专利名称：原核dna的富集方法
技术领域：
本发明涉及一种富集原核DNA的方法，以及用于实施所述方法的试剂盒。
由细菌引起的感染是炎性疾病的最常见起因之一。对于临床病程的预后，以及尤其是对于合适治疗措施的及时选择，细菌病原体的早期检测具有决定性的重要性。
在细菌病原体的检测中，首要利用的是不同的细胞培养方法。然而，基于病原体特异性核酸检测的分子生物学方法近来也变得更为重要。这些方法除了高特异性外，胜于常规方法的基本优点必须提及的是其所需的时间极少。然而迄今为止，与微生物培养相比较，直接来自体液或来自未经预处理的试验材料的原核DNA的检测灵敏度太低。如果存在的话，16S-mRNA分子区域可以达到直接足以从未经预处理的试验材料中检测病原体的细菌核酸量。然而，这就需要待检测细菌处于代谢阶段并且表达足量的16S-mRNA。
然而通常并不是这样的情形，尤其是经受抗生素治疗的患者。此外，细菌的某些致病性因子并不是每时都表达，虽然相应的基因存在于细菌基因组中。因而，染色体水平检测致病性因子和细菌耐受性对于脓毒性病状的诊断是必需的。
还可应用的范围更广，因为在此水平上，可以进行致病性和共生细菌之间的区分。
最常见地，通过聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)进行原核DNA的扩增，可实现病原体特异性核酸的检测。由对干扰的敏感性或通过临床样品的强抑制因子，可对照出结果的高特异性和快速可得性。
在常规PCR检测方法中，血液中病原体的的成功检测需要从至少1-5ml血液中分离出总DNA。然而，因总DNA浓度太高而不能直接用于PCR反应。
对于用于脓毒性病原体检测的血液培养物，情况则有所不同。在此情况下，较低的检测极限是每毫升低于10个细菌。目前这种检测极限只能通过PCR方法达到，所述PCR的靶序列位于16S-RNA区域中，因而依赖于所述靶序列的表达。对于靶序列位于微生物染色体内的PCR方法，预计可有更高的诊断可靠性。不同基因的表达行为可受到相当的改变或限制，尤其是在进行中的抗生素治疗的影响下，即使所使用的抗生素最终并无影响。这种情况通常特别地发现于加强治疗病房中，其中大部分病人接受抗生素治疗，鉴于此因因而从血液培养物或其他样品不能生长出任何的相关细菌。
由于灵敏度不够，只在试验材料中具有足够高的细菌数量时不采用扩增步骤而通过原核DNA的直接检测的病原体特异性核酸的检测(探针技术、FISH技术)才具有诊断意义。
用于鉴定体液中细菌病原体的原核DNA检测的基本问题，除试验材料中PCR-抑制成分外，主要在于真核DNA超过原核DNA。在这一点上，DNA分析中的竞争性过程以及原核DNA的低含量可认为是对病原体的定性和定量检测的妨碍。
DNA分离的常用方法可富集体液的总DNA，使得宿主DNA与微生物DNA的比例处于1∶10-6到1∶10-8之间。这一差别使得检测体液中微生物DNA的困难相当清晰。
因而，本发明的一个目的是提供一种从来自于感染患者的带有高含量真核DNA的试验样品中分离和/或富集微生物DNA的方法，用于病原体的快速和简易检测，所述检测能够早期诊断出由细菌病原体引起的感染。
根据本发明，该目的通过富集原核DNA的方法实现，所述方法包含如下步骤a)将溶液中的至少一种原核DNA与能够特异性结合原核DNA的至少一种蛋白质或多肽接触，由此形成蛋白质或多肽DNA复合物，以及b)分离所述复合物。
在此情况下，术语原核DNA同时涉及病毒和细菌DNA。所述DNA可被纯化并再次溶解，或可直接存在于初始来源(例如体液，如血液、血清等)中。
通过本领域人员熟知的分离或富集DNA蛋白复合物或DNA多肽复合物的不同方法手段，可实现分离。在这种情况下，优选采用将DNA结合蛋白固定于载体基质上的方法，从而从样品溶液中富集DNA。
根据优选实施方案，分离之后进行分离DNA和蛋白质/多肽的步骤。这可通过诸如本领域人员已知的常规DNA纯化的常规方法而实现。在最简单情况下，分离是基于基质/缓冲液的pH值或盐浓度的改变，或者基于离液试剂的加入，等等；即导致蛋白质-DNA复合物分离的合适参数。此类方法为本领域人员所已知。
