专利名称：酰胺酶基因cmeH及其编码蛋白质及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及酰胺酶基因cmeH及其编码蛋白质及其应用，具体涉及降解氯代こ酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)乙酰胺和除草剂敌稗的酰胺酶基因cmeH及其应用。
背景技术：
除草剂的使用在减轻农业劳动強度、保证农业正常生产的同时，其残留也带来了严重的作物药害问题，据统计我国毎年农田受除草剂药害面积达到3000万亩，其中严重药害面积达到500万亩，毎年造成几十亿元的损失，而抗除草剂转基因是解决除草剂药害的最佳途径。氯代こ酰胺类除草剂是ー类高效、高选择性的触杀性除草剤，对禾本科杂草具有 非常显著的杀除效果，其主要代表品种こ草胺和丁草胺是我国使用最多的三种除草剂中的两种，年使用量分别超过5千吨和I万吨。氯代こ酰胺类除草剂对鱼类有较强的毒性，こ草胺和丁草胺被美国环保局定为B-2类致癌物，它们还有不易挥发、不易光解、土壌残留期长的特点氯代こ酰胺类除草剂对作物存在隐性药害，对农业造成严重的损失。2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)こ酰胺是微生物降解氯代こ酰胺类除草剂的ー个重要中间代谢产物，2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺含有苯环，对生物特别是哺乳动物具有很强的毒性，对生态环境和人体健康有着巨大威胁。另外，2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺对主要农作物具有较强的毒害，对农业造成严重的损失。获得氯代こ酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的降解菌株和降解基因在治理除草剂残留，消除其药害技术研发中具有以下作用和功能，(一)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的能完全降解氯代こ酰胺类除草剂抗性转基因作物，(ニ)用于土壤、水体中除草剂氯代こ酰胺类除草剂残留中间产物的消除，(三)用于有用化工产品及药物合成的生物转化。因此降解基因在消除该类除草剂药害及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供ー种酰胺酶基因cmeH。本发明的另一目的是提供该基因编码蛋白质。本发明的又一目的是提供该基因的应用本发明的目的通过如下技术方案实现ー个酰胺酶基因cmeH，其核苷酸序列为SEQ ID NO. I。克隆该基因采取的策略为鸟枪法(见图I)。首先提取菌株DC-2 (CCTCC NO M2012190)的总DNA，总DNA采用Sau3AI部分酶切后和用BamHI酶切的质粒pUC118酶连，酶连产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞构建菌株DC-2的总DNA文库，将所有克隆子编号，挑每个单菌落一部分至96孔板静置培养，培养基中加入作用底物2-氯-N-(2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺。培养后加入缓冲液和显色剂(0. IM氨基比林30 u 1，0. IM铁氰化钾40U 1)，若生成2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的下游产物2，6-ニこ基苯胺，则溶液会显深红色，反之为黄緑色。得知阳性克隆子编号后可得到原始平板上的阳性克隆子。利用这种克隆方法可以对文库进行高通量的筛选。用上面的策略筛选鸟枪法构建的基因文库获得一个能在加入200ppm2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的基础盐培养基(葡萄糖为碳源)上加入显色剂后显深红色的阳性克隆子，进ー步的降解实验表明该阳性克隆子能降解2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)こ酰胺和敌稗。结果表明该阳性克隆子含有4262个碱基对，其中包含有23个潜在的ORF(大于150bp)，对这些潜在的ORF分别进行亚克隆和序列比对分析，最后确定编码目标酰胺酶基因的大小为903bp，命名为cmeH，序列为SEQ ID NO. I。这是首次克隆到能降解氯代こ酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的酰胺酶基因。所述的酰胺酶基因cmeH编码的酰胺酶蛋白质CmeH，其氨基酸序列为SEQ IDNO. 2。含有所述的酰胺酶基因cmeH的重组表达载体。所述的重组表达载体优选将所述的酰胺酶基因cmeH插入pET_29a(+)的NdeI和EcoRI位点之间所得。