专利名称：一种用于检测变形球囊霉的种特异性引物对的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测变形球囊霉的引物对。
背景技术：
变形球囊霉(Glomusversiforme)是一种丛枝菌根(arbuscular mycohizal,AM)真菌，为寡营养活体微生物，能够侵染部分陆生植物根系形成菌根。变形球囊霉能够促进植物对各种营养元素的吸收，提高植物抗病抗旱能力等，而且在维持植物的多样性和生态系统的稳定性等方面起着极其重要的作用。目前，可以利用湿筛倾祈-蔗糖离心法从植物根际土壤中获得AM真菌的单个孢 子，然后提取其DNA，再使用真核生物通用引物对LR1/NDL22将其扩增出来，通过测序知道其准确的基因序列。然而，从具有多种AM真菌的土壤样品中，尚无法用现有的引物对从混合DNA样品中直接扩增出具有变形球囊霉(Glomus versiforme)遗传特性的25S rDNADl/D2可变区域的部分序列，给AM真菌侵染根系的检测研究带来了困难，并且以往的研究中所设计的引物对LR1/G. ver也不能特异性地从混合样品中扩增出相应的特异性DNA片段。
发明内容
本发明要解决现有的引物对无法准确地从含有多种AM真菌的样品中直接检测出具有变形球囊霉(Glomus versiforme)遗传特性的25S rDNA D1/D2可变区域部分序列，且现有引物对LR1/G. ver也不能特异性地从混合样品中扩增出相应的特异性DNA片段的问题，而提供一种用于检测变形球囊霉的种特异性引物对。用于检测变形球囊霉的种特异性引物对命名为G. ver F/G. ver R，由正向引物G. ver F和反向引物G. verR组成，正向引物G. verF的碱基序列为5 ' -GCATCTCCCAGGGTCTATAACA-3 '，反向引物G. ver R的碱基序列为5' -GAGTGAAGAGGGAAAAGCTCAA-3,。本发明用于检测变形球囊霉的种特异性引物对是根据变形球囊霉25S rDNA中D2区特异性序列而设计。本发明用于检测变形球囊霉的种特异性引物对作为PCR扩增的引物，可从含有多种AM真菌的土壤样品和菌根中快速准确地检测其中是否含有变形球囊霉(Glomusversiforme)，含有变形球囊霉的能扩增出长度为537bp的变形球囊霉特异性目的片段。本发明引物为快速准确检测土壤样品中的变形球囊霉奠定了基础。
图I是具体实施方式
一中利用引物对G. ver F/G. ver R对变形球囊霉进行PCR扩增检测的检测结果图，图I中“ M”泳道标样为Marker，“l”泳道标样为引物对G.ver F/G. ver R的PCR扩增产物。图2是具体实施方式
ニ中利用引物对LR1/G. ver对变形球囊霉进行PCR扩增检测的检测结果图，图2中“M”泳道标样为Marker，“I”泳道标样为引物对LR1/G. ver的PCR扩增产物。图3是具体实施方式
三中分别利用引物对LR1/G. ver和引物对G.ver F/G. ver R对人为添加变形球囊霉的含有多种AM真菌的土壤样品进行PCR扩增检测的检测结果图，图3中“M”泳道标样为Marker，“I”泳道标样为引物对LR1/G. ver的PCR扩增产物，“2”泳道标样为弓I物对G. ver F/G. verR的PCR扩增产物。图4中“M”泳道标样为Marker，“I”泳道标样为引物对G. ver F/G. ver R的PCR扩增产物，“2”泳道标样为引物对LR1/G. ver的PCR扩增产物。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式用于检测变形球囊霉的种特异性引物对命名为G. ver F/G. verR,由正向引物G. ver F和反向引物G. ver R组成，正向引物G. ver F的碱基序列为5 ' -GCATCTCCCAGGGTCTATAACA-3 '，反向引物G. verR的碱基序列为5' -GAGTGAAGAGGGAAAAGCTCAA-3'。本实施方式用于检测变形球囊霉的种特异性引物对的PCR扩增体系为50μ L，由LOyL 模板 DNA, 4. OyL 浓度为 2. 5mmol/L 的 dNTP、5. O μ LlOX 缓冲液(含 Mg2+)、5· O μ L浓度为10pmol/L的引物(G. ver F和G. ver R的终浓度)、O. 2 μ L浓度为5U/μ L的Taq DNA
聚合酶和余量无菌双蒸水组成。本实施方式用于检测变形球囊霉的种特异性引物对的PCR扩增反应条件预变性95°C、3min，变性 93°C、50s，退火 56°C、50s，延伸 72°C、50s，共 30 个循环，延伸 72°C、5min。利用本实施方式引物对G. ver F/G. ver R对变形球囊霉进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图I所示，从检测结果中能够清楚的看到扩增出一条为537bp的明显特异性条带。
具体实施方式
