特异性识别玉米素的核酸适体及其筛选方法和应用的制作方法

专利名称：特异性识别玉米素的核酸适体及其筛选方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种特异性识别玉米素的核酸适体及其筛选方法和应用。
背景技术：
玉米素(Zeatin)是第一种被分离鉴定的天然细胞分裂素，是植物中分布最普遍的细胞分裂素。在植物生命过程中，它具有促进细胞分裂、芽的形成、腋芽生长、木质部分化、种子发芽、根与叶的成长，抑制茎的伸长，阻止老化，维持核酸、蛋白质和叶绿体的含量，增强抵抗高低温能力，加速养分和同化物质的移动等重要生理作用。玉米素类细胞分裂素包括顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素及其核苷、核苷酸 衍生物，其中以反式玉米素及其核苷的生物活性最高。目前，玉米素的检测方法包括气质联用、液质联用和酶联免疫等方法。这些方法虽然具有高的灵敏度及低的检测限，但是需要昂贵的设备及复杂的前处理过程。因此，需发展一种简便、经济的与玉米素特异识别的分子用于玉米素的富集、分离及检测。核酸适体(aptamer)是一类能特异性结合祀分子的单链核酸序列,包括DNA、RNA>肽核酸或化学修饰的核酸。核酸适体通过范德华力、氢键或静电作用与靶分子高亲和力，高特异性地相互结合作用。迄今为止，已筛选出了数百个核酸适体，它们的靶物质范围很广，包括无机金属离子、有机小分子、生物大分子、以及病毒、细菌、细胞和组织切片等。核酸适体的亲和力和特异性可以与抗体相媲美，因此它又称为核酸或者化学的“抗体”。与单克隆抗体相比，核酸适体具有以下优点I)体外筛选,无需免疫动物或细胞；2)低毒性或免疫源性，良好的水溶性，可以直接进行大剂量的皮下静脉注射；3)可以在生理条件以外的条件下进行筛选和应用；4)可进行大量化学合成制备，批间差异小；5)容易进行结构改造、修饰、标记或固定化；6)稳定性好，容易保存和运输；7)分子量小，一般在4-50KD。基于这些优点，核酸适体作为一种新型识别分子已经被广泛应用于分析化学、生物传感器、疾病治疗和诊断等诸多领域。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种特异性识别玉米素的核酸适体。本发明所提供的核酸适体，为序列表的序列I至序列8中任一所示的单链DNA片段。所述核酸适体具体可为序列I至序列8中任一所示的DNA片段。核酸适体 I :5' -C ATATGCTTAC^CAGCCATAACAGCTTTAT G-31 (序列 I)核酸适体2 :5, -GAGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCCC-3'(序列 2)
核酸适体3 :5, -AAGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCTT-.V (序列 3)核酸适体4:5' -ACGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCGT-3'(序列 4)核酸适体5:5' -CGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCG-.V (序列 5)核酸适体6 :5, -GG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CC-3'(序列 6)核酸适体7 5' -G ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT c~3'(序列 7)核酸适体8:5' -TGGAGG ATATGGTTCGGCAGGTTTAAGGTTTAT CTCTC-3'(序列 8)其中，每条核酸适体加粗下划线标记部分为保守序列，即所述核酸适体的共有序列。 将所述单链DNA片段进行修饰或改造得到的核酸适体衍生物也属于本发明的保护范围。所述核酸适体衍生物可为如下任意一种I)将所述核酸适体删除部分或增加部分核苷酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；2)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；3)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸脂骨架，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；4)将所述核酸适体改为肽核酸，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物；5)将所述核酸适体的一端或中间接上信号分子(如荧光素FITC、FAM、罗丹明B、或放射性分子)、活性分子(如生物素、氨基、羧基、酶)或其它功能基团后，得到与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体衍生物。本发明的再一个目的是提供一种基于上述核酸适体的核酸探针。