可以包括存在于DNA病毒、RNA病毒或逆 转录病毒中的序列。癌症特异性核酸的一些非限制性实例可以包括源于致癌病毒包括但不 限于人类乳头状瘤病毒、Epstein-Barr病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、人类嗜T淋巴细胞病毒、 Merkel细胞多瘤病毒和卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒的序列。癌症特异性靶核酸的实例可以 包括突变致癌基因例如突变的ras、HRAS、KRAS、NRAS、BRAF、EGFR、FLT1、FLT4、KDR、PDGFRA、 PDGFRB、ABL1、PDGFB、MYC、CCND1、CDK2、CDK4 或SRC基因；突变肿瘤抑制基因，例如TP53、 TP63、TP73、MDM1、MDM2、ATM、RBI、RBL1、RBL2、PTEN、APC、DCC、WT1、IRF1、CDK2AP1、CDKN1A、 ⑶KN1B、⑶KN2A、TR頂3、BRCA1或BRCA2基因；以及表达于癌细胞中的基因，其中所述基因可 以不突变或遗传改变，而是在施用时不表达于样本的健康细胞中，例如癌胚抗原。
[0068] 在一些实施方案中，存在于靶隔室中的靶核酸的量或浓度可以不同于非靶隔室。 实例可以包括但不限于在癌细胞中的表达水平与在健康细胞中不同的基因，例如myc、端粒 酶、HER2或细胞周期素依赖性激酶。在一个实施方案中，靶核酸序列可以是在靶隔室中和非 靶隔室中的表达相差至少1. 5倍的基因。这些基因的一些实例可以包括但不限于与介导I 型过敏反应有关的基因，其中靶RNA分子含有免疫球蛋白ε重链序列；在T细胞亚群中表 达的基因，例如在特定主要组织相容性（MHC)蛋白质如胰岛素原衍生肽的背景下识别自身 抗原的特异性Τ细胞受体（TCR)及衍生自致糖尿病性CD8+T细胞的含有α或β可变区序 列的克隆特异性mRNA;以及生成可以通过加重炎症反应产生不良结果的细胞因子，包括但 不限于TNF-aJNF-β、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、 IL-21、IL-22、IL-27、IL-31、IFN-γ、0SM和LIF。
[0069] 在一些实施方案中，靶核酸存在于靶隔室和非靶隔室的可接受子组中，而不存在 于非靶隔室的不同或有区别子组中。一些非限制性实例可以包括在癌细胞中表达且限于 健康细胞种类的基因，例如癌症-睾丸抗原、存活素、前列腺特异性抗原、癌胚抗原（CEA)、 胎蛋白和其它致癌胎蛋白。另外，许多组织和器官对面临严重疾病的原本健康的生命而 言不是必要的。例如，黑素细胞抗原如Melan-A/MART-Ι和gplOO在许多恶性黑色素瘤以及 正常黑素细胞上表达，且靶向这些抗原的疗法可以摧毁肿瘤和正常黑素细胞二者，从而除 了大量的肿瘤减少之外产生白癜风。同样地，生殖器官可以通过手术切除，例如睾丸、卵巢 和子宫，而且当相关器官例如乳房和前列腺出现肿瘤时，可以靶定这些组织，且摧毁这些器 官内的正常组织可以是可容忍的治疗后果。此外，产生激素例如甲状腺素和胰岛素的一些 细胞可以被相关蛋白质代替，以允许潜在地靶定可以在这些起源的肿瘤的存在下存在的正 常细胞。
[0070]靶核酸还可以包括先前未被识别的新型序列。在一个实施方案中，可以通过序列 分析例如新一代测序、全转录组（RNA-seq)或全基因组测序、微阵列分析、基因表达的系列 分析（SAGE)评价一个或多个样本，以测定该样本的遗传组成。靶核酸序列可以被识别为存 在于靶隔室中而不存在于非靶隔室中的序列，或相较于非靶隔室以不同的量或浓度存在于 靶隔室中的序列。通过该方法识别的序列然后可以用作靶核酸。
