专利名称：一个特异追踪簇毛麦6vs染色体的分子标记及其用法的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域，具体涉及一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法。
背景技术：
小麦(Triticum aestivum L.)是全球三大粮食作物之一，也是我国总产第一的粮食作物，是保障我国粮食安全的重要决定因素之一。小麦在其生育进程中常会受到生物或非生物胁迫的影响。小麦白粉病(Erysiphe graminis f. sp. tritici)是一种世界性小麦病害，近年来随着我国农田水利设施改善和水肥条件提高，其危害逐年加重。通过远缘杂交和染色体工程技术手段育成的小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位系对目前已发现的白粉病生理小种均表现高抗或免疫，其抗白粉病基因Pm21位于簇毛麦6V染色体短臂上(6VS)，是目前对小麦白粉病抗谱最广、抗性最强的基因(见参考文献=Chen PD，Qi LL, Zhou B, ZhangSZ, Liu DJ. Development and molecular cytogenetic analysis of wheat-Haynaldiavillosa 6VS/6AL translocation lines specifying resistance to powdery mildew.Theor Appl Genet，1995，91 (6-7) :1125-1128)。近年来 T6AL. 6VS 易位系在小麦抗白粉病新品种选育中得到广泛利用，目前已育成20多个抗白粉病小麦新品种，推广面积超过5000万亩。T6AL. 6VS易位系是在普通小麦遗传背景中由簇毛麦6V染色体短臂(6VS)替换了普通小麦6A染色体的短臂(6AS)，从而形成T6AL. 6VS易位染色体。由于簇毛麦与普通小麦亲缘关系较远，导致二者不发生染色体重组，T6AL. 6VS易位染色体始终以易位的形式出现在后代中。目前，未发现利用T6AL. 6VS易位系培育的新品种或新品系中出现染色体易位形式的改变。因此，簇毛麦6VS控制的性状及其载有的DNA序列均以协同传递的方式出现在后代中。目前，部分研究已公布了部分与6VS上抗白粉病基因Pm21连锁的相关分子标记OPT 171400, OPT 171900, SCAR1400, SCAR1265, NAU/XiBao 15902 和 NAU/XiBaol61586 (见参考文献l、QiLL, Cao MS, Chen PD, Li WL, Liu DJ (1996). Identification, mapping, and applicationof polymorphic DNA associated with resistance gene Pm21 of wheat. Genome 39,191-197. 2、Liu ZY, Sun QX, Ni ZF et al (1999). Development of SCAR markers linkedwith Pm21 gene conferring resistance to the powdery mildew in common wheat.Plant breeding 118,215-219.3、Cao AZ, Wang XE, Chen YP, Zou Xff, Chen PD(2006). Asequence-specific PCR marker linked with Pm21 distinguishes chromosomes 6AS,6BS,6DS of Triticum aestivum and 6VS of Haynaldia villosa. Plant Breeding,125(3) :201-205. 4、Chen YP, Wang HZ, Cao AZ, Wang CM, Chen PD (2006) · Cloning of aresistance gene analog from wheat and deve lopment of a codominant PCR markerfor Pm21. Journel of Integrative Plant Biology, 48 (6) :715-721.)。但是，总体而言，这些标记在标记辅助选择育种中都存在不稳定的缺点，一个原因是由标记类型决定的，如RAPD标记0PT17_和0PT1719QQ ;其次是由于标记序列过长(大多接近或超过IOOObp)、PCR反应体系和反应条件要求苛刻，PCR结果可重复性差造成的。这些缺点均不利于标记辅助选择技术在小麦育种实践中的应用。EST(expressed sequence tag,表达序列标签)是指从植物不同组织来源的cDNA文库中随机挑选克隆，对其5’和3’端进行测序获得的短cDNA序列(见参考文献Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, Dubnick M, Polymeropoulos MH,1991. ComplementaryDNA sequencing expressed sequence tags and human genome project. Science,252 1651-1656)。EST-STS (sequence-tagged site, STS)标记是直接依据已经定位于基因组物理图上的EST序列设计引物，对基因组或者cDNA进行扩增，从中寻找与目的基因连锁或具有染色体特异性的EST标记。