本发明所提供的核酸探针，为核酸探针甲、核酸探针乙、核酸探针丙或核酸探针丁所述核酸探针甲由单链DNA片段甲-I和单链DNA片段甲_2组成；所述单链DNA片段甲-I由序列表中序列I所示的核苷酸组成，且5'末端标记有荧光报告基团，3'末端标记有荧光淬灭基团(核酸适体元件);所述单链DNA片段甲-2由9-11个核苷酸组成，且能与序列表中序列I杂交(互补元件)；所述核酸探针乙由单链DNA片段乙-I和单链DNA片段乙_2组成；所述单链DNA片段乙-I由序列表中序列I所示的核苷酸组成，且5'末端标记有荧光报告基团(核酸适体元件);所述单链DNA片段乙-2由9-11个核苷酸组成，能与序列表中序列I杂交，且3'末端具有荧光淬灭基团(互补元件);所述核酸探针丙由单链DNA片段丙-I和单链DNA片段丙_2组成；所述单链DNA片段丙-I由序列表中序列5所示核苷酸组成，且第21位的T标记有荧光报告基团(核酸适体元件)；所述单链DNA片段丙-2由9或10个核苷酸组成，能与序列表中序列5第21-29位或第21-30位核苷酸杂交，且3'末端标记有荧光淬灭基团(互补元件)；所述核酸探针丁由DNA片段丁组成；所述DNA片段丁为如下al)或a2)al)由序列表中序列5所不核苷酸组成,且第21位的T标记有突光报告基团。
a2)由序列表中序列I-序列8中任一所示核苷酸组成，且5'末端标记有荧光报
告基团。 在本发明中，所述单链DNA片段甲-2与所述单链DNA片段甲-I上任意连续的9_11个核苷酸反向互补；所述单链DNA片段乙-2与所述单链DNA片段乙-I上任意连续的9_11个核苷酸反向互补；所述单链DNA片段丙-2与所述单链DNA片段丙-I上任意连续的9或10个核苷酸反向互补。更加具体的，所述单链DNA片段甲-2具体由序列9所示核苷酸组成；所述单链DNA片段乙-2具体由序列10所示核苷酸组成，且3'末端标记有荧光淬灭基团；所述单链DNA片段丙-2具体由序列11所示核苷酸组成，且3'末端标记有荧光淬灭基团。序列9:5' -CATAAACCTCT-3'序列10:5' -AACCATATG-3' 序列11:5' -AACCTCTTA-3'所述荧光报告基团具体可为FAM (如6-FAM)、罗丹明B、FITC、TAMRA, Cy3或Cy5。所述荧光淬灭基团具体可为BHQl、DABCYL或BHQ2。本发明的又一个目的是提供一种含有所述核酸适体、或所述核酸探针的试剂盒。所述核酸适体、或所述核酸探针，或所述试剂盒在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围( I)鉴定或辅助鉴定玉米素；(2)检测待测物质中玉米素浓度； (3)分离和/或富集玉米素。其中，(I)所述的鉴定或辅助鉴定玉米素具体可为检测待测物质是否为或候选为玉米素、检测待测物质是否含有或候选含有玉米素等。本发明的另一个目的是提供一种筛选所述核酸适体的方法。该方法具体可包括如下步骤
(a)以如下核酸文库为起始核酸文库5' -AAGGAGCAGCGTGGAGGATA(N45)TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3'，其中 N 为 A、T、C 或G；(b)将所述起始核酸文库的溶液与固定有非靶标分子的微球孵育，分离去除与所述非靶标分子结合的核酸分子，保留与所述非靶标分子不结合的核酸文库溶液；(C)将所述与非靶标分子不结合的核酸文库溶液与固定有靶标分子的微球孵育，分离得到与所述靶标分子特异结合的核酸分子；(d)得到核酸适体；所述靶标分子为玉米素分子。所述非靶标分子为L-组氨酸分子和/或玉米素类似物；所述玉米素类似物具体可为腺嘌呤、腺嘌呤核苷、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、乙醇胺和2-甲基烯丙醇中的至少一种。所述微球具体可为为葡聚糖微球。上述方法中，在所述步骤(C)之后、(d)之前，包括至少I次以下操作以与所述靶标分子特异结合的核酸分子为起始文库，重复步骤(b)和(C)，每次操作均以前一次操作中得到的与所述靶标分子特异结合的核酸分子为起始核酸文库。上述方法中，可每一轮筛选逐步增加筛选压力，以增进所述核酸适体的富集程度。所述增加筛选压力可为线性减少核酸文库的物质的量，线性减少所述固定有靶标分子的微球的体积，减少所述核酸文库与所述固定有靶标分子的微球的孵育时间，以及相应线性增加所述固定有非靶标分子的微球的体积，增加所述核酸文库与所述固定有非靶标分子的微球的孵育时间。本发明的第五个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测物质是否含有玉米素的方法。该方法可包括如下(A)或(B)或(C)的步骤(A)将溶液M与上述核酸探针甲溶液混合孵育，作为实验组；将溶液N与所述核酸探针甲溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号；若所述实验组的荧光信号显著低于(统计学上在0. 05水平上显著低于)所述对照组的荧光信号，则所述待测物质含有或候选含有玉米素；反之，则所述待测物质不含有或候选不含有玉米素；所述溶液M由所述待测物质和杂交缓冲液组成，所述溶液N为所述杂交缓冲液；