根据进一步优选实施方案，蛋白质或多肽被偶联至载体上。该实施方案代表了富集原核DNA的一个尤其简单的方式，因为从溶液中分离是特别简单的，例如从溶液中物理去除带电载体(例如通过离心作用)。
作为原核DNA的溶液，任何合适的溶剂都基本上是合适的。然而，该方法对于从含有不同生物分子种类，尤其是不同DNA种类的溶液中富集原核DNA是特别有用的。本发明优选地涉及一种从原核或病毒DNA的混合物中分离和富集原核或病毒DNA和真核DNA的方法。在这种情况下，例如存在于体液中的原核DNA通过特异性结合至蛋白质或多肽而与真核DNA分离，并被富集。在分子生物学方法的帮助下，以此方式富集的原核DNA促进了原核病原体的检测，并且可有助于由致病病原体引起的疾病的诊断。
尤其是，DNA结合蛋白或多肽固定于载体表面的实施方案适合于来自于体液，优选为血液的原核DNA的吸附。此外，该方法可以使存在于血液或其他体液中的微生物DNA从所述体液中除去。然后以此方式从中纯化微生物DNA的体液(例如全血，血清或液剂)可输回体内，所述微生物DNA自身也能引起患者体内严重的炎症反应。
本发明意义上的体液可理解为源自包括人体的哺乳动物肌体的所有液体，其中可存在疾病病原体，诸如血液，脲，液剂，胸膜，心包，腹膜以及滑膜液体。涉及人体血液的本发明描述不应解释为对发明的限制，而仅仅是作为示例性应用。
本发明意义上的蛋白质或多肽可理解为能够特异性结合原核DNA的所有真核和原核蛋白质。能够特异性结合非甲基化CpG-基元的蛋白质或多肽尤其适合于该目的。
细菌病原体优选地理解为脓毒病病原体，但也可以是感染的任何其他细菌病原体。它们可不同于共生病原体，所述共生病原体有时候也发现于来自患者的试验样品中，但不会有任何的致病意义。
在从感染体液分离总DNA中，宿主DNA与病原体DNA的比率在很多情况下可以是1∶10-6至1∶10-8或更低。通过原核DNA对带有此类选择性属性的蛋白质或多肽的特异性结合，本发明的方法可实现3个指数单位或更多的富集。
蛋白质或多肽可直接或间接偶联至载体。偶联的类型依赖于载体和载体材料。合适的载体尤其包括膜、微粒和树脂，或者用于亲和基质的类似材料。用于蛋白质或多肽结合以及用于实施此类结合(依赖于材料类型)的合适材料，是本领域人员所熟知的。对于间接偶联而言，例如针对蛋白质或者多肽的这种特异性抗体是合适的，所述抗体通过已知方法依次结合至载体。
本发明方法的一个应用包括原核DNA的富集。进一步应用包括，通过将原核DNA结合至已固定至基质的特异性蛋白或多肽，从而从真核和原核DNA的混合物中分离出原核DNA。通过合适的方法手段，将肌体自身DNA和原核DNA的混合物与亲和基质接触，在这种情况下原核DNA结合至固定的蛋白质；原核DNA穿过例如分离柱，可被单独收集。亲和基质可以是，例如聚多糖，如琼脂糖，其他生物聚合物，合成聚合物，或带有硅酸盐主链的载体，如多孔玻璃或其他固态或柔性载体，其上固定有DNA结合蛋白或多肽。原核DNA与真核DNA的分离后，用合适的试剂洗涤亲和基质，从而使带有偶联的原核DNA的结合蛋白与基质分离出来，和/或将原核DNA与结合蛋白分离，并可以充分量进行进一步的加工步骤。
本发明方法的进一步应用包括通过将原核DNA结合至固定于微粒上的特异性蛋白质，从而使原核DNA与真核DNA分离并进行富集。在这点上，可使DNA结合蛋白或多肽被固定的所有微粒均合适。此类微粒可包括胶乳、塑料(例如，苯乙烯泡沫、聚合物)、金属或铁磁性物质。此外，也可利用荧光微粒，诸如可购自Luminex Company的产品。原核DNA结合至固定于微粒上的蛋白质之后，通过合适方法将所述微粒从物质混合物分离出，所述方法例如为过滤、离心、沉淀、通过检测荧光强度的分类、或者通过磁性方法。原核DNA从微粒分离后，即可用于进一步处理。
本发明方法的另一应用包括通过将原核DNA结合至特异性蛋白或多肽，将原核DNA与真核DNA分离并富集，然后通过电泳与混合物的其他成分分离。