含有所述的酰胺酶基因cmeH的基因工程菌，所述的基因工程菌优选以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。所述酰胺酶基因cmeH在降解和转化氯代こ酰胺类除草剂中间体2_氯-N- (2_乙基-6-甲基苯基)こ酰胺和除草剂敌稗中的应用。所述的含有酰胺酶基因cmeH的重组表达载体在降解和转化氯代こ酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和除草剂敌稗中的应用。所述酰胺酶基因cmeH在构建降解氯代こ酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2_乙基-6-甲基苯基)こ酰胺和除草剂敌稗的转基因作物中的应用。所述酰胺酶蛋白质CmeH在降解氯代こ酰胺类除草剂中间体2_氯-N- (2_乙基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草剂敌稗中的应用。所述酰胺酶蛋白质CmeH在去除土壌、水体中氯代こ酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草剂敌稗中的应用。本发明的有益效果如下I.本发明筛选获得一株鞘酯菌DC-2 (CCTCC NO M 2012190)，质谱分析结果表明菌株DC-2可以把酰胺键断裂而降解氯代こ酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺。在此基础上，本发明用鸟枪法成功的从菌株DC-2 (CCTCC NO M 2012190)中克隆出酰胺酶基因cmeH。在GenBank比对结果表明该基因为ー个新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为903bp，编码300个氨基酸。2.本发明提供的酰胺酶CmeH能在Ihr内完全降解100mg/L的氯代こ酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺，此外CmeH还能在3hr内完全降解 100mg/L的除草剂敌稗。CmeH可用于构建抗2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、敌稗的转基因作物，也可用于土壤、水体中2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、敌稗残留的去除及药物合成的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。
图I酰胺酶基因cmeH克隆的策略图。图2酰胺酶基因cmeH在BL21 (pET_29a(+))中表达策略图。图3酰胺酶CmeH蛋白电泳图谱；其中泳道I为蛋白质marker,泳道2为纯化的酰胺酶CmeH蛋白。图4酰胺酶CmeH催化的降解2_氯-N- (2_こ基_6_甲基苯基)こ酰胺GC/MS图谱；A :2_氯-N-(2-こ基_6_甲基苯基)こ酰胺的酶降解反应液ニ氯甲烷提取物的GC
图谱:保留时间为5. 53min的物质ー级质谱图；C :保留时间为3. 73min的物质ー级质谱图。图5酰胺酶CmeH降解2_氯-N- (2_こ基_6_甲基苯基)こ酰胺的途径。图6CmeH催化的敌稗降解产物GC/MS图谱；A :敌稗的酶降解反应液ニ氯甲烷提取物的GC图谱；B :保留时间为4. 38min的物质ー级质谱图；图7酰胺酶CmeH降解敌稗的途径。生物材料保藏信息鞘酯菌DC-2 (Sphingobium quisquiliarum DC-2)，保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO M 2012190，保藏日期为2012年5月30日。
具体实施例方式实施例II. I氯代こ酰胺类除草剂降解菌DC-2 (CCTCC NO M 2012190)的分离用来富集氯代こ酰胺类除草剂降解菌株的富集基质取自江苏昆山市绿利来农药厂农药废水生化处理池的活性污泥，取活性污泥5. Og加入IOOml基础盐培养基中，加入50mg じ1的丁草胺，30°C，180r .mirT1培养7d天，以5%的接种量转接到相同的培养基中，连续转接3次，梯度稀释富集液，取10_4 10_7稀释度的富集液各0. ImL涂布于加有IOOmg じ1丁草胺的固体培养基平板上，30°C培养4d后，挑取长出的单菌落接种于含IOOmg じ1各种氯代こ酰胺类除草剂(丁草胺、こ草胺、甲草胺和异丙甲草胺)的培养基中，30°C，180r .min-1摇床培养5d,验证其降解效果。基础盐培养基配方为5. Og葡萄糖，I. Og NH4NO3, I. OgNaCl, I. 5g K2HPO4, 0. 5g KH2PO4, 0. 2g MgSO4 *7H20，加水至 lL，pH 7. 