稻瘟菌MoLON1基因的功能及其应用的制作方法

专利名称：稻瘟菌MoLON1基因的功能及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物工程技术领域，具体涉及植物病害防治领域中影响稻瘟菌分生孢子产生与致病力的基因及其编码蛋白在植物病害防治中的应用，以及作为稻瘟菌防治药物靶标的应用。
背景技术：
由稻痕菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻痕病是影响世界水稻产量的重要病害，在我国已成为三大水稻病害之一。每年由稻瘟菌侵染造成的水稻产量损失在10%到30%左右，重病地块甚至会绝收。从2001到2005年，我国有570万公顷的水稻被稻瘟菌破坏(Wilson and Talbot，2009)。由于稻瘟病在经济方面的重要性，以及稻瘟菌在培养和遗传方面的易操作性，稻瘟菌致病系统已经成为研究植物病原真菌与寄主互作的理想模式系统。稻瘟菌与水稻相互作用的研究有助于理解稻瘟菌的致病机理，为建立稻瘟病防治的新方法和新途径提供科学依据。稻瘟菌能够侵 染处于各个生育期的水稻，并可侵染水稻的叶、茎、节和花序等组织。除了水稻外，该菌也能够侵染多种禾本科植物，如小麦、大麦，狗尾草等。稻瘟菌的侵染过程在细胞水平上的研究始于上世纪60年代(Suzuki，1965)。在其侵染的初期，分生孢子附着于叶片的表面(Tucker and Talbot, 2001) (Talbot, 2003) (Xu et al.,2007) 孢子萌发后，新生芽管可以识别水稻坚硬、疏水的表面，并在3小时内形成附着孢，附着孢通过兼容性溶质(如甘油)的积累可以形成高达SMPa的膨胀压。稻瘟菌借助于形成于附着孢的底部的侵染钉，和其他因子一起破坏寄主的表皮和细胞壁(Dean et al.，2005)，引导其进入第一个被侵染的表皮细胞。研究表明(Kankanala et al.，2007)，一旦真菌侵入植物组织，稻瘟菌首先形成未分支的侵染菌丝，然后分化形成球状侵染菌丝(Xu et al.，1998)，这些菌丝会迅速充满第一个被侵染的表皮细胞。这些侵染菌丝会寻找胞间连丝，沿着胞间连丝扩展去破坏其他的细胞。在侵染的早期阶段，稻瘟菌处于生物营养型阶段，在此过程中稻瘟菌被内陷的寄主细胞膜包被，球状、分支的稻瘟菌细胞可从活体植物细胞中吸收营养。随着侵染的扩展，当损伤变的明显时，稻瘟菌逐渐进入死体营养型阶段(Ebbole，2007 ；Talbot,2003)。在过去的数十年中，科学家们对稻瘟菌早期侵染过程的分子生物学机制已经有了比较明确的认识(Ding et al., 2010 ；ffilson and Talbot, 2009 ；Zhao et al., 2007) 比如，附着胞的发育和和细胞周期的调节紧密相关，一个编码在有丝分裂中必需的蛋白激酶基因(MgNIMA)基因的突变阻止了附着胞的发育(Veneault-Fourrey et al.，2006)。而附着胞中脂肪酸的分解代谢对侵染钉的形成至关重要，编码脂肪酸β氧化多功能酶MFPl基因的缺失会明显降低稻痕菌的致病性(Ramos-Pamplona and Naqvi, 2006 ；ffang et al.,
2007)。侵染钉的形成还需要MAPK信号途径的参与。MIGl基因编码的转录因子在MpslMAPK的下游起作用，Amigl突变体不能形成侵染性菌丝，故不能侵染植物(Mehrabi et al.,
2008)。
与稻瘟菌早期侵染过程的研究相比，由于侵染后涉及直接的互作过程，目前对侵染性菌丝在寄主体内的发育和生长机制研究较少，对稻瘟菌逃避或者抑制寄主的防御反应机制的研究也不够完善。虽然已经找到一些基因在菌丝侵染性生长中起作用，比如PMKl和PDElATPase，但是这些基因也同时参与了其他的发育和侵染过程(Ding et al.，2010)。对稻瘟菌的生长和侵入没有明显影响，而仅对稻瘟菌在植物体内侵染特异的基因和突变体报道不多。Urban等报道的ABC转运蛋白基因(Urban et al.，1999)，Chi等报道的DESl基因(Chi et al.,2009)和Ding等报道的组蛋白脱乙酰酶复合体(Ding et al.