由于EST-STS标记直接来源于表达基因序列，保守性较高，特别有利于界定物种之间的差异(见参考文献La Rota M, Sorrells ME. 2004. ComparativeDNA sequence analysis of mapped wheat ESTs reveals the complexity of genomerelationships between wheat and rice. Funct Integr Genomics, 4 :34-46)。因此，基于比较基因组学原理，利用普通小麦EST图谱，同样可以开发普通小麦亲缘物种簇毛麦特定染色体的特异性分子标记。本发明就是基于上述思想指导下，利用比较基因组学原理，根据普通小麦bin-map图谱上第6部分同源群短臂上的EST序列设计以多聚酶链式反应(polymerase-chainreaction,PCR)为技术基础的EST-STS标记，筛选簇毛麦6V染色体短臂(6VS)特异性分子标记，用于快速检测和追踪普通小麦遗传背景中T6AL. 6VS易位染色体及其控制的抗白粉病性状，为小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、实用、高效的分子标记。
发明内容
本发明的目的是提供一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法，它利用比较基因组学原理，根据普通小麦bin-map图谱上第6部分同源群短臂的EST序列，设计以PCR技术为基础的EST-STS标记引物，筛选簇毛麦6VS染色体特异性分子标记，为抗白粉病小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位系在小麦抗白粉病新品种培育中的应用提供一种新型、实用、高效的分子标记辅助选择技术。为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案它是根据普通小麦bin-Map图谱第6部分同源群短臂的EST序列BG263579为模板设计得到的，标记引物扩增出的一段381bp的DNA条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，标记弓I物序列为6VS-381 F :5’ -CCAGTCGGAGAGGATCTCAA-3’6VS-381 R :5’ -TGGGCCTCTTGATCTTGACT-3’。本发明的用法为一、PCR反应体系10 μ L反应体系中含约10 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmol L-1MgCl2JQQmmol ΓΜΝΤΡ，左右引物终浓度各为 O. 2 μ mo I ΛO. 5U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10 μ L ;二、PCR反应程序94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60。。退火30秒，72°C延伸45秒，32个循环；72°C延伸10分钟；4°C保存；三、PCR产物检测PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。
本发明在追踪以T6AL. 6VS易位系为亲本的抗小麦白粉病性状时，凡是扩增出381bp条带的材料，都含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体，并对白粉病表现高抗；凡是不能扩增出381bp条带的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色体，相应丢失由6VS染色体控制的白粉病抗性。本发明具有以下有益效果I、本发明的分子标记6VS-381在鉴定簇毛麦6VS染色体时特异性强已开发的分子标记0PT1714(i(i和0PT1719(KI都非6VS特异性标记，只有在亲本间存在与6VS的多态性时，才可以利用。而使用6VS-381bp时，无论涉及何种亲本，只要出现381bp条带，就可以确定材料中含有6VS染色体。2、本发明的技术方案途径拓宽了小麦EST的使用范围利用比较基因组学原理，根据普通小麦第6部分同源群的EST序列开发的EST-STS标记，由于序列来自表达基因本身，在物种内部具有很高的保守性，在物种间也有较高的同源性，特别有利于鉴别物种间DNA序列的微小差异。从实验结果看，这种EST-STS标记是可行的，拓宽了小麦EST的使用范围。3、本发明的6VS染色体特异性EST-STS标记相较SCAR标记更易于识别“假阴性”:本标记引物在普通小麦遗传背景中，无论是否具有T6AL. 6VS易位染色体，都可以扩增出一条在普通小麦中完全保守的550bp的背景条带，普通小麦中国春、普通小麦-簇毛麦6V(6A)代换系、普通小麦-簇毛麦IV至7V添加系等材料均具有该550bp的背景条带，该条带可用于区分“标记阴性”还是“假阴性”凡具有381bp的条带的材料都有6VS染色体，为标记阳性，同时可以扩增出550bp的背景条带；凡具有550bp条带但不具有381bp条带的材料都没有6VS染色体，为标记阴性；同时缺失381bp和550bp条带的材料为PCR扩增失败导致的“假阴性”。前人开发的标记SCAR1265只能扩增出一条目标条带，没有背景条带，不能区分“标记阴性”和PCR失败造成的“假阴性”。