0.固体培养基加 15. Og琼脂。降解效果的验证方法在培养液中加入等体积的ニ氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取Iml下层ニ氯甲烷挥发完全后，加入ImL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22 pm)过滤。采用高效液相色谱测定提取液中丁氯代こ酰胺类除草剤、中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草剂敌稗的含量，液相色谱条件流动相为甲醇水(80 :20, V/V), Zorbax C218 ODS Spherex 反相柱(5 u m, 4. 6mmX 250mm, Agilent,USA)，柱温为室温，紫外检测器，测定波长230nm，进样量20 iiL，流速为OJmL^mirT1。外标法按峰面积定量。另外还可采用气相色谱检测提取液中氯代こ酰胺类除草剤、中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草剂敌稗的含量，检测方法柱型BD-5MS石英毛细管柱(15mX0. 25mmX0. 25 u m);样品进样量2y L ;分流比30 ;载气氦气；载气流速lml/min ;进样ロ温度为230°C，柱温为200°C。一级质谱条件离子检测方式为多反应离子检测；离子极性为负离子；离子化方式为电喷雾离子化；毛细管电压为4000伏；干燥气温度330°C;干燥气流速10. OL/min，雾化气压カ35psi，碰撞电压135伏；质量扫描范围(m/z) :300-500。ニ级子离子质谱条件碰撞电压90伏；质量扫描范围(m/z) 30-4000从富集液中，分离到I株氯代こ酰胺类除草剂降解菌，命名为DC-2，该菌在3d内对200mg じ1的丁草胺、こ草胺、甲草胺、敌稗和2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的降解率均达到90%以上。I. 2氯代こ酰胺类除草剂降解菌DC-2的鉴定和生物学特性菌株形态及生理生化特性测定參照文献常见细菌系统鉴定手册(东秀珠主编，北京，科学出版社，2001)进行。 菌株DC-2属革兰氏阴性菌，菌落黄色，边缘整齐，菌落圆形并突起，湿润光滑，不透明，易挑取；菌体杆状，没有观察到鞭毛。能利用甘露醇、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、鼠李糖、D-核糖、N-こ酰葡萄糖胺。16S rRNA基因序列系统发育分析菌株总DNA的提取采用高盐法，并以总DNA作为模板，进行16S rRNA基因序列的扩增。用于扩增反应的引物为ー对通用引物，上游引物5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(SEQ ID No. 5)，下游引物5' -TACCTTGTTACGACTT-3，(SEQID No. 6) o 25 u L PCR 反应体系为模板 I ii L，dNTP (25mmol/L) 2 y L，引物(lmmol/L)各I u L, IOXTaq 缓冲液 2. 5 U L, Mg2+(25mmol/L) I. 5u L, Taq 酶(5U/U L) 0. 3 U L,超纯水15. 7 iiし聚合酶链式反应条件95°C预变性5min ;94°C变性0. 5min，52°C退火lmin，72°C延伸lmin，循环30次；72°C延伸lOmin。采用PCR回收试剂盒(AXYGEN公司)回收16S rDNA的基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小(I. 5kb左右)，TA克隆后进行测序(由BI0AISA公司完成)。测序结果通过在线分析，与RDP数据库(https ://rdp. cme. msu. edu/)中的模式菌株16S rRNA基因序列进行相似性比较。结果显示菌株DC-2与鞘酯菌属同源性最高，与Sphingobium quisqui liarum P25 (T)的同源性达到100%,结合生理生化特征将该菌鉴定为鞘酯菌属，将该菌株送交位于中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO M 2012190，保藏日期为2012年5月30日。实施例2菌株DC-2的培养方法I)将DC-2 (CCTCC NO M 2012190)试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按10% (v/v,以培养基体积为基准)的接种量接种入装液量为70%的500升种子罐，培养至对数生长期；3)将种子液按10% (v/v,以培养基体积为基准)的接种量接入生产罐培养；4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.0，搅拌速度为220转/分，培养温度为30°C，全流程培养时间为50小吋，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂。以上所用的发酵培养基、种子罐培养基及生产罐培养基相同，配方为葡萄糖0. lwt%，蛋白胨 0. 5wt%，酵母膏 0. 25wt%, pH7. 2-7. 5。实施例3酰胺酶基因cmeH的克隆(策略图见图I)3. I细菌基因组总DNA的提取菌株DC-2 (CCTCC NO M 2012190)在LB培养基中大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的DC-2的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8. 0)中，置于_20°C保藏，具体方法參考F 奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。3. 2pUCl 18 (BamHI)购买于宝生物工程(大连)有限公司。3. 3 总 DNA 的酶切 Sphingobium quisqui liarum DC-2 总 DNA 米用 Sau3AI 部分酶切。 3.4DNA 的回收酶切后的总DNA通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用axygenbiosciences (China)回收试剂盒进行回收，回收的 DNA 溶于 10mmol /I,的 Tris *HC1 (pH8. 0)中，置于-20°C保藏。3. 5 酶连建立如下反应体系
|)l；('Ii SitaIID0.1 pg
总DNA片段0.1 pg
IOx连接酶缓冲液I pl
T4 DNA连接_0.5加双蒸水个IOpi16°C温育 12 小时。3. 6转化及筛选取10 ill酶连产物转化200 ill大肠杆菌DH5 a感受态细胞(TaKaRa，Code:D9057)，具体方法參照F.奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》P23。涂布含有100mg/kg氨苄青霉素的LB平板上，培养24小吋。将所有克隆子编号，挑每个单菌落一部分至96孔板静置培养，培养基中加入作用底物2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺。培养后加入缓冲液和显色剂(0. IM氨基比林30 u 1，0. IM铁氰化钾40 u I )，若生成2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺的下游产物2，6- ニこ基苯胺，则溶液会显深红色，反之为黄緑色。得知阳性克隆子编号后可得到原始平板上的阳性克隆子。利用这种克隆方法可以对文库进行高通量的筛选。进ー步验证克隆子能否降解2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敌稗。克隆子对2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敌稗的降解试验方法降解效果的验证方法在培养液中加入等体积的ニ氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取Iml下层ニ氯甲烷挥发完全后，加入ImL甲醇溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0. 22 pm)过滤。采用高效液相色谱测定提取液中丁氯代こ酰胺类除草剤、中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草剂敌稗的含量，液相色谱条件流动相为甲醇水(80 20,V/V), Zorbax C218 ODS Spherex 反相柱(5 u m, 4. 6mm X 250mm, Agilent, USA),柱温为室温，紫外检测器，測定波长230nm，进样量20y L，流速为0. SmL min'外标法按峰面积定量。另外还可采用气相色谱检测提取液中氯代こ酰胺类除草剤、中间体2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺、除草剂敌稗的含量，检测方法柱型BD-5MS石英毛细管柱(15mX0. 25mmX0. 25 u m);样品进样量2 u L ;分流比30 ;载气:氦气;载气流速lml/min ；进样ロ温度为230°C，柱温为200°C。一级质谱条件离子检测方式为多反应离子检测；离子极性为负离子；离子化方式为电喷雾离子化；毛细管电压为4000伏；干燥气温度330°C;干燥气流速10. OL/min,雾化气压カ35psi，碰撞电压135伏；质量扫描范围(m/z)300-500。