(B)将溶液P与上述核酸探针乙溶液混合孵育，作为实验组；将溶液Q与所述核酸探针乙溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号；若所述实验组的荧光信号显著高于(统计学上在0. 05水平上显著高于)所述对照组的荧光信号，则所述待测物质含有或候选玉米素；反之，则所述待测物质不含有或候选不含有玉米素；所述溶液P由所述待测物质和杂交缓冲液组成，所述溶液Q为所述杂交缓冲液；(C)将溶液P与上述核酸探针丙溶液混合孵育，作为实验组；将溶液Q与所述核酸探针丙溶液混合孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号；若所述实验组的荧光信号显著高于(统计学上在0. 05水平上显著高于)所述对照组的荧光信号，则所述待测物质含有或候选玉米素；反之，则所述待测物质不含有或候选不含有玉米素；所述溶液P由所述待测物质和杂交缓冲液组成，所述溶液Q为所述杂交缓冲液。所述步骤(A)- (C)中，所述孵育的条件均具体可为室温、30分钟。所述“检测所述实验组和所述对照组的荧光信号”的参数具体可如下激发波长485nm，发射波长530nm。具体可米用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)进行动态检测。所述杂交缓冲液的PH可为4. 5-8. 6 (如7. 4)，离子强度为0. 01-2摩尔/升。所述步骤(A)中，具体可将195 u L所述核酸探针甲溶液与5 U L所述溶液M混合，并将195 u L所述核酸探针甲溶液与5 u L所述溶液N混合。所述核酸探针甲溶液具体可由所述核酸探针甲的核酸适体元件、所述互补元件和所述杂交缓冲液组成，所述核酸适体元件的浓度为0. 3 y M，所述互补元件的浓度为I. 2 y M。所述杂交缓冲液具体如下含IOmMNa2HPO4,2mM KH2PO4和150mM NaCl，其余为水，pH7. 4。所述溶液M中，所述待测物质的终浓度可为511] 、1011]\1或5011]\1。所述步骤(B)(或所述步骤(C))中，具体可将195 UL所述核酸探针乙溶液(或所述核酸探针丙溶液)与5 y L所述溶液P混合，并将195 u L所述核酸探针乙溶液(或所述核酸探针丙溶液)与5 u L所述溶液Q混合。所述核酸探针乙溶液(或所述核酸探针丙溶液)具体可由所述核酸探针乙(或所述核酸探针丙)的核酸适体元件、所述互补元件和所述杂交缓冲液组成，所述核酸适体元件的浓度为0.5 PM，所述互补元件的浓度为1.0 PM。所述杂交缓冲液具体如下含IOmM Na2HPO4,2mM KH2POjP 150mMNaCl，其余为水，pH7. 4。所述溶液P中，所述待测物质的终浓度可为10 PM。
本发明的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测物质中玉米素含量的方法。该方法可包括如下(D)或(E)的步骤(D)将待测物质溶液与所述核酸适体溶液孵育，之后加入纳米金溶液孵育，之后再加入氯化钠溶液，肉眼观察颜色变化，确定所述待测物质中所述玉米素的含量；在本发明中，所述确定所述待测物质中所述玉米素的含量具体可通过对照相同条件下不同浓度玉米素标准品的颜色变化来确定。(E)将所述核酸探针丁溶液与石墨烯溶液孵育，再将混合溶液与所述待测物质溶液孵育，然后检测荧光信号，确定所述待测物质中所述玉米素的含量。在本发明中，所述确定所述待测物质中所述玉米素的含量具体可通过对照相同条件下不同浓度玉米素标准品的荧光信号来确定，也可将所述待测物质的荧光信号值代入所述玉米素标准品与荧光信号的标准曲线中来确定。 所述步骤(D)和所述步骤(E)中，所述孵育条件均具体可为室温、30分钟。所述步骤(D)中，具体可将95 ii L所述核酸适体溶液与5 U L所述待测物质溶液混合，30分钟后加入95 ii L所述纳米金溶液，10分钟后再加入5 u L所述氯化钠溶液。所述核酸适体溶液具体可由以上任一所述核酸适体和所述缓冲液组成，所述核酸适体的浓度为0. 15 ii M ;所述缓冲液具体为含15mM Tris-HCl的水溶液，pH7. 4。所述待测物质溶液中，所述待测物质的终浓度可为0-20i! Mjn 1-15UM。所述氯化钠溶液的浓度可为170mM。所述纳米金溶液的浓度可为0. Img / mL。所述步骤(E)中，具体可将170 u L所述核酸探针丁溶液与25 y L所述石墨烯溶液混合，10分钟后加入5 u L所述待测物质溶液。所述核酸探针丁溶液可由所述核酸探针丁和缓冲液组成，所述核酸探针丁的浓度为0. 5 PM ;所述缓冲液具体如下含IOmMTris-HCl,150mM NaCl、5mM KCl和2mM MgCl2，其它为水，pH7. 4。所述待测物质的浓度可为0-50 y M，如3-50 PM。所述石墨烯溶液的浓度可为0. 7mg / mL。所述“检测所述实验组和所述对照组的荧光信号”的参数具体如下激发波长485nm，发射波长500_570nm。具体可采用荧光仪 FL4600 fluorescence spectrometer (Hitachi, Japan)进行检测。在本发明中，上述所有的所述玉米素均可为顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素及其核苷、核苷酸衍生物中的至少一种。本发明所提供的核酸适体以及核酸探针能够特异性的识别玉米素，且与反式玉米素及反式玉米素核苷的亲和力优于顺式玉米素及二氢玉米素，可用于检测待测物质中是否含有玉米素，及其含量，且本发明所提供的方法具有操作简单、灵敏、快速、特异、成本低等优点。本发明在玉米素的分离、富集和检测方面具有很高的应用价值。