，2010)。2009年，Chi等报道了一个编码未知蛋白的DESl基因的敲除对稻瘟菌的发育和侵染没有明显影响，但是ADESl突变体侵染水稻后，不能再寄主体内进行侵染性生长。2010年，Ding等报道了组蛋白脱乙酰酶复合体也可以调节稻瘟菌在侵入植物后的侵染性的生长，从而揭示了染色质的修饰在在调节稻瘟菌致病中的重要性。因此，对稻瘟菌侵入植物后和植物的相互作用的研究不仅可以进一步的揭示两 种生物的作用机制，为防治稻瘟病提供理论依据，也已成为水稻-稻瘟菌互做研究的热点和难点问题。稻瘟菌与水稻互作犹如双方进行的一场分子战争。在这场战争中，ROS(reactionoxygenspecies,活性氧)是双方共用的武器。稻痕菌中NOXl和N0X2 (NADPH oxidaseIandNADPH oxidase 2)产生的ROS可以促进蛋白质交联到细胞壁上从而加速附着胞的成熟，增加其致病性(Egan et al.，2007)。而植物在受到侵染后也可以通过NOX产生的ROS来促进氧化交联从而增强细胞壁的防御能力(Bradley et al., 1992) ;R0S也可以促进植物中木质素和氧化酹类等抗微生物物质的合成(Chen and Schopfer, 1999);最直接的是,ROS可以直接杀死病原物(Levine et al.，1994)。而ROS对病原物的破坏的目标之一便是线粒体(Bulteau et al.,2006)。ROS通过对线粒体内蛋白的氧化修饰从而使其失活,对这些氧化修饰蛋白的修复和降解是维持线粒体稳态的重要因素，否则会弓I起线粒体结构的改变和细胞的死亡(Tsilibaris et al.，2006)。蛋白酶Lon可以识别这些被修饰蛋白所曝露出的疏水区域并将其降解从而维持线粒体内的平衡。通过对稻瘟菌内MoLONl基因的分析，鉴定阐明编码这些蛋白的基因对稻瘟菌致病性的影响，建立起ROS-Lon-线粒体-致病性的直接关系，并为寻找抗稻瘟菌的新型药物提供靶标。

发明内容
本发明的目的在于提供一种来自稻痕菌(Magnaporthe oryzae)气生菌丝生长、分生孢子形成、逆境应对和致病性必须的MoLONl基因及其编码的蛋白质；本发明的另一个目的是提供MoLONl基因在稻瘟病菌防治和在作为稻瘟菌药物防治的靶标作用的应用。本发明提供了一种来自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌丝扩展的MoLONl基因，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。一种来自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌丝扩展的MoLONl基因核苷酸序列所编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。一种用于蛋白质表达的载体pET-MoLonl，含有由MoLONl基因所编码的氨基酸序列。一种敲除载体，按来自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌丝扩展的MoLONl基因构建。
一种通过对MoLONl基因的敲除或修饰表达在稻瘟菌产孢量和侵染性菌丝扩展发生缺陷中的应用。MoLONl基因在植物病害防治药物的研究中作为靶标应用。MoLONl基因在植物抗逆境基因工程领域中的应用。MoLONl基因在防治由稻瘟菌引起的稻瘟病中的应用。MoLONl基因在植物病害防治药物的研究中作为靶标应用。由MoLONl基因核苷酸序列所编码的氨基酸序列作为靶标在设计和筛选抗稻瘟菌药物中的应用。以MoLONl基因中任一区域的核苷酸序列设计引物，并通过PCR用于MoLONl基因在不同药物处理后的表达检测。本发明证明了 MoLONl基因的突变或缺失导致稻瘟菌气生菌丝量减少、分生孢子产量降低、对多种逆境条件表现出敏感性增强和致病性明显降低，说明MoLONl基因是稻瘟菌致病所必须基因。本发明的有益效果在于，筛选能够阻断或抑制MoLONl基因表达的药剂，也就可以有效地控制稻瘟菌分生孢子的形成，从而减少病害循环次数，同时也可以有效减弱稻瘟病的发生，MoLONl基因以及蛋白质可以作为一个靶标用于新型杀菌剂的研究。