ニ级子离子质谱条件碰撞电压90伏；质量扫描范围(m/z) 30-40003. 7基因核苷酸序列測定将3. 6中获得的能降解2-氯-N- (2_こ基_6_甲基苯基)こ酰胺和敌稗的阳性克隆子委托上海英骏生物技术有限公司进行序列測定，酰胺酶基因cmeH的核苷酸序列为 SEQ ID NO. 1，全长为903bp。根据酰胺酶基因cmeH核苷酸序列所推断的300个氨基酸序列为SEQ ID NO. 2，理论大小为31. 6kda。实施例4酰胺酶基因cmeH在BL21(pET_29a(+))中的高效表达(策略图见图2)4. I酰胺酶基因的PCR扩增以if 向引物5’ -GGAATTCCATATGGGTACTTCACCCCAG-3’ (SEQ ID NO. 3)和反向引物5 ^ CCGGAATTCGGCGCCCTTGAACCAC-3，(SEQ ID NO. 4)为引物，用 PCR 从 SphingobiumDC-2(CCTCC NO M 2012190)基因组DNA中扩增出酰胺酶基因片段。扩增体系
Primer ftorfll (5U/|J)0,5 pi
> X PCR Buffer 11 (Mg:_+Plus)10 |d
dNTP Mixture(各2.5mM)5 nl
校板 DN A10 Hg
(20pM)_
反向引物(20pM)I |il
灭菌蒸 水1150_PCR扩增程序a. 95°C 变性 3min ；b. 95°C变性 I. 5min，53°C退火 0. 5min，72°C延伸 I. 5min，进行 30 个循环；c. 72°C延伸lOmin，冷却到室温。4. 2PCR 产物用 NdeI 和 EcoRI 双酶切。酶切体系Nde II U IEcoRII U IDNA^lug
灭菌的蒸馏水加至20 U I在37°C水浴中，反应3h以上。酶切产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳切胶回收。4. 3pET-29a(+)用 NdeI 和 EcoRI 双酶切(參考 2. 2)。4. 4 转化4. 2中的回收片段和4. 3中酶切好的pET_29a(+)进行酶连(參考3. 5)。酶连好的含酰胺酶基因cmeH的pET-29a(+)重组质粒pET_29a (+)-cmeH的pET_29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21 (DE3)获得重组微生物BL21 (CmeH)。4. 5CmeH的表达、纯化和功能验证BL21 (CmeH)在LB培养基中培养至0D600nm为0. 6到0. 8之间，加IPTG至浓度 lmM，30°C培养4个小时。IOOml菌液离心，用IOml (50mM，pH 7. 0) PBS缓冲液重悬菌体，超声破碎(Auto Science, UH-650B ultrasonic processor, 30%intensity) 5 分钟，离心，收集上清，用镍离子亲和层析柱对CmeH进行了纯化，得酰胺酶CmeH，CmeH电泳图谱见图3，其条带大小和理论预测的大小(31. 6kda)相一致。4. 6CmeH 活力测定酶活反应体系50mM磷酸缓冲液(pH 7. 0)，0. 2mM靶标底物(2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺或敌稗)、反应酶量(4. 5中纯化所得)50iil，30°C反应20min。每个反应以加入酶开始计时，用3ml ニ氯甲烷終止反应，分层后有机相经无水硫酸钠脱水，2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敌稗含量用反向HPLC測定(具体方法见3. 6)。ー个酶活力単位(U)定义为在pH 7.0，温度30 °C条件下，每分钟催化减少lymol2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺或敌稗所需的酶量。降解试验表明纯化后的CmeH能在3hr内降解100mg/kg的2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺或敌稗，酶学试验表明CmeH对2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敌稗的比酶活分别为67和55U/mg protein。4. 7代谢产物的确定4. 6中的2-氯-N- (2_こ基_6_甲基苯基)こ酰胺和敌稗的酶反应液的ニ氯甲烷提取物经氮气吹干后溶于IOOyL甲醇，利用GC/MS測定反应液中的代谢产物。检测方法柱型BD-5MS石英毛细管柱(15mX0. 25mmX0. 25iim);升温条件柱子初始温度50°C，维持lmin，以10°C /min升温至210°C，再保持2min，再以20°C min-1升温至240°C，再维持IOmin ;样品进样量2ii L ;分流比30 ;载气氦气；载气流速lml/min ;进样ロ温度为250°C。