图I为核酸适体随筛选轮次的富集过程；柱形图代表固定有反式玉米素分子的葡聚糖微球与羧基荧光素(FAM)标记文库，和第2轮至第11轮产物结合的情况。图2为核酸适体对玉米素及其类似物的识别。图3为核酸探针甲对玉米素的响应动态监测图。图中的5^、10^、50^代表的是反应体系中反式玉米素的终浓度。图4为核酸探针乙对玉米素的响应动态监测图。
图5为核酸适体2与纳米金共同检测不同浓度玉米素的响应图。图中道夫管上标0. 2 u M,0. 5 u MU u M,2 u M,5 u M,6 u M,8 u MUO u MU5 u M 20 y M 表示各自反
应体系中反式玉米素的终浓度。图6为核酸探针丁 _521墨烯共同检 测不同浓度玉米素的荧光响应图。在图6中，对应横坐标525nm波长处，沿着荧光强度由小到大的顺序，12条线所对应的反应体系中反式玉米素的终浓度依次为 0. liiM、0. 3iiM、0. 8iiM、2iiM、3iiM、4iiM、5iiM、10iiM、20iiM、30 ii M 和 50 ii M0图7为核酸探针丁 _521与石墨烯协作产生的信号变化对玉米素的浓度之间的线性关系。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。顺式玉米素(CZ)购于青岛腾龙微波科技有限公司，反式玉米素(TZ)购于北京拓英坊科技有限公司，二氢玉米素(DZ)购于北京和谐伟业化学科技有限公司，反式玉米素核苷(ZR)北京雷根生物技术有限公司，腺嘌呤(A)、腺嘌呤核苷(AR)、一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)、乙醇胺(AA)、2-甲基烯丙醇(MA)均购于北京化学试剂公司。结合缓冲溶液(pH7.4):含 137mM NaCl、2mM MgCl2,2. 7mM KCl、2mM KH2PO4 和 IOmMNa2HPO40洗脱缓冲液(pH8.0):含 25mM Tris-HClUOmM EDTA 和 3. 5M 尿素。实施例I、玉米素核酸适体的筛选一、L-组氨酸和玉米素的固定将0. 5g环氧活化Sepharose6B (通用电气医疗集团，瑞典)微球用IOOmL水反复洗涤，获得I. 75mL湿球，然后用0. 2M Na2CO3CpH 乂 12)置换溶胀的微球中的水分，在3. 5mL反应体系中加入45mM L-组氨酸或氨基修饰的反式玉米素(合成步骤见下文)，置于室温条件下振荡反应48h。反应结束后用pH4. 5醋酸钠缓冲溶液(0. IM醋酸钠，0. 5M NaCl)和pH12碳酸钠缓冲溶液(0. 2M NaHCO3 / Na2CO3,0. 5M NaCl ;即用 0. 2M Na2CO3 溶液加 HCl 调节 pH至12，同时使NaCl的浓度为0. 5M)反复交替洗涤微球，最后用水洗涤，并定容至3. 5mL，4°C冰箱保存。所述氨基修饰的反式玉米素具体合成步骤为1、将50mg反式玉米素及IOmg碳酸钾溶于2mL DMF溶液中，60°C反应I个小时；2、将20mg N- (2-溴乙基)邻苯二甲酰亚胺溶于500 u LDMF溶液中，并慢慢滴加至上述I混合液中，60°C反应10小时；3、将反应混合液进行薄层分离(展开剂二氯甲烷甲醇=体积比5:1)得到中间体I ;4、将IOmg上述所得中间体I溶于2mL乙醇中，将2mL50%水合肼溶液慢慢滴加至中间体I的乙醇溶液中，80°C反应2个小时；5、将得到的反应混合液进行高效液相色谱分离(流动相甲醇和0. l%(v / v)三氟乙酸水溶液两者的混合溶液,其中甲醇0. 1%三氟乙酸水溶液=体积比40% 60% ;色谱柱Agela，Venusil XBP C18, 5 u m, IOOA, 10 X 250mm ;流速3. 0 毫升 / 分钟；检测波长254纳米)，收集保留时间为4. 5min的峰，得到目标物氨基修饰的反式玉米素。二、随机核酸文库的设计与合成
设计合成两端包括20个固定核苷酸、中间包括45个核苷酸的随机文库如下5' -AAGGAGCAGCGTGGAGGATA(N45)TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3' ；N45 代表 45 个随机核苷酸序列，即N为A、T、C或G。三、核酸适体的筛选I、文库预处理将约60pmol步骤二设计合成的随机核酸文库溶于结合缓冲液，95°C变性5min,冰上冷却15min,室温放置5min。2、反筛和正筛对预处理后的随机核酸文库进行23轮的反筛-正筛(顺次完成一次反筛和一次正 筛为一轮筛选)。(I)反筛第I轮筛选，将步骤I预处理后的随机核酸文库与步骤一得到的固定有L-组氨酸的微球混合，25°C下孵育I小时，离心除去L-组氨酸微球。在第2-11轮筛选，将前一轮筛选(正筛)后得到的随机核酸文库溶液与步骤一得到的固定有L-组氨酸的微球混合，25°C下孵育I小时，离心除去L-组氨酸微球。(2)正筛将经过反筛过程得到的溶液与步骤一得到的固定反式玉米素的微球孵育一段时间(在第12-23轮筛选，将经过反筛过程得到的溶液中加入ImM腺苷以除去和玉米素类似物结合的核酸适体)。