp。用于半巢式PCR(长扩增子)的TAT引物外部引物TAT 5955-F(SEQ ID NO :9) GCTTAGGCATYTCCTATGGCAGTAT 6462-R(SEQ ID NO :10) TGGGGTCTGTKGGTACACAGG.产物569bp。内部引物TAT 6330-Fn(SEQ ID NO :11) CffGTHTAYTATGGRGTACCTGTGTGGTAT 6462-R(SEQ ID NO :10) TGGGGTCTGTKGGTACACAGG.产物132bp。实施例5.基于TrDNA的HIV-1感染的诊断从10名感染HIV的个体的尿样分离DNA，如之前实施例中所述。通过使用标准临床分子测试来检测HIV病毒特异性抗体的存在，这些个体在临床上诊断为感染了 HIV。图1显示了 HIV-1DNA片段的电泳，如通过巢式PCR扩增的，使用以上所示的两对GAG-特异性引物，根据本发明中所述方法。其大小对应于巢式PCR扩增预期结果的条带-如在第一个扩增中使用468/602对引物进行的，接着使用518/596对(79bp)-在10名个体的8名尿液中和在阳性对照中观察到，但在阴性对照中没有观察到。表I显示了分析的每名个体的病毒负载量，从其可以推断出扩增时阴性样品(编号2和3)的情况中,病毒负荷量低于每ml血衆50个病毒拷贝。表1. HIV感染个体的病毒负载量
权利要求
1.跨肾病毒核酸在制备用于诊断个体中的乙肝病毒感染的药物中的用途，其中所述诊断包括检测来自个体的尿液中跨肾乙肝病毒(HBV)核酸的存在，其中所述核酸的存在表明病毒感染。
2.根据权利要求1的用途，其中所述跨肾病毒核酸是跨肾DNA。
3.根据权利要求1的用途，其中所述诊断进一步包括定量所述跨肾病毒核酸的步骤。
4.根据权利要求3的用途，其中所述定量通过选自以下的方法来进行用HBV特异性的分子探针配对、杂交、PCR、巢式PCR、半巢式PCR、SSCP, LCR和SDA。
5.根据权利要求1的用途，进一步包括在检测所述跨肾病毒核酸之前将尿液分离成含所述跨肾病毒核酸的可溶性级份。
6.根据权利要求5的用途，其中所述分离是通过选自所述尿液的过滤和离心的方法进行的。
7.根据权利要求1或6的用途，其中所述跨肾病毒核酸的长度小于300bp。
8.根据权利要求7的用途，其中所述跨肾病毒核酸包括DNA片段，且所述片段的长度为100 至 200bp。
9.根据权利要求1的用途，其中所述诊断进一步包括分离或纯化所述跨肾病毒核酸的步骤。
10.根据权利要求9的用途，其中通过化学或物理方法来进行所述纯化。
11.根据权利要求9的用途，其中所述分离或纯化使用选自以下的方法进行有机溶剂提取、过滤、沉淀、具有核酸亲和性的固体基质吸附和色谱。
12.根据权利要求11的用途，其中所述固体基质由基于二氧化硅的树脂、离子交换树脂或羟磷灰石构成。
13.根据权利要求12的用途，其中所述固体基质是基于二氧化硅的树脂，且所述分离或纯化在离液剂的存在下进行。
14.根据权利要求1的用途，其中所述诊断进一步包括通过添加DNase或RNase抑制剂而预处理所述尿液。
15.根据权利要求14的用途，其中所述抑制剂选自离子螯合剂、变性剂和离子去污剂。
16.根据权利要求15的用途，其中所述离子螯合剂是EDTA;所述变性剂是盐酸胍或异硫氰酸胍；并且所述离子去污剂是N-月桂酰肌氨酸或十二烷基硫酸钠。
17.根据权利要求1的用途，其中所述尿液是作为样品从个体获得的，或其中所述检测是通过循环探针反应进行的。
18.跨肾病毒核酸在制备用于监控个体中乙肝病毒感染的药物中的用途，其中所述监控包括 a)定量来自所述个体的第一尿样中跨肾乙肝病毒(HBV)核酸的含量； b)定量来自所述个体的第二尿样中所述跨肾乙肝病毒(HBV)核酸的含量； c)比较所述第一和所述第二尿样中所述跨肾HBV核酸的含量，由此监控所述个体中的HBV感染。
19.根据权利要求18的用途，其中所述监控进一步包括将降低或抑制HBV感染的化合物给药于所述个体。
20.根据权利要求19的用途，其中所述化合物是抗病毒剂。
21.根据权利要求18的用途，其中所述定量通过选自以下的方法来进行用HBV特异性的分子探针配对、杂交、PCR、巢式PCR、半巢式PCR、SSCP, LCR和SDA。
22.根据权利要求18的用途，进一步包括在定量所述跨肾病毒核酸之前将每个尿样分离成含所述跨肾病毒核酸的可溶性级份。
23.根据权利要求22的用途，其中所述分离是通过选自所述尿液的过滤和离心的方法进行的。
24.根据权利要求18或23的用途，其中所述跨肾病毒核酸的长度小于300bp。
25.根据权利要求24的用途，其中所述跨肾病毒核酸包括DNA片段，且所述片段的长度为 100 至 200bp。
26.根据权利要求18的用途，其中所述个体处于产生复发性HBV感染的风险中。
27.用于测定尿样中跨肾乙肝病毒核酸存在的试剂盒，所述试剂盒包括用于从所述尿样分离或纯化所述跨肾乙肝病毒核酸的工具，和用于通过与至少一种乙肝病毒(HBV)特异性探针杂交测定所述跨肾乙肝病毒核酸存在的工具。
28.根据权利要求27的试剂盒，其中所述HBV特异性探针包括用于聚合酶链式反应(PCR)的引物。
全文摘要
本发明涉及检测尿液中病毒特异性核酸的组合物和方法。具体地，涉及通过检测尿样中跨肾病毒核酸或病毒来源核酸的存在，诊断或监控病毒感染的方法，其中使用或没有使用从尿样中分离核酸。通过核酸与特异性引物杂交，或通过与特异性引物的链扩增反应来进行核酸的分析。该方法适用于所有病毒病原体，包括RNA、DNA、游离基因或整合的病毒。
文档编号C12Q1/68GK103045758SQ20121049096
公开日2013年4月17日 申请日期2006年2月16日 优先权日2005年2月17日
发明者H.梅尔科尼扬, A.坎纳斯, L.D.托梅, S.R.乌曼斯基 申请人:特罗瓦基因公司