4、本发明的分子标记对PCR条件的要求较为宽泛，容易为育种实践利用本发明的标记引物与模板的结合能力强，具有较宽泛的退火温度，其最佳设计退火温度为60°C，但在52-62°C的较大范围内均有较好的扩增效果；同时，本发明的标记由于目标条带较短，只有381bp，在PCR反应时，在同等时间内可运行较多的循环数，有利于提高标记辅助选择的效率，同时也可避免因PCR反应时间过长导致的多聚酶活性降低。而前人开发的0PT1714(KI、0PT1719Q(i、SCAR1400, SCAR1265, NAU/XiBao 15902 和 NAU/XiBao 161586 等标记对退火温度精确性要求高，同时由于目标条带过长，PCR反应需要的时间长，经常出现扩增失败的现象，扩增效率低，难以实际应用于标记辅助选择育种。5、本发明的标记与染色体分带(C-banding)、基因组原位杂交(GISH)等细胞学鉴定方法相比，成本低、效率高，容易在小麦育种实践中实现对大群体进行标记辅助选择。
图I为本发明中簇毛麦6VS染色体特异性标记6VS-381的DNA序列(381bp)及其两端引物序列(下划线标出引物序列)；图2为本发明中以普通小麦中国春(AABBDD)、簇毛麦(VV)、硬簇麦(AABBVV)、普通小麦-簇毛麦6V(6A)代换系、普通小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位系、普通小麦添加6VS缺失系(DAdel6VS，断裂位点FL. 58)、普通小麦分别添加I对簇毛麦1V、2V、3V、4V、5V、6V、7V染色体的添加系DNA为模板，用本发明中的6VS-381标记引物进行扩增，结果在簇毛麦、硬簇麦、T6AL. 6VS易位系、DA6V(6A)代换系、DA6V添加系中都扩增出381bp的条带，而6VS缺失系、普通小麦中国春、其他1V、2V、3V、4V、5V、7V添加系都没有该381bp条带，说明该381bp条带位于6VS上，且位于FLO. 58-1. 00的染色体区段上。箭头所示381bp条带为6VS特异性条带，箭头所示550bp条带为小麦背景条带；图3为本发明中6VS-381标记在簇毛麦6V染色体上的物理定位模式图；图4为本发明中用本发明中的标记6VS-381的引物对杂交组合“宁麦9号XT6AL. 6VS易位系”的分离群体进行鉴定，结合白粉菌接种鉴定，凡具有381bp目标条带的材料都表现抗白粉病(对应泳道上方用R表示)，凡不具有381bp的材料,都表现感白粉病(对应泳道上方用S表示)。其中，M为DNA分子量标准，I号泳道为簇毛麦，作为6VS染色体阳性对照材料，白色箭头所示为381bp条带，黑色箭头所示为抗白粉病的标记阳性材料。
具体实施例方式参看图1-4，本具体实施方式
采用以下技术方案它是根据普通小麦bin-Map图谱第6部分同源群短臂的EST序列BG263579为模板设计得到的，标记引物扩增出的一段38Ibp的DNA条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，标记引物序列为6VS-381 F :5，-CCAGTCGGAGAGGATCTCAA-3’6VS-381 R : 5 ’ -TGGGCCTCTTGATCTTGACT-3’。本发明的用法为一、PCR反应体系10 μ L反应体系中含约10 20ng模板DNA，IXPCR buffer, I. 5mmol L-1MgCl2JQQmmol ΓΜΝΤΡ，左右引物终浓度各为 O. 2 μ mo I Λ
O.5U Taq DNA聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10 μ L ;二、PCR反应程序94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60。。退火30秒，72°C延伸45秒，32个循环；72°C延伸10分钟；4°C保存；三、PCR产物检测PCR扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。本发明在追踪以T6AL. 6VS易位系为亲本的抗小麦白粉病性状时，凡是扩增出381bp条带的材料，都含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体，并对白粉病表现高抗；凡是不能扩增出381bp条带的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色体，相应丢失由6VS染色体控制的白粉病抗性。本具体实施方式
利用比较基因组学原理，根据普通小麦bin-map图谱第6部分同源群短臂EST序列设计以多聚酶链式反应(polymerase-chain reaction, PCR)为基础的EST-STS标记引物，筛选簇毛麦6VS染色体特异性分子标记，用于快速检测和追踪普通小麦遗传背景中抗白粉病易位染色体T6AL. 6VS，为小麦抗白粉病分子标记辅助选择育种提供新型、实用、高效的分子标记。实施例1、EST序列的获得根据美国农部网站http://wheat. pw. usda. gov的信息,搜索定位于普通小麦第6部分同源群的EST序列。2、引物的设计与合成