再用结合缓冲液清洗微球几次之后，用洗脱缓冲液在95°C加热5min，洗脱结合在玉米素微球上的DNA，测定洗脱液的荧光强度(除第I轮筛选的随机核酸文库没有进行荧光标记外，后续的文库均是用带荧光标记的引物进行PCR得到，即2-23轮文库均是带荧光标记的)。然后，向洗脱液中加入Iu L糖原(20mg / mL)和4倍体积的酒精，置于-20°C沉淀30min, 12000rpm离心15min,去上清，真空干燥，用100 U Lmillipore水定容。然后进行PCR扩增。PCR扩增的引物序列为5，-FAM-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3，；5’-Biotin-ACCACGACGACACACCCTAA-3’。PCR 扩增程序94°C 3min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s，10 个循环；72°C 5min。用链霉亲和素琼脂糖球从PCR产物中分离得到FAM标记的单链DNA (ssDNA)序列(用链霉亲和素球可以除去biotin标记的互补链，从而得到FAM标记的目标链，即2_23轮富集的随机核苷酸文库)。将得到的ssDNA用NAP-5柱子(通用电气医疗集团，瑞典)脱盐，真空干燥，用于下一轮的筛选。为了提高核酸适体的亲和力和特异性，在筛选过程中逐步增加洗涤次数、减少正筛球用量及与核酸文库孵育时间、增加反筛球用量及与核酸文库孵育时间，以增加筛选的压力。23轮筛选后，以筛选产物为模板通过引物(5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATA-3’和5’ -ACCACGACGACACACCCTAA-3’)进行PCR扩增，将PCR产物进行克隆测序。最终选择的核酸适体(Z5和11)如下核酸适体Z5:5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTATCCCCCGTTCTGATCTCTAATTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’ ；
核酸适体Z7:5’-AAGGAGCAGCGTGGAGGATATGGTTCGGCAGGTTTAAGGTTTATCTCTCATCCTCTCAATAGCACTTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3’ 。核酸适体随筛选轮次的富集过程如图I所示，与反式玉米素微球结合的核苷酸序列在第5轮时得到了明显富集，经过逐步加压后，结合序列在第8轮和第11轮又进一步得到富集。3、核酸适体的优化步骤2得到的核酸适体较长，经结构分析后，设计并合成一系列经截短的核酸序列，通过荧光染料修饰，然后考察它们与玉米素微球(步骤一得到的固定有反式玉米素的微球)的结合能力，挑选结合能力最强的序列用于进一步的应用，优化后的序列长度只有31-38个核苷酸。 最终得到的截短核酸适体序列如下核酸适体I:51 -C ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT G-3'(序列 I)核酸适体2:5, -GAGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGT II M CCCC-3'(序列 2)核酸适体3:5, -AAGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCTT-3 丨(序列 3)核酸适体4:5, -ACGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCGT-3'(序列 4)核酸适体5:5' -CGG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CCG-3'(序列 5)核酸适体6:5' -GG ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT CC-31 (序列 6)核酸适体7:5' -G ATATGGTTAGGCAGGCATAAGAGGTTTAT C-3'(序列 7)核酸适体8:5' -TGGAGG ATATGGTTCGGCAGGTTTAAGGTTTAT CTCTC-3'(序列 8)其中，每条核酸适体加粗下划线标记部分为保守序列，即所述核酸适体的共有序列。实施例2、玉米素核酸适体的特异性检测I、核酸适体预处理将0.5UM6-羧基荧光素(6-FAM)标记的核酸适体2 (序列2)溶于结合缓冲液，95°C变性5min，冰上冷却15min，室温放置5min。2、核酸适体特异性检测将L的玉米素微球(实施例I中步骤一得到的固定有反式玉米素的微球)与ImM的玉米素(顺式玉米素(CZ)、反式玉米素(TZ)、二氢玉米素(DZ)、反式玉米素核苷(ZR))及其类似物(腺嘌呤(A)、腺嘌呤核苷(AR)、一磷酸腺苷(AMP)、三磷酸腺苷(ATP)、乙醇胺(AA)、2_甲基烯丙醇(MA))中的任一种加入到步骤I预处理后的核酸适体溶液中(玉米素及其类似物作为核酸适体的竞争分子)，室温孵育30min，用洗脱缓冲液在95°C加热5min,洗脱结合在玉米素微球上的DNA,在激发波长485nm,发射波长530nm下,采用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)测定洗脱液的突光强度。突光强度越低表明核酸适体与该竞争分子的结合越强。同时设置未加任何竞争分子的实验组(CN)作为对照。将CN的荧光强度定为1，计算其他组的相对荧光强度。实验重复三次，结果取平均值。结果如图2所示，反式玉米素组、反式玉米素核苷组、顺式玉米素组和二氢玉米素组荧光值很低，说明玉米素类物质与核酸适体的结合很强；腺嘌呤组、腺嘌呤核苷组、一磷酸腺苷组、三磷酸腺苷组、乙醇胺组、2-甲基烯丙醇组荧光值很高，说明这些玉米素类似物与核酸适体的结合很弱。这一结果表明，该核酸适体具有较强的玉米素特异性。实施例3、核酸探针的制备