图1为MoLONl基因结构示意图
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其中:黑色线为内含子，黑色矩形为外显子。图2为不同生物Lonl蛋白质基酸序列同源对比示意图其中:MoLon为稻痕菌Lonl蛋白质序列，ScLon为酵母Lonl蛋白质序列,HsLon为人类Lonl蛋白质序列，EcLon为大肠杆菌Lonl蛋白质序列。图3为pXMoLONl稻瘟菌MoLONl基因敲除载体构建示意4为野生型菌株MoJJ88与突变体Λ 1nl气生菌丝生长状况对比照片其中:Α为野生型菌株气生菌丝状况，B为突变体Λ 1nl气生菌丝生长状况。图5为野生型菌株MoJJ88与突变体Λ 1nl分生孢子产量对比照片其中:Α为突变体Λ 1nl分生孢子产生量，B为野生型分生孢子产生量。图6为野生型菌株野生型菌株MoJJ88与突变体Λ 1nl对山梨醇敏感性对比照片其中:上幅照片是以含2%山梨醇的CM培养基接种，下幅照片是以含5%山梨醇的CM培养基接种。MoJJ88为野生型菌株，Molonl为基因缺失菌株。图7为野生型菌株MoJJ88与突变体Λ 1nl对刚果红敏感性对比照片其中:上幅照片是以含5%刚果红GR(Congc) red)的CM培养基接种，下幅照片是以含10%刚果红GR(Congo red)的CM培养基接种；Molonl/L0Nl为互补后菌株M0JJ88为野生型菌株；T-22为插入突变体菌株;Molonl为基因缺失菌株。图8为菌株MoJJ88与突变体Λ 1nl致病力对比照片其中:A为突变体Λ 1nl发病后病斑状况；Β为菌株MoJJ88发病后病斑状况。图9为MoJJ88与突变体Λ 1nl在水稻叶鞘细胞内扩展情况对比照片其中:Α为基因缺失菌株菌丝扩展情况，B为野生型菌株菌丝扩展情况，IH为侵染性菌丝，AP附着孢，IS为侵入位点。图10为MoLONl基因在细胞内的定位情况照片其中:A为绿色荧光显微观察；B为Mito-red染色后显微观察；C为原始菌丝形态显微观察；D为A和B两图合并分析生成。图11为MoLONl基因蛋白质表达、纯化后SDS-PAGE分析电泳图其中:I表示为表达纯化后MoLonl蛋白，M表示蛋白质Marker
具体实施例方式为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1、MoLONl基因的相关性分析MoLONl基因位于稻瘟菌I号染色体上，全长3434bp，含有I个内含子，2个外显子(见图1)。取MoLONl基因的氨基酸序列进行比对分析(http://blast.ncb1.nlm.nih.gov/)，发现MoLONl基因在多种生物内普遍存在，并且具有较高的同源性(见图2)。实施例2、MoLONl基因的敲除分析I)敲除载体的构建基因敲除采用同源重组的方法，用潮霉素磷酸转移酶基因替换野生型菌株MoJJ88中的MoLONl基因的部分编码区，具体构建策略见图3。以野生型菌株MoJJ88基因组DNA为模板，用引物 pX-upl (5，GCTCTAGAATGTACCTAGGATGG 3’，5’ 端含 Xba I 酶切位点)和 pX_up
2(5’ CGGGATCCTTGATGGTTATTGCT 3’，5’端含BamH I酶切位点)扩增出的片段作为左臂，用引物 pX-downl (5，GGGGTACCACGATGCCATTGAGGAGC 3’，其中 5’ 端含 Kpn I 酶切位点)和 pX-down2 (5’ GGAATTCGGAAAGACGAGCCCGAAG 3’，5’ 端含 EcoR I 酶切位点)扩增出的片段作为右臂。酶切后，分别按照上下游顺序分别连接到载体PXEH中潮霉素磷酸转移酶基因的两侧得到MoLONl基因的敲除载体pMoLONl (见图3)。2)稻瘟菌的转化与敲除突变体的获得a.稻瘟菌的遗传转化转化采用CaC12/PEG介导的真菌原生质体转化方法,用引物pX-upl和pX_down2组合PCR克隆含有潮霉素磷酸转移酶基因和左右臂序列的DNA片段，将该片段转化到野生型稻瘟菌菌株基因组中。