ニ 本实施方式采用现有引物对LR1/G. ver对变形球囊霉进行PCR扩增。引物对LR1/G. ver的正向引物LRl的碱基序列为5' -GCATATCAATAAGCGGAGGA-3'，引物对LR1/G. ver的反向引物G. ver的碱基序列为5' -GTCTATAACACTCTCCCGAAG-3'。本实施方式用于检测变形球囊霉的种特异性引物对的PCR扩增体系为50μ L，由LOyL 模板 DNA, 4. OyL 浓度为 2. 5mmol/L 的 dNTP、5. O μ LlOX 缓冲液(含 Mg2+)、5· O μ L浓度为10pmol/L的引物(LRl和G. ver的终浓度)、0· 2 μ L浓度为5U/ μ L的Taq DNA聚合酶和余量无菌双蒸水组成。PCR扩增反应条件预变性95 V、3min,变性93 V、Imin,退火58 °C、lmin,延伸72°C、lmin，共 30 个循环，延伸 72°C、5min。利用本实施方式引物对LR1/G. ver对变形球囊霉进行PCR扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2所示。用引物对LR1/G. ver对单独的变形球囊霉进行PCR扩增，同样可以得到一条明显的条带(约579bp)。
具体实施方式
三本实施方式向含有多种AM真菌的土壤样品中人为添加变形球囊霉，然后分别采用引物对LR1/G. ver和引物对G. ver F/G. ver R对其进行PCR扩增。引物对G. ver F/G. ver R的PCR扩增采用具体实施方式
一的方法，引物对LRl/G. ver的PCR扩增采用具体实施方式
ニ的方法。
本实施方式中含有多种AM真菌的土壤样品于2011年9月取自东北林业大学林场。经检测土壤样品中本身至少含有3种AM真菌，为根内球囊霉(Glomusintraradices)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)和美 _ 盾抱囊霉(Scutellosporacalosporaノ。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示。图3中引物对LRl/G. ver扩增出了两个条带；而引物对G. ver F/G. ver R仅扩增出了一条目的条带。说明引物对G. ver F/G. ver R的特异性优于引物对LR1/G. ver，适用于快速准确地检测变形球囊霉的存在。图3中可以看出本实施方式用于检测变形球囊霉的种特异性引物对G. ver F/ G. ver R能够准确扩增出变形球囊霉(Glomus versiforme)的25S rDNADl/D2可变区域部分序列片段。将图3中2号泳道对应的序列片段与PGM-T载体连接后转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞并测序，测序结果为序列长度为537bp，并且经Blast分析，为变形球囊霉(Glomus versiforme)特异性序列。
具体实施方式
四本实施方式将3种AM真菌混合，其中包括根内球囊霉(Glomusintraradices)、摩西球囊霉(Glomus mosseae)和美 _ 盾抱囊霉(Scutellosporacalospora),而不包括变形球囊霉(Glomus versiforme)。然后，分别采用引物对LR1/G. ver和引物对G. ver F/G. ver R对其进行PCR扩增。引物对G. ver F/G. ver R的PCR扩增采用具体实施方式
一的方法，引物对LRl/G. ver的PCR扩增采用具体实施方式
ニ的方法。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4所示。图4中引物对LRl/G. ver扩增出了非特异性条带；而引物对G. ver F/G. ver R没有扩增出任何条带。说明引物对G. verF/G. ver R的特异性明显优于引物对LR1/G. ver,适用于快速准确地检测变形球
囊霉的存在。图4的结果也验证了用于检测变形球囊霉的种特异性引物对是根据变形球囊霉25SrDNA中D2区特异性序列而设计的这一点。从图4的检测结果看出用于检测变形球囊霉的种特异性引物对G.ver F/G. ver R的电泳结果清晰，没有条带，肯定了检测样品中不包含变形球囊霉。而引物对LR1/G. ver的特异性差，出现了非特异性条带，无法判断样品中是否包含变形球囊霉，不能用于检测含有多种AM真菌的样品中是否有变形球囊霉(Glomusversiforme)的存在。
权利要求
1. 一种用于检测变形球囊霉的种特异性引物对，其特征在于用于检测变形球囊霉的种特异性引物对命名为G. ver F/G. ver R,由正向引物G. ver F和反向引物G. ver R组成,正向引物G. verF的碱基序列为5' -GCATCTCCCAGGGTCTATAACA-3'，反向引物G. verR的碱基序列为 5' -GAGTGAAGAGGGAAAAGCTCAA-3,。
全文摘要
一种用于检测变形球囊霉的种特异性引物对，它涉及一种用于检测变形球囊霉的引物对。它解决了现有的引物对无法准确地从含有多种AM真菌的样品中直接检测出具有变形球囊霉(Glomus versiforme)遗传特性的25S rDNA D1/D2可变区域部分序列，且现有引物对LR1/G.ver也不能特异性地从混合样品中扩增出相应的特异性DNA片段的问题。用于检测变形球囊霉的种特异性引物对命名为G.ver F/G.ver R，由正向引物G.ver F和反向引物G.ver R组成。本发明适用于变形球囊霉的检测。
文档编号C12R1/645GK102758013SQ201210227829
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月3日 优先权日2012年7月3日
发明者于春光, 接伟光, 杨明月, 白莉, 蔡柏岩 申请人:黑龙江东方学院