由上海生物工程公司合成如下四组核酸探针核酸探针甲由两条DNA片段(DNA片段甲-I和DNA片段甲-2)组成；DNA片段甲-I为核酸适体I (序列1)，且其5’末端具有6-FAM (荧光报告基团)、3’末端具有BHQl(荧光淬灭基团)，简称核酸适体元件；DNA片段甲-2为核酸适体I的部分反向互补序列(序列9)，简称互补元件；核酸探针乙由两条DNA片段(DNA片段乙-I和DNA片段乙-2)组成；DNA片段乙-I为核酸适体I (序列I)，且其5’末端具有6-FAM (突光报告基团),简称核酸适体兀件；DNA片段乙-2为核酸适体I的部分反向互补序列(序列10)，且其3’末端具有BHQl (荧光淬灭基团)，简称互补元件；核酸探针丙由两条DNA片段(DNA片段丙-I和DNA片段丙_2)组成；DNA片段丙-I为核酸适体5 (序列5)，且其第21位的T碱基具有6-FAM (荧光报告基团)，简称核酸适体元件；DNA片段丙-2为核酸适体的部分反向互补序列(序列11)，且其3’末端具有BHQl(荧光淬灭基团)，简称互补元件；核酸探针丁 (共9种)由一条DNA片段组成；DNA片段为核酸适体5 (序列5)，且其第21位的T碱基具有6-FAM (荧光报告基团)，简称核酸适体元件；该核酸探针丁记为核酸探针丁 _521 ;或DNA片段为核酸适体1_8中任一个(序列1-8中任一个),且5’末端具有6-FAM (突光报告基团)，简称核酸适体元件；这8个核酸探针丁，依据核酸适体的编码依次记为核酸探针丁-I至核酸探针丁 _8。序列9:5' -CATAAACCTCT-3'序列10:5' -AACCATATG-3'序列11:5' -AACCTCTTA-3'核酸适体探针的检测原理如下I、当检测体系中不存在玉米素时，核酸适体元件与互补元件杂交，核酸适体元件5’端的荧光报告基团和3’端的荧光淬灭基团远离，荧光恢复。当检测体系中存在玉米素时，玉米素与核酸适体元件的结合能力强于互补元件与核酸适体元件的结合能力，使得荧光报告基团和荧光淬灭基团接近，从而产生荧光的淬灭。(适用于核酸探针甲)2、当检测体系中不存在玉米素时，核酸适体元件与互补元件杂交，核酸适体元件5’端的荧光报告基团和互补元件3’端的荧光淬灭基团靠近，荧光被淬灭。当检测体系中存在玉米素时，玉米素与核酸适体元件的结合能力强于互补元件与核酸适体元件的结合能力，使得荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而产生明显的荧光。(适用于核酸探针乙、丙)3、当检测体系中不存在玉米素时，核酸适体元件吸附于石墨烯上，核酸适体元件5’端的荧光报告基团的荧光被淬灭。当检测体系中存在玉米素时，玉米素与核酸适体元件结合，使得核酸适体元件远离石墨烯，从而产生明显的荧光。(适用于核酸探针丁)实施例4、核酸探针甲对玉米素的响应检测探针缓冲液(pH7.4):含 IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4 和 150mM NaCl，其它为水。将实施例3制备的核酸探针甲进行如下实验
I、制备核酸探针体系核酸探针体系(核酸探针甲溶液)由核酸适体元件、互补元件和探针缓冲液组成，核酸适体元件的浓度为0. 3 ii M，互补元件的浓度为I. 2 ii M。4°C保存。2、取195 UL步骤I制备的核酸探针体系，采用向该溶液中逐渐追加反式玉米素的方式，加入5 UL含有不同浓度反式玉米素的溶液(用探针缓冲液配制，反式玉米素母液的浓度依次分别为200 u M、400 u M、2000 u M,使得反应体系中反式玉米素的终浓度依次为5iiM、10iiM、50iiM ;将探针缓冲液作为0浓度对照)，在室温下孵育，然后用酶标仪SpectraMax M5 (Molecular. Devices Corporation, USA)记录突光动态光谱，激发波长485nm,发射波长530nm。核酸探针甲的结果见图3，随着玉米素浓度的增加及孵育时间的延长，实验组的荧光强度呈明显的下降趋势，而对照组(0浓度对照)的荧光强度基本不变。这一结果表明，核酸探针甲对玉米素有很好的响应，并且其响应信号随着玉米素浓度的增大而增大。实施例5、核酸探针乙或丙对玉米素的响应检测探针缓冲液(pH7.4):含 IOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4 和 150mM NaCl，其它为水。将实施例3制备的核酸探针乙或丙进行如下实验I、制备核酸探针体系核酸探针体系(核酸探针乙或丙溶液)由核酸适体元件、互补元件和探针缓冲液组成，核酸适体元件的浓度为0. 5 ii M，互补元件的浓度为I. 