本发明方法的另一应用包括通过将原核DNA结合至蛋白质或多肽将原核DNA与真核DNA分离并富集。所述蛋白质随后结合至相应的抗体。该抗体可结合至固体或柔性基质，诸如玻璃、塑料、硅、微粒、膜，或可存在于溶液中。原核DNA结合至蛋白质或多肽，且后者结合至特异性抗体后，通过本领域人员已知方法可实现从物质混合物的分离。
作为蛋白质或多肽，任何例如结合带有非甲基化CpG基元的原核DNA的蛋白质或多肽均尤其适合。为此目的，例如针对原核DNA的特异性抗体或抗血清均是适合的。其制备和分离均为本领域人员已知的。
例如因为非甲基化CpG基元的存在，原核DNA不同于真核DNA。由此，蛋白质/多肽可以方便地特异性识别并结合非甲基化CpG基元。方便起见，这也包括特异性抗体或对应的抗血清。根据进一步优选实施方案，该蛋白质或多肽是由TLR9基因或CGBP基因编码的蛋白质或多肽。
本发明的此实施方案是基于如下发现原核DNA和真核DNA的区别在于CpG基元的含量不同。在原核DNA中，胞嘧啶-鸟苷-二核苷酸(CpG基元)存在量超过真核DNA的20倍。在原核DNA中，这些基元是非甲基化的，而在真核DNA中则大部分是甲基化的，这就进一步增加了其差异。非甲基化CpG基元是原核基因组或其片段内的非甲基化脱氧胞苷酸-脱氧鸟苷酸-二核苷酸。
其次，本发明的该优选实施方案是基于如下发现存在有特异性结合至DNA的非甲基化CpG基元的蛋白质或多肽。根据本发明，一方面利用这些蛋白质/多肽的结合属性用以从主要含真核DNA的样品中结合原核DNA，另一方面使原核DNA富集。
利用真核DNA中存在甲基化CpG基元而分离cDNA的一个应用描述于Cross等的，Nature Genetics6(1994)236-244中。带有相应CpG基元的单链寡脱氧核糖核苷酸(ODN)的免疫刺激应用已出现数次(Hcker等，Immunology 105(2002)245-251，US 6,239,116)。作为原核CpG基元的识别分子，目前已鉴定出两个受体蛋白。Toll样受体9已知在WO02/06482中作为一种识别非甲基化CpG基元的分子。Voo等人的，Molecular and Cellular Biology(2000)2108-2121描述了其它受体蛋白，即人CpG结合蛋白(hCGBP)，所述蛋白用于分析方法中，作为识别分子用于检测原核DNA中的非甲基化基元。在上述两个出版物中，CpG结合蛋白均没有用于分离或富集原核DNA。
由序列与基因文库登录号NM-014593(Version NM-014593 1，GI7656794；NCBI数据库)的序列具有至少80％，优选至少90％，尤其是优选至少95％同源性的cDNA编码的蛋白质或多肽为特别适合。这些是与CGBP对应或者由其衍生，并特异性识别并结合CpG基元的蛋白质或多肽。
根据进一步优选的实施方案，所述蛋白质或多肽由序列与基因文库登录号AB 045180(TLR9的编码序列；NCBI数据库，versionAB045180.1；GI11761320)或其片段的序列具有至少80％，优选至少90％同源性的cDNA编码，优选为与转录变体A(基因文库访问号.NM-138688；version NM-017442.1；GI20302169；NCBI数据库)或转录变体B(基因文库访问号.NM-017442；version NM-138688.1；GI20302170；NCBI数据库)具有至少80％，尤其优选90％同源性的cDNA。
此外，本发明涉及一种纯化体液用以除去原核DNA的方法。在这点上，便利地是在无菌条件下于体外实现分离，从而可使体液再次输回体内，从而通过除去所述体液中含有的原核DNA，可辅助躯体的自身免疫系统消除感染。
任何合适的化学、机械或电化学过程均可考虑用于从体液中体外去除原核DNA。此外，与诸如血液灌流、心肺机或内毒素吸收器的其他体外治疗方法的结合，代表了进一步的便利应用。这种列举并不代表对本发明的限制。