具体操作(无菌操作)步骤如下:用野生型菌株MoJJ88产孢、收集孢子接种到500毫升三角瓶中的200毫升液体CM培养基内(酵母提取物0.1 %，酶水解干酪素0.05%，酸水解干酪素0.05%，，葡萄糖1%，硝酸钙0.1%，磷酸二氢钾0.02%，硫酸镁0.025 %，氯化钠0.015 % )，在26 °C、150转/分条件下摇培48小时。三层灭菌擦镜纸过滤并收集菌丝体，菌丝体用0.7M氯化钠溶液洗涤两次后转移至50毫升灭菌离心管中，每I克菌丝加入I毫升的酶渗透液(含20毫克/毫升崩溃酶，用0.7M氯化钠配制)，28°C、150转/分条件下酶解3 — 4时后，用0.7M氯化钠洗涤菌丝体，经三层灭菌擦镜纸过滤，收集原生质体，4，000转/分离心15分钟，先用25毫升STC(12M山梨醇，IOm MTris-cl, ρΗ7.5，50mM氯化钙)洗涤原生质体一次，然后分别用10毫升STC洗2次，离心沉淀后用ST C将原生质体浓度调至I又IO8个/毫升。将制备的原生质体分装于50毫升离心管中，每管150微升，加入等体积PCR片段和STC混合液，冰上放置20分钟，然后逐滴缓慢加入I毫升/管PTC溶液(60%聚已二醇3350，IOmMTris-HClPH7.5，50mM氯化钙)，冰上静止20分钟，加入25毫升/管冰冷的STC，缓慢混匀，4，000转/分、4°C离心15分钟，去上清，然后每管加入3毫升的LR培养基(0.1 %酵母提取物，0.1%酶水解干酪素，頂蔗糖)，室温静置培养12小时后，转入培养皿，加入约12升冷却至50°C左右的SR(LR+1.6%琼脂)，混匀，待其凝固吹干后，上面铺一层12毫升的0.7%琼脂(冷却至50°C左右，含250微克/毫升的潮霉素)。26°C培养4一6天，将出现的转化体转至含300微克/毫升潮霉素的CM固体培养基上，二次筛选后将单个菌落转入燕麦片-番茄培养基上培养，并进行单抱分离、保存菌种。b.转化子的PCR检测挑取部分转化子菌块接种于液体CM培养基内，18O转/分，2 5 °C下摇培3天，双层纱布过滤收集菌丝。CTAB法提取稻瘟菌基因组DNA，以稻瘟菌基因组DNA为模板，分别进行三次PCR扩增，I)引物MoLONl-1 (5，CAGCAAGAATACGAGCCG 3’)和MoL0Nl-2(5’ TGGTCCGACAAAGCAGAG3’ )扩增(扩增序列位于MoLONl基因敲除部分内部)。2)引物 HYG-1 (5，GTCGGCATCTACTCTATTCC 3’)和 HYG-2 (5，CCTATTCTACCCAAGCATCC 3’)扩增(扩增序列位于潮霉素磷酸转移酶基因内部)。3)引物HYG-1和pX-Rdown扩增(HYG-1位于潮霉素基因内，pX-Rdownl位于MoLONl基因右臂序列下游)。经过3次PCR验证(即引物组成I不能够扩增出目的条带，而引物组合2和3能够扩增出目的条带)，筛选出敲除突变体，并命名为Λ 1nl。实施例3、营养生长状况分析采用固体CM平板培养法。将菌块接种在固体CM培养基平板中，25 °C黑暗培养8天后照相观察。与野生型相比，突变体菌落生长速率减慢，气生菌丝数量明显减少(见图4)。实施例4、突变体分生孢子产生量分析

采用涂菌产孢法对野生型以及突变体的产孢情况进行比较分析。分别接种野生型稻瘟菌MoJJ88和突变体Λ 1nl在燕麦片-番茄培养基(燕麦片30克，番茄汁150ml，加水煮沸30分钟，20克琼脂，定容至I升，121°C高压灭菌30分钟)上，待菌落快长满平板后，采用灭菌棉签涂掉表面气生菌丝，盖上单层纱布，280C，持续光照培养3-5天，用灭菌的蒸馏水分别洗脱其分生孢子，并同血球计数板显微计数。此试验独立重复6次。与野生型相比，突变体分生孢子产生量明显下降(见图5)。实施例5、MoLONl基因在稻瘟菌应对各种逆境条件中的作用I)山梨醇敏感性研究将突变体与野生型菌株分别接种于含有2%和5%山梨醇的CM培养基上，25°C黑暗培养7天，照相并记录菌落生长状况。与野生型相比，突变体对山梨醇敏感性增强，表明相对于野生型来说，外环境渗透压的变化对突变体影响更大(见图6)。2)细胞壁完整性研究将突变体与野生型菌株分别接种于含有刚果红GR的CM培养基上，25°C黑暗培养7天，照相并记录菌落生长状况。与野生型相比，突变体对刚果红GR敏感性增强(见图7)。以上实验说明，在一些逆境条件下，与野生型相比，突变体细胞壁的完整性更难保持。实施例6、MoLONl基因在稻瘟菌致病性中的作用I)孢子液滴接种离体水稻叶片