[0071]确定效应物结构
[0072]效应物结构是在样本中驱动所需作用的触发器。所需效应物活性的一些实例可以 包括但不限于诱导免疫反应、程序性细胞死亡、凋亡、非特异性或程序性坏死、裂解、生长抑 制、病毒感染的抑制、病毒复制的抑制、致癌基因表达的抑制、基因表达修饰、微生物感染的 抑制和微生物复制的抑制以及这些生物活性的组合。在另一个实施方案中，效应物结构可 以作为抗体的配体来诱导在病原细胞位置处的免疫反应，或使抗体导向治疗例如具有治疗 有效负载的抗体集中于病原细胞的位置。在另一个实施方案中，效应物结构可以调节靶基 因的表达。在另一个实施方案中，效应物结构可以调节酶活性、基因/蛋白质表达、分子信 号传导和分子相互作用。
[0073]效应物结构是模板化装配反应物的组合或模板化装配反应物的部分的组合的产 物，其在样本中产生所需活性。活性效应物结构可以拥有靶向活性或与效应物局部部分中 的任一者或二者个别地相比具有高水平的活性。在一个实施方案中，与效应物局部部分中 的任一者或二者个别地相比，活性效应物结构可以拥有新的活性或实质上不同于个别部分 的活性。
[0074] 可以通过核酸模板化装配产生效应物结构的不同排列。任何活性产物都可以作为 效应物结构，只要该结构可以通过相对无活性前体的模板化装配而产生即可，所述无活性 前体可以通过相应的选择性反应性基团的反应而组合。因此，可以通过形成酰胺键、三唑键 接、氧化膦键接或本文所描述的其它生物正交连接产物从分离部分重建的任何化合物都可 以作为活性效应物结构。另外，此类化合物可以在实际上任何可获取的核酸模板上装配，从 而允许在一组非常多样化的样本中进行装配。
[0075]效应物结构的一般形式包括但不限于：
[0076]
[0077] 由非无痕迹生物正交反应形成的酰胺键接效应物结构。
[0078]
[0079] 由叠氮化物-炔烃生物正交反应生成的三唑键接效应物结构。
[0080]
[0081] 由非无痕迹的施陶丁格连接（Staudingerligation)生物正交反应生成的氧化膦 键接效应物结构。
[0082] 活性效应物结构还可以包括蛋白质、含标准或非标准氨基酸的肽、拟肽结构和允 许或需要效应物结构的相互作用或掺入的药物或其它生物活性化合物。
[0083] 在一些实施方案中，效应物结构可以通过使效应物结构连接至模板化装配产物的 其余部分的键的裂解而从该产物中的其它部分释放。裂解可以通过连接键的水解或通过由 样本的内源性蛋白质或其它化合物进行的酶促裂解而实现。这些可裂解键的非限制性实例 包括酯、硫酯、亚胺、腙、细胞蛋白酶的酶切基序或细胞酶的底物。可裂解基团可以通过在合 成期间将其并入模板化装配反应物部分、连接子或附属基团中来引入，或可以在连接反应 期间产生。在一个实施方案中，效应物结构可能需要效应物结构的连接后裂解或其它原位 化学修饰以触发所需活性。
[0084] 效应物结构还可以通过在靶隔室内（例如，在细胞内）起作用、在靶隔室的表面 (例如，在细胞表面）起作用、在靶隔室附近起作用（例如，当效应物结构从细胞主动输出、 从细胞中泄漏或在细胞死亡后释放）触发活性，或扩散至或被携载至样本的远部区域以触 发反应。在一些实施方案中，效应物结构可以通过合并模板化装配产物中的靶向基团靶定 至其活性位点。靶向基团的一些非限制性实例可以包括内质网传输信号、高尔基体传输信 号、核传输信号、线粒体传输信号、泛素化基序、其它蛋白酶体靶向基序或糖基磷脂酰肌醇 锚定基序。靶向基团可以通过在合成期间将其并入模板化装配反应物部分、化学连接子或 附属基团中来引入，或可以在连接反应期间产生。