根据特别优选的实施方案，本发明涉及一种检测原核DNA的方法。在此情况下，原核DNA富集之后是扩增所述原核DNA的步骤，用于该目的的所有通用扩增方法均适合(PCR，LCR；LM-PCR等)。
此外，本发明涉及一种通过上述方法之一富集原核DNA的试剂盒，所述试剂盒至少含有蛋白质/多肽，优选含有适合实施所述方法的其他试剂。
根据优选实施方案，所述试剂盒除含蛋白质/多肽外，还含有至少一组引物，所述引物适合于在标准条件下扩增某些原核生物的基因组DNA。
本发明具有的优点为，通过将富含CpG基元的非甲基化原核DNA特异性结合至对该结构具有特异性亲和性的蛋白质，源自感染宿主总DNA的原核DNA成功地得以浓缩，由此，体液中病原体DNA的检测灵敏度大大增强。
采用特异性结合蛋白将原核DNA与真核DNA分离的可能性，较之分离总DNA的已知方法不再耗时。然而，随后的检测只能经由PCR反应实现。在大多数情况下不需要嵌套PCR，从而使得诊断中可节省相当量的时间。
下面通过实施例对本发明进行更详细的解释，但并没有限制其范围。
图1显示了人血液中链球菌DNA的PCR结果，以及图2显示了根据图1的PCR产物进行的嵌套PCR结果。
实施例1检测的现有技术方法将含有103/ml集落形成单位的病原体的化脓性链球菌的新鲜肝素化人体血液用于病原体的检测。采用用于从体液分离总DNA的市售试剂盒，根据厂商的修正说明书，使DNA通过吸附至DNA结合基质而得到分离。为此目的，将含有蛋白酶K和SDS的200μl总溶菌缓冲液，加入至Eppendorf管中的100μl感染血液中。混合物在37℃下培育30分钟，然后加热至95℃并持续20分钟。冷却后，加入20μg的mutanolysine，并在37℃下另培育60分钟。离心后，将上清液上样到采用DNA结合基质的离心柱，并根据厂商说明书纯化DNA。将纯化出的DNA置于终体积为100μl的0.01mol、pH7.5的tris缓冲液中，或置于等量的来自于厂商的洗脱缓冲液。为了检测病原体，选择引物用以鉴定链球菌溶血素O基因(slo)。
1.PCR465bp片段的扩增正向引物15’-AGCATACAAGCAAATTTTTTACACCG反向引物25’-GTTCTGTTATTGACACCCGCAATT引物浓度1mg/ml起始材料5μl分离的DNA
0.5μl正向引物10.5μl反向引物214μl无菌水总量25μl，于即用(Ready to go)试剂盒(Amersham-Biosciences)反应1× 5min 95℃40个循环，各循环条件 30sec.95℃30sec.51℃3min 72℃1× 7min 72℃人体血液中链球菌DNA的PCR结果示于图1中。分离25μl起始材料中的10μl。1)含5μl模板DNA的PCR起始材料；2)含5μl模板的起始材料，以1∶10稀释。3)阳性对照0.2μl链球菌DNA作为模板，不含来自血液的真核DNA。ST)分子量标准物。
结果初级PCR并没有得到可见的PCR产物。因而，按如下实施2.PCR(嵌套PCR)。
2.PCR(嵌套)含于上面slo片段中的一个348bp片段的扩增。
正向引物35’-CCTTCCTAATAATCCTGCGGATGT-3’反向引物45’-CTGAAGGTAGCATTAGTCTTTGATAACG-3’引物浓度1mg/ml起始材料5μl来自于图1中PCR1的样品10.5μl正向引物10.5μl反向引物214μl蒸馏水总量25μl，于即用(Ready to go)试剂盒中(Amersham-Biosciences)反应
1×5min 95℃50个循环，各循环条件 30sec.95℃30sec.54℃3min 72℃1× 7min 72℃图2所示为以根据图1的PCR产物作为模板进行的嵌套PCR。样品对应于图1中的样品。
结果在嵌套PCR中，所期望的slo-DNA片段以每100μl血液病原体数为100个链球菌细胞进行扩增(样品1)。对于第一次PCR(图1)中的5μl模板DNA，这对应于约5至10个模板分子。以1∶10进行稀释时(样品2)，此时灵敏度已耗尽(0.5至1个模板分子)。