将15微升野生型菌株MoJJ88与突变体Λ 1nl的分生孢子悬浮液(浓度为IXlO5个孢子每毫升)，分别接种于4-5叶期的吉粳88水稻叶片上。28°C黑暗保湿培养36小时后，继续光照保湿培养5天，观察发病情况。接种结果表明，野生型出现典型的稻瘟菌病斑，而突变体△ 1nl病斑不能扩展，致病力显著降低(见图8)。2)侵染性菌丝扩展情况分析采用水稻叶鞘接菌法。将15微升野生型菌株MoJJ88与突变体Λ 1nl的分生孢子悬浮液(浓度为I X IO5个孢子每毫升)，分别接种于4-5叶期的吉粳88水稻叶鞘细胞上。28°C黑暗保湿培养72小时后显微观察发病情况。接种结果表明，与野生型在叶鞘细胞内的大量扩展相比，突变体Λ 1nl侵染性菌丝扩展缓慢(见图9，其中AP:附着孢；IS:侵入位点；ΙΗ:侵染性菌丝)。实施例7、MoLonl的亚细胞定位I)互补以及亚细胞定位载体的构建以稻瘟菌基因组DNA为模板PCR扩增含有MoLONl基因启动子(ATG上游1.5Kb序列)和完整编码框的片段，并以PCB1532为骨架载体，构建完成用于互补以及亚细胞定位的载体pMoLonl-GFP，并通过上述原生质体转化方法进行转化与获得转化子。

2)荧光显微镜下观察互补菌株MoLonl::gfp中绿色荧光蛋白在气生菌丝内的定位分布，结合Mito-red染色结果，分析表明该融合蛋白定位在线粒体内(见图10，其中A为绿色荧光观察为Mito-red染色后显微观察；C为原始菌丝形态显微观察；D为A和B两图合并分析生成。)。实施例8、MoLonl蛋白的表达与纯化以pET28a为骨架载体，以稻瘟菌cDNA为模板PCR扩增含MoLONl基因完整阅读框的片段，构建完成蛋白质表达载体pET-MoLonl。并对该蛋白纯化后SDS-PAGE分析(见图11)。
权利要求
1.一种来自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌丝扩展的MoLONl基因，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。
2.按权利要求I所述的来自稻瘟菌的控制分生孢子形成和侵染性菌丝扩展的MoLONl基因，其特征在于由MoLONl基因核苷酸序列所编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 2所示。
3.一种用于蛋白质表达的载体pET-MoLonl,其特征在于含有权利要求2所述的氨基酸序列。
4.一种敲除载体，其特征在于按权利要求I所述的MoLONl基因构建。
5.一种通过对权利要求I中所述MoLONl基因的敲除或修饰表达在稻瘟菌产孢量和侵染性菌丝扩展发生缺陷中的应用。
6.权利要求I所述的MoLONl基因在植物抗逆境基因工程领域中的应用。
7.权利要求I所述的MoLONl基因在防治由稻瘟菌引起的稻瘟病中的应用。
8.权利要求I所述的MoLONl基因在植物病害防治药物的研究中作为靶标应用。
9.权利要求2所述的由MoLONl基因核苷酸序列所编码的氨基酸序列作为靶标在设计和筛选抗稻瘟菌药物中的应用。
全文摘要
稻瘟菌MoLON1基因的功能及其应用属生物工程技术领域，本发明涉及稻瘟菌MoLON1基因在致病过程中的功能以及其编码蛋白的纯化和用途，该基因与酵母、大肠杆菌等生物的ATP-依赖型蛋白酶Lon1具有较高的同源性，编码1119个氨基酸，含有1个内含子，2个外显子；MoLON1基因的敲除导致稻瘟菌气生菌丝数量减少，分生孢子产量降低，侵染性菌丝基本丧失在水稻叶片细胞内的扩展能力，对多种逆境条件表现出敏感性增强；本发明还涉及MoLON1基因所编码蛋白的表达与纯化，可作为候选靶标，用于设计和筛选抗稻瘟病菌的新型药剂。
文档编号C12N15/63GK103255150SQ20121022762
公开日2013年8月21日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者贾保磊, 李健, 王煜涵, 刘金亮, 张世宏, 潘洪玉 申请人:吉林大学