0 ii M。4°C保存。2、取195 y L步骤I制备的核酸探针体系，加入5 U L反式玉米素溶液(用探针缓冲液配制，反式玉米素母液的浓度为400 u M，使得反应体系中反式玉米素的终浓度为10 y M ;将探针缓冲液作为0浓度对照)，在室温下孵育，然后用酶标仪SpectraMax M5(Molecular.Devices Corporation, USA)记录突光动态光谱,激发波长485nm,发射波长530nm。核酸探针乙的结果见图4，随着孵育时间的延长，实验组(玉米素终浓度IOiiM)的荧光强度呈明显的上升趋势，而对照组(0浓度对照)的荧光强度基本不变。这一结果表明，核酸探针乙对玉米素有很好的响应。核酸探针丙与核酸探针乙具有相似的结果。实施例6、核酸适体对不同浓度玉米素的响应考察缓冲液(pH7.4):含 15mM Tris-HCl，其它为水。将以上任一所述核酸适体进行如下实验I、制备核酸适体溶液
核酸适体(用缓冲液配制)浓度为0. 15 PM。4°C保存。2、步骤I制备的每种核酸适体溶液分别各取11份，每份95 u L，11份分别加入5 ii L反式玉米素溶液(用缓冲液配制，反式玉米素母液的浓度分别为8 ii M、20 ii M、40 u M、80 u M、200 u M、240 u M、320 u M、400 u M、600 ii M和800 u M,使得反应体系中反式玉米素的终浓度依次为 0. 2 ii M、0. 5 ii M、I ii M、2 ii M、5 ii M、6 ii M、8 ii M、10 ii M、15 ii M 和 20 ii M ;将缓冲液作为0浓度对照),在室温下孵育30分钟，然后加入95 ii L浓度为0. Img / mL纳米金溶液，孵育10分钟，之后加入5 u L170mM氯化钠水溶液，观察颜色变化。当检测体系中不存在玉米素时，核酸适体吸附于纳米金表面，当加入氯化钠后，纳米金被表面的核酸适体保护不发生聚集，从而呈现紫红色。当检测体系中存在玉米素时，玉米素与核酸适体结合使得核酸适体远离纳米金，当加入氯化钠后，纳米金由于缺少核酸适体的保护作用而发生聚集，颜色由紫红色向灰色转变。核酸适体2 (序列2)对不同浓度玉米素的响应结果见图5，从图中可以看出，核酸适体2对玉米素有很好的响应，并且其信号随着玉米素浓度增大而增大。当玉米素终浓度 在1-15 ii M范围内，核酸适体2与纳米金协作产生的颜色变化与玉米素的浓度呈现良好的相关性，即随着玉米素浓度的增大，反应体系的颜色呈现由紫红色向灰色的梯度转变。核酸适体I和核酸适体3-8与核酸适体2具有相似的结果。实施例7、核酸探针丁对不同浓度玉米素的响应考察探针缓冲液(pH7.4):含 IOmM Tris-HClU50mM NaCl、5mM KCl 和 2mM MgCl2，其它为水。将以上所述核酸探针丁进行如下实验I、制备核酸探针体系核酸探针体系(核酸探针丁溶液)由核酸探针丁和探针缓冲液组成，核酸探针丁的浓度为0.5 PM。4°C保存。由9种核酸探针丁制备得到9种核酸探针体系。2、步骤I制备的9种核酸探针体系分别各取12份，每份170 iiL，12份分别与25 u L浓度为0. 7mg / mL石墨烯溶液混合，10分钟后，分别加入5 u L反式玉米素溶液(用缓冲液配制，反式玉米素母液的浓度分别为4 ii M、12 ii M、32 ii M、80 u M、120 u M、160 u M、200 u M、400 u M、800 u M、1200 y M和2000 u M，使得反应体系中反式玉米素的终浓度依次为0. I u M、0. 3 u M、0. 8 ii M、2 ii M、3 ii M、4 ii M、5 ii M、10 ii M、20 ii M、30 ii M 和 50 ii M ;将缓冲液作为0浓度对照),在室温下孵育30分钟,然后用突光仪FL4600fluorescence spectrometer(Hitachi, Japan)记录荧光光谱，激发波长485nm，发射波长500_570nm。核酸探针丁 _521对不同浓度玉米素的响应结果见图6，从图中可以看出，核酸探针丁 _521对玉米素有很好的响应，并且其信号随着玉米素浓度增大而增大。在3-50 y M范围内，核酸探针丁 _521与石墨烯协作产生的信号变化对玉米素的浓度有很好地线性关系(图7)。核酸探针丁 -I至核酸探针丁 -8与核酸探针丁 _521具有相似的结果。
权利要求
1.核酸适体，为序列表的序列I至序列8中任一所示的单链DNA片段。
2.核酸探针，为核酸探针甲、核酸探针乙、核酸探针丙或核酸探针丁，其特征在于 所述核酸探针甲由单链DNA片段甲-I和单链DNA片段甲-2组成；所述单链DNA片段甲-I由序列表中序列I所示的核苷酸组成，且5'末端标记有荧光报告基团，3'末端标记有荧光淬灭基团；所述单链DNA片段甲-2由9-11个核苷酸组成，且能与序列表中序列I杂交； 所述核酸探针乙由单链DNA片段乙-I和单链DNA片段乙-2组成；所述单链DNA片段乙-I由序列表中序列I所示的核苷酸组成，且5'末端标记有荧光报告基团；所述单链DNA片段乙-2由9-11个核苷酸组成，能与序列表中序列I杂交，且3'末端具有荧光淬灭基团； 所述核酸探针丙由单链DNA片段丙-I和单链DNA片段丙-2组成；所述单链DNA片段丙-I由序列表中序列5所示核苷酸组成，且第21位的T标记有荧光报告基团；所述单链DNA片段丙-2由9或10个核苷酸组成，能与序列表中序列5第21-29位或第20-30位核苷酸杂交，且3'末端标记有荧光淬灭基团； 所述核酸探针丁由DNA片段丁组成；所述DNA片段丁为如下al)或a2): al)由序列表中序列5所不核苷酸组成,且第21位的T标记有突光报告基团。