[0085] 在一些实施方案中，效应物结构可以存在于靶隔室的表面上。在另一个实施方案 中，效应物结构可以作为结合至主要组织相容性复合体分子的配体存在于细胞的表面上。 [0086] 在一些实施方案中，效应物可以是内源性肽等和其类似物，或完全合成的结构，其 为效应物结构触发剂例如抗体的标靶。靶核酸的可用性可以限制活性效应物的产生，因此 可以期望具有当以低水平存在时发挥活性的效应物结构。
[0087] 效应物结构还可以通过在一组非常多样化的样本中的可获取的核酸转录物上进 行模板化而产生，且效应物结构的组合可以在相同的转录物上产生，或在可以同时存在于 样本例如细胞内的不同转录物上产生。因此，可以在相同样本内的不同模板上装配单一效 应物结构，或可以在相同的模板上或相同样本内的若干个模板上装配若干个效应物结构， 从而产生特定效应物分子的更多个拷贝以及效应物分子在样本内的可用模板上的更多样 化排列。
[0088] 作为靶核酸定位用化学标记物的效应物结构
[0089] 在一些实施方案中，可以利用效应物结构特异性抗体使用抗体检测方法来指示靶 隔室在样本内的位置。在这些实施方案中，可以施用相应的模板化装配反应物以及报道抗 体。效应物结构在靶隔室中产生，导致报道抗体在靶隔室中结合并累积。然后可以通过抗 体的报道功能确定靶隔室的位置。图5说明靶隔室定位的这种一般方案。可以被定位的靶 隔室包括但不限于癌细胞、肿瘤、感染病毒或其它感染原的细胞或表达不在样本的所有细 胞中表达的受关注的特定核酸序列的任何细胞或细胞群。图6和图7说明用于选择性消除 肿瘤细胞的治疗用途的一般方案，治疗前（图6)和治疗期间的杂交（图7)。
[0090] 在活细胞中产生所需活性的效应物结构
[0091] 可以通过产生效应物结构调节特定细胞群体，所述效应物结构最终导致指定细胞 靶隔室的摧毁或改变。可以设计由效应物结构产生的活性以消除非所需的细胞靶隔室。图 8说明了效应物结构采用不同的机制来诱导凋亡，例如细胞毒性T淋巴细胞、治疗性抗体、 细胞内受体和直接细胞相互作用。
[0092] 细胞毒性和促凋亡效应物结构
[0093] 在一些实施方案中，靶细胞的杀死或生长抑制可以通过与细胞毒性、杀微生物性 或杀病毒性效应物结构的直接相互作用来诱导。可以产生本领域中已知的许多毒性分子。 在一个实施方案中，无痕迹生物正交反应化学可以产生毒性肽。毒性肽的一些实例可以包 括但不限于蜜蜂蜂毒肽、芋螺毒素、cathelicidin、防御素、protegrin和NK细胞溶解素。
[0094] 在一些实施方案中，靶细胞的杀死或生长抑制可以由促凋亡效应物结构来诱导。 例如，使用无痕迹生物正交化学产生的效应肽可以包括促凋亡肽，其包括但不限于朊病毒 蛋白片段106_126(PrP106-126)、与半胱天冬酶级联有关的Bax衍生型最小前肽（包括 Bax106-134)和促凋亡肽（KLAKLAK) 2。
[0095] 血栓源性效应物结构
[0096] 在一些实施方案中，所产生的效应物分子可以为血栓源性，其诱导蛋白质凝血级 联的各种组分的活化或蛋白质的活化或血小板的活化和/或聚集或可以导致生物活性过 程的内部损伤，在该生物活性过程中，含有病原细胞的区域可以选择性形成血栓，从而限制 向肿瘤或其它病原细胞的供血。这些类型的效应物还可以诱导凝血或防止凝血或防止血小 板活化和聚集于靶病原细胞的内部和周围。