质谱操作条件离子源为EI源；离子源温度250°C ;—级质谱条件离子检测方式为多反应离子检测；离子极性为负离子；离子化方式为电喷雾离子化；毛细管电压为4000伏；干燥气温度330°C ;干燥气流速10. 0L/min，雾化气压カ35psi，碰撞电压135伏；质量扫描范围(m/z) :300-500。ニ级子离子质谱条件碰撞电压90伏；质量扫描范围(m/z):30-400。一级质谱条件 离子检测方式为多反应离子检测；离子极性为负离子；离子化方式为电喷雾离子化；毛细管电压为4000伏；干燥气温度330°C;干燥气流速10. 0L/min，雾化气压カ35psi，碰撞电压135伏；质量扫描范围(m/z):300-500。ニ级子离子质谱条件碰撞电压90伏；质量扫描范围(m/z) :30-400o2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)こ酰胺和敌稗的酶降解反应液的ニ氯甲烷提取物的GC/MS图谱见图4A、图6A，由图谱数据分析得出2-氯-N- (2-こ基-6-甲基苯基)乙酰胺、敌稗分别经CmeH水解断裂酰胺键后生成2-こ基-6-甲基苯胺(图4C)、3，4- ニ氯苯胺(图6B)，生化反应途径见图5、图7。以上实施例中使用的微生物来源如下pUCl 18 (BamHI)购自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌DHDH5 a购 自宝生物工程(大连)有限公司，大肠杆菌高表达载体pET_29a(+)购自Novegen公司，表达宿主菌大肠杆菌BL21(DE3) 购自上海英骏生物技术有限公司。
权利要求
1.一个酰胺酶基因cmeH，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO. I。
2.权利要求I所述的酰胺酶基因cmeH编码的酰胺酶蛋白质CmeH，其特征在于氨基酸序列为 SEQ ID NO. 2。
3.含有权利要求I所述的酰胺酶基因cmeH的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于将权利要求I所述的酰胺酶基因cmeH插入pET_29a(+)的NdeI和EcoRI位点之间所得。
5.含有权利要求I所述的酰胺酶基因cmeH的基因工程菌，所述的基因工程菌优选以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株。
6.权利要求I所述酰胺酶基因cmeH在降解和转化氯代乙酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺和除草剂敌稗中的应用。
7.权利要求I所述酰胺酶基因cmeH在构建降解氯代乙酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺和除草剂敌稗的转基因作物中的应用。
8.权利要求2所述酰胺酶蛋白质CmeH在降解氯代乙酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草剂敌稗中的应用。
9.权利要求2所述的酰胺酶蛋白质CmeH在去除土壤、水体中氯代乙酰胺类除草剂中间体2-氯-N- (2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草剂敌稗中的应用。
全文摘要
本发明公开了酰胺酶基因cmeH及其编码的蛋白质及其应用。本发明酰胺酶基因cmeH全长为903bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物酰胺酶CmeH含300个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2。CmeH能降解氯代乙酰胺类除草剂中间体2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草剂敌稗。酰胺酶基因CmeH可用于构建可降解氯代乙酰胺类除草剂中间体2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草剂敌稗的转基因作物，也可用于土壤、水体中氯代乙酰胺类除草剂中间体2-氯-N-(2-乙基-6-甲基苯基)乙酰胺、除草剂敌稗的残留的去除及新型药物合成的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。
文档编号C12N1/21GK102757972SQ201210227768
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月2日 优先权日2012年7月2日
发明者何健, 李怡, 李顺鹏, 陈青 申请人:南京农业大学