a2)由序列表中序列I-序列8中任一所不核苷酸组成,且5'末端标记有突光报告基团。
3.根据权利要求2所述的核酸探针，其特征在于所述单链DNA片段甲-2与所述单链DNA片段甲-I上任意连续的9-11个核苷酸反向互补；所述单链DNA片段乙-2与所述单链DNA片段乙-I上任意连续的9-11个核苷酸反向互补；所述单链DNA片段丙-2与所述单链DNA片段丙-I上任意连续的9或10个核苷酸反向互补。
4.根据权利要求3所述的核酸探针，其特征在于所述单链DNA片段甲-2由序列表中序列9所示核苷酸组成；所述单链DNA片段乙-2由序列表中序列10所示核苷酸组成，且3/末端标记有荧光淬灭基团；所述单链DNA片段丙-2由序列表中序列11所示核苷酸组成，且3'末端标记有荧光淬灭基团。
5.含有权利要求I所述核酸适体、或权利要求2-4中任一所述核酸探针的试剂盒。
6.权利要求I所述核酸适体、或权利要求2-4中任一所述核酸探针，或权利要求5所述试剂盒在如下任一中的应用 (1)鉴定或辅助鉴定玉米素； (2)检测待测物质中玉米素浓度； (3)分离和/或富集玉米素。
7.筛选权利要求I所述核酸适体的方法，包括如下步骤 Ca)以如下核酸文库为起始核酸文库 . 5' -AAGGAGCAGCGTGGAGGATA (N45) TTAGGGTGTGTCGTCGTGGT-3'，其中 N 为 A、T、C 或 G; (b)将所述起始核酸文库的溶液与固定有非靶标分子的微球孵育，分离去除与所述非靶标分子结合的核酸分子，保留与所述非靶标分子不结合的核酸文库溶液； (c)将所述与非靶标分子不结合的核酸文库溶液与固定有靶标分子的微球孵育，分离得到与所述靶标分子特异结合的核酸分子； (d)得到核酸适体；所述靶标分子为玉米素分子；所述非靶标分子为如下物质中的至少一种L-组氨酸分子、腺嘌呤、腺嘌呤核苷、一磷酸腺苷、三磷酸腺苷、乙醇胺和2-甲基烯丙醇。
8.鉴定或辅助鉴定待测物质是否含有玉米素的方法，包括如下(A)或(B)或(C)的步骤 (A)将溶液M与权利要求2或3或4中所述核酸探针甲孵育，作为实验组；将溶液N与所述核酸探针甲孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号；若所述实验组的荧光信号低于所述对照组的荧光信号，则所述待测物质含有或候选含有玉米素；反之，则所述待测物质不含有或候选不含有玉米素；所述溶液M由所述待测物质和杂交缓冲液组成，所述溶液N为所述杂交缓冲液； (B)将溶液P与权利要求2或3或4中所述核酸探针乙孵育，作为实验组；将溶液Q与所述核酸探针乙孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号；若所述实验组的荧光信号高于所述对照组的荧光信号，则所述待测物质含有或候选玉米素；反之，则所述待测物质不含有或候选不含有玉米素；所述溶液P由所述待测物质和杂交缓冲液组成，所述溶液Q为所述杂交缓冲液； (C)将所述溶液P与权利要求2或3或4中所述核酸探针丙孵育，作为实验组；将所述溶液Q与所述核酸探针丙孵育，作为对照组；检测所述实验组和所述对照组的荧光信号；若所述实验组的荧光信号高于所述对照组的荧光信号，则所述待测物质含有或候选玉米素；反之，则所述待测物质不含有或候选不含有玉米素；所述溶液P由所述待测物质和杂交缓冲液组成，所述溶液Q为所述杂交缓冲液。
9.检测或辅助检测待测物质中玉米素含量的方法，包括如下(D)或(E)的步骤 (D)将待测物质与权利要求I所述核酸适体孵育，之后加入纳米金溶液孵育，之后再加入氯化钠溶液，观察颜色变化，确定所述待测物质中所述玉米素的含量； (E)将权利要求2或3或4中所述核酸探针丁与石墨烯孵育，再将混合溶液与所述待测物质孵育，然后检测荧光信号，确定所述待测物质中所述玉米素的含量。
10.根据权利要求6所述的应用，或权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述玉米素为顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素或反式玉米素核苷。
全文摘要
本发明公开了一种特异性识别玉米素的核酸适体及其筛选方法和应用。本发明所提供的核酸适体为序列表的序列1至序列8中任一所示的单链DNA片段。本发明所提供的核酸适体以及基于所述核酸适体的核酸探针能够特异性的识别玉米素，且与反式玉米素及反式玉米素核苷的亲和力优于顺式玉米素及二氢玉米素，可用于检测待测物质中是否含有玉米素，及其含量，且本发明所提供的方法具有操作简单、灵敏、快速、特异、成本低等优点，在玉米素的分离、富集和检测方面具有很高的应用价值。
文档编号C12N15/11GK102732523SQ20121022835
公开日2012年10月17日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者上官棣华, 乞萃, 刘祥军, 邴涛 申请人:中国科学院化学研究所