[0097] 免疫激活效应物结构
[0098] 在一些实施方案中，效应物结构可以通过激活与免疫系统有关的分子、路径或细 胞来介导靶细胞或病毒的杀死或生长抑制。效应物结构可以占用先天免疫系统、适应性免 疫系统和/或二者。
[0099] 激活先天免疫系统的效应物结构
[0100] 在一些实施方案中，效应物结构可以通过刺激先天免疫系统来介导细胞或病毒的 杀死或生长抑制。在一个实施方案中，效应物结构可以包括病原体相关分子模式（PAMP)、损 伤相关分子模式（DAMP)和其合成类似物。
[0101] 在一些实施方案中，先天免疫系统可以被激活补体系统的效应物结构占用。补体 激活效应物结构的一个非限制性实例可以是补体蛋白C3的C3a片段。
[0102] 在一些实施方案中，效应物结构可以是甲酰化肽受体激动剂。在一个实施方案中， 可以利用无痕迹生物正交化学产生甲酰化三肽甲酰基-Met-Leu-Phe。用于使用无痕迹模板 化装配反应物产生fMLF肽的一个具体示例性方案可以包括：
[0103]
[0104] 在一些实施方案中，可以产生甲酰化肽受体的小肽激动剂例如肽 Trp-Lys-Tyr-Met-Val-(D-Met)〇
[0105] 在一些实施方案中，可以产生具有铎样受体（TLR)的天然或合成配体的效应物结 构。在一个非限制性实例中，效应物结构可以包括已知为TLR激动剂的热激蛋白（hsp)的 肽片段。
[0106] 在一些实施方案中，可以使用无痕迹生物正交化学产生N0D2受体的胞壁酰二肽 激动剂以激活炎症反应。
[0107]激活适应性免疫系统的效应物结构
[0108]在一些实施方案中，效应物结构可以通过激活适应性免疫系统的分子或细胞来介 导细胞或病毒的杀死或生长抑制。适应性免疫系统的独特性在于，可以使分子或细胞工程 化以识别各种结构，从而消除了效应物结构必须具有内在活性或结合至内源性蛋白质的限 制。
[0109]由于系统的模块性，适应性免疫系统的单一工程化分子或细胞可以用于任何靶隔 室或靶核酸的治疗，因为相同的效应物结构可以在任何靶核酸的存在下产生。这相比于当 前技术水平是一个优点，在当前技术水平下，新的分子或细胞必须被工程化来治疗任何新 的标革E，这涉及到大量的时间、困难和成本。
[0110] 在一些实施方案中，效应物结构可以是抗体或抗体片段（包括但不限于Fab、Fv和scFv)的配体。可以利用无痕迹生物正交方法来产生被现有抗体结合的肽或其它表位，或者 可以开发识别由任何选择性反应性方法或生物正交方法所形成的效应物结构的抗体。
[0111] 对于结合模板化装配反应物的治疗干预，制造的抗体可以作为效应物结构触发剂 来施用。如本文所使用，术语"效应物结构触发剂"是指在结合至效应物结构后能够引发所 需活性的外生化合物或细胞。该试剂可以在施用模板化装配反应物之前、期间或之后被施 用至样本中。一个实例可以包括但不限于报道抗体。在一个实施方案中，未修饰抗体可以 用于介导治疗作用。在另一个实施方案中，可以制造具有被设计成增强治疗作用的附加有 效负载的效应物结构特异性抗体。治疗性抗体有效负载的一些非限制性实例可以包括细胞 毒素、放射性同位素、与放射治疗联用的放射敏化剂、用于将共施用前药转化成活性药物的 酶或任何其它抗体导向治疗。
[0112] 在一些实施方案中，抗体可以用于效应物结构的体内检测，从而将受试者内的靶 隔室定位。