实施例2实施根据本发明的方法将来自细胞溶解产物的DNA，如上所述用于前面PCR方法进行溶解。不同之处在于采用1ml至5ml之间的试验材料。
将含有102/ml集落形成单位的化脓性链球菌作为病原体的3ml新鲜、肝素化或加有柠檬酸盐的人体血液用于病原体的检测。采用用以从体液中分离总DNA的市售试剂盒，根据厂商的修正指导书，通过含有SDS和蛋白酶K的溶菌缓冲液而使DNA得以分离。为此目的，将含有蛋白酶K和SDS的6ml的总溶菌缓冲液，加入至6ml的感染血液中。将混合物在37℃下培育30min。然后加热至95℃并持续20min。冷却后，加入200μg的mutanolysine，并在37℃下另培育60分钟。离心后，将混合物用乙醇沉淀至终浓度为70％，并在离心后以2ml的70％乙醇对沉积物进行洗涤。在真空离心机中除去乙醇残留物，将沉淀的DNA收集于500μl的TE缓冲液中。然后将DNA应用至含有0.5ml琼脂糖的柱子上，DNA被固定于1mg的TLR9上。以5个体积的TE缓冲液洗涤柱子。以高浓度的离液离子实施洗脱，如0.7ml的6mole NaJ或KSCN溶液。该洗脱液可直接应用于市售的DNA分离离心柱，如初始实施例一样，根据说明书即可分离出20-100μl之间的小体积的富含CpG的DNA，并用作进一步分析，如病原体PCR。
权利要求
1.一种富集原核DNA的方法，所述方法包含如下步骤a)将溶液中的至少一种原核DNA与至少一种能特异性结合原核DNA的蛋白质或多肽接触，由此形成蛋白质或多肽DNA复合物，以及b)分离所述复合物。
2.权利要求1所述的方法，其中分离之后的步骤为将DNA和蛋白质分离。
3.上述权利要求任一项所述的方法，其中的蛋白质或多肽偶联至载体。
4.权利要求3所述的方法，其中的蛋白质或多肽直接偶联至所述载体。
5.权利要求3所述的方法，其中的蛋白质或多肽经针对该蛋白或多肽的抗体而偶联至载体上。
6.权利要求3至5任一项所述的方法，其中所提供的载体为基质，微粒或薄膜。
7.权利要求1或2任一项所述的方法，其中通过针对蛋白质或多肽的抗体或抗血清实现分离。
8.权利要求1所述的方法，其中通过电泳实现分离。
9.前述权利要求任一项所述的方法，其中的蛋白质或多肽是针对非甲基化CpG基元的抗体，或者是相应的抗血清。
10.权利要求1至8任一项所述的方法，其中的蛋白质或多肽由TLR9基因或CGBP基因编码。
11.权利要求10所述的方法，其中的蛋白质或多肽的编码cDNA序列与基因文库登录号XM-165661的序列具有至少80％，优选至少90％同源性。
12.权利要求10所述的方法，其中的蛋白质或多肽的编码cDNA序列与基因文库登录号AB 045180或其片段的的序列具有至少80％，优选至少90％同源性，优选与转录变体A(基因文库登录号NM-138688)或转录变体B(基因文库登录号NM-017442)具有至少80％，尤其优选至少90％同源性。
13.权利要求1所述的方法，其中的溶液含有真核与原核DNA的混合物。
14.权利要求13所述的方法，其中的溶液是体液。
15.权利要求14所述的从体液纯化原核DNA的方法，其中于体外无菌条件下实现分离。
16.权利要求1至14任一项所述的检测原核DNA的方法，其中紧接着原核DNA的扩增步骤。
17.通过权利要求1至14任一项所述的方法富集原核DNA的试剂盒。
18.通过权利要求16项所述的方法检测原核DNA的测试试剂盒，包含一组或多组特异性引物。
全文摘要
本发明描述了一种富集原核DNA的方法，所述方法包括如下步骤将至少一种原核DNA与至少一种能特异性结合非甲基化CpG基元的蛋白质或多肽接触，以及分离蛋白质/多肽－DNA复合物。此外，本申请涉及一种用于实施所述方法的试剂盒。
文档编号C12N15/10GK1681925SQ03822233
公开日2005年10月12日 申请日期2003年8月8日 优先权日2002年9月18日
发明者卡尔－赫尔曼·施米特, 埃伯哈德·斯特劳贝, 斯特凡·鲁斯武尔姆 申请人:斯尔思实验室有限公司