将步骤I搜索的EST序列,利用Primer Premier 5. O软件进行引物的设计，引物由上海联合基因有限公司合成。3、引物的稀释将步骤2中合成的引物，先用超纯水稀释成母液保存，使用前再将母液用I X TE稀释成工作液待用。4、簇毛麦6VS染色体特异性标记的筛选I)种质材料普通小麦中国春(Chinese Spring, AABBDD)、簇毛麦(Haynaldiavillosa, W)、硬族麦(T. durum-H. villosa amphiploid, AABBVV)、小麦-族毛麦 6V (6A)二体代换系DS6V(6A)、小麦-簇毛麦易位系T6AL. 6VS、6VS缺失系DAdel6VS (断裂位点FL0. 58)、小麦-簇毛麦IV 二体添加系(DAlV)、小麦-簇毛麦2V 二体添加系(DA2V)、小麦-簇毛麦3V 二体添加系(DA3V)、小麦-簇毛麦4V 二体添加系(DA4V)、小麦-簇毛麦5V二体添加系(DA5V)、小麦-簇毛麦6V 二体添加系(DA6V)、小麦-簇毛麦7V 二体添加系(DA7V)。上述种质材料均为公知公用种质材料，由南京农业大学细胞遗传研究所提供。2)利用步骤2设计合成的EST-STS引物，对上述种质材料DNA进行多态性扩增分析。PCR试剂组成:1(^1^反应体系中含约10 201^模板0嫩，1父卩0 buffer, I. 5mmol L-IMgC12,200mmol L-I dNTP，左右引物终浓度各为 O. 2 μ mo I L-1,0. 5U Taq DNA 聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10 μ L0 PCR程序为94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，32个循环；72°C延伸10分钟；4°C保存。PCR产物检测PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶(39 I)上电泳分离，用银染法染色。3)筛选出的6VS特异性分子标记6VS_381(引物序列为F:5’ -CCAGTCGGAGAGGATCTCAA-3’ 和 R :5’ -TGGGCCTCTTGATCTTGACT-3’ )对簇毛麦 6VS 染色体表现特异性，具体表现为簇毛麦、硬簇麦、DS6V(6A)、T6AL. 6VS、DA6V等具有完整6VS染色体的材料均能扩增出381bp的条带,凡不具6VS染色体的材料均没有该条带,说明标记6VS-381确为簇毛麦6VS染色体特异性标记。由于该标记在6VS缺失系DAdel6VS(FL. 58)中缺失，进而将6VS-381定位到簇毛麦6V染色体短臂FL. 58远侧端区域。5、簇毛麦6VS染色体特异性标记在标记辅助选择育种中的应用利用步骤4筛选到的簇毛麦6VS染色体特异性标记引物6VS-381，对宁麦9号(公知公用，由江苏省农业科学院培育)与抗白粉病T6AL. 6VS易位系(公知公用，由南京农业大学细胞遗传研究所创制并提供)杂交组合的分离群体进行鉴定，结合白粉病抗性鉴定，结果显不在所有供试材料中，凡具有381bp条带的材料，都表现闻抗白粉病；凡缺失381bp条带的材料都表现高感白粉病。
权利要求
1.一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法，其特征在于它是根据普通小麦bin-Map图谱第6部分同源群短臂的EST序列BG263579为模板设计得到的，标记引物扩增出的一段381bp的DNA条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，标记弓I物序列为6VS-381 F :5’ -CCAGTCGGAGAGGATCTCAA-3’6VS-381 R:5’ -TGGGCCTCTTGATCTTGACT-3’。
2.根据权利要求I所述的一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法，其使用方法为(一)PCR反应体系10yL反应体系中含约10 20ng模板DNA，1XPCR buffer,I. 5mmol L-1MgCl2JQQmmol ΓΜΝΤΡ，左右引物终浓度各为 O. 2 μ mo I Λθ·5υ Taq DNA 聚合酶，用无菌蒸馏水补充反应体系至10 μ L ; (二)PCR反应程序94°C预变性3分钟；94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸45秒，32个循环；72°C延伸10分钟;4°C保存；(三)PCR产物检测PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用银染法染色。
3.根据权利要求I所述的一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法，其特征在于它在追踪以T6AL. 6VS易位系为亲本的抗小麦白粉病性状时，凡是扩增出381bp条带的材料，都含有小麦-簇毛麦T6AL. 6VS易位染色体，并对白粉病表现高抗；凡是不能扩增出381bp条带的材料，都不具有T6AL. 6VS易位染色体，相应丢失由6VS染色体控制的白粉病抗性。
全文摘要
一个特异追踪簇毛麦6VS染色体的分子标记及其用法，它涉及分子生物学和遗传育种科学技术领域，它是根据普通小麦bin-Map图谱第6部分同源群短臂的EST序列BG263579为模板设计得到的，标记引物扩增出的一段381bp的DNA条带位于簇毛麦6VS染色体，可以特异地追踪6VS染色体及其控制的抗小麦白粉病性状，标记引物序列为6VS-381 F5’-CCAGTCGGAGAGGATCTCAA-3’6VS-381 R5’-TGGGCCTCTTGATCTTGACT-3’。它为小麦抗白粉病标记辅助选择育种提供了一种新型、实用、高效的分子标记。
文档编号C12Q1/68GK102925544SQ20121022612
公开日2013年2月13日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者别同德, 何华纲, 张伯桥, 吴宏亚 申请人:江苏里下河地区农业科学研究所