[0113] 在一些实施方案中，效应物结构可以激活T细胞。可以通过结合至T细胞受体 (TCR)的效应物结构实现T细胞的激活。在一个实施方案中，效应物结构可以呈现在靶细胞 的表面上并结合至主要组织相容性复合体分子（MHC)，以促进T细胞受体的结合。效应物结 构可以被MHCI类或MHCII类分子结合。在一个示例性实施方案中，效应物结构被MHCI 类分子结合。结合至TCR的结构可以是常规肽抗原或"超抗原"，该超抗原与表达特定可变 (V)区域的广泛T细胞亚群结合。与被选择来与特定抗原相互作用的TCR不同，超抗原可以 激活具有能够结合至不同的抗原-MHC复合体的受体的大量T细胞群体，并诱导强烈的炎症 反应以引发炎症介质的级联。因此，可以产生超抗原或超抗原模拟物作为活性效应物结构， 其可以募集大量T细胞至病原细胞并导致破坏或限制此类细胞的生长。
[0114] 结合至MHCI类分子的天然配体通常是长度为8至10个氨基酸的肽，然而其它长 度是可允许的。结合至MHCII类分子的天然配体通常是长度为15至24个氨基酸的肽，然 而其它长度是可允许的。可以利用无痕迹生物正交化学生成效应物结构。可以使用是已知 MHC配体的肽作为效应物结构，或可以产生新型肽。用于评价肽与MHC分子的结合的测定是 本领域中已知的，并且可以用于评价用于MHC结合的候选效应物结构。
[0115] 还知道MHC分子结合非肽结构和拟肽物。可以利用非无痕迹生物正交模板化装 配方法来形成用于激活T细胞受体的拟肽MHC结合抗原。在一个实施方案中，拟肽可以是 6至40个氨基酸或非标准氨基酸的肽，其中1至4个残基被非无痕迹生物正交连接结构替 代，例如：
[0116] - [生物正交连接结构]-R2n
[0117] 其中R1和R2是共价结合的标准或非标准氨基酸，m= 0至40，n= 0至40,且m+n =2至39。在一些实施方案中，m+n= 3至11，产生适于结合至MHCI类的结构。
[0118] 使用MART-1免疫显性肿瘤相关抗原作为设计骨架的效应物结构的一些实例可以 包括：
[0119]
[0120] 基于施陶丁格连接化学的示例性拟肽效应物结构。
[0121]
[0122] 基于叠氮化物-炔烃连接化学的拟肽效应物结构的实例。
[0123]
[0124] 基于叠氮化物-环辛基炔烃连接化学的拟肽效应物结构的实例。
[0125] 拟肽效应物结构可以基于已知结合MHC并激活T细胞受体的天然配体来设计（与 在上文的实例中一样）。或者，拟肽效应物结构可以是全新的结构，且可以开发新的T细胞 克隆物或抗体-TCR嵌合体（T-body)以用作效应物结构触发剂。这种方法提供使用非自 身、非交叉反应性效应物结构的益处，该结构可以增加活性，同时减少治疗期间的非所需副 作用。
[0126] 在一些实施方案中，天然肽或拟肽MHC结合效应物结构可以连同收养T细胞治疗 一起使用，其中收养T细胞作为效应物结构触发剂。收养T细胞治疗向患者提供外源性T 细胞，其可以实现治疗上期望的免疫反应。然而，同种异体的T细胞可能由于宿主排斥或移 植物抗宿主疾病的风险而具有潜在的问题。
[0127] 最近开发的技术已经允许将自体T细胞用于各种治疗应用，在这种情况下避免了 宿主遗传不相容性。可以在体外扩增临床相关的T细胞亚群（包括具有特异性TCR的由克 隆衍生的细胞）并返还至自体患者中。更高的选择性可以通过在体外用允许表达对靶抗原 (例如已知在肿瘤上表达的抗原）具有已知特异性的TCR或具有同等所需特异性的工程化 嵌合抗原受体的载体转染自体T细胞来实现。
[0128] 一旦已经选择活性效应物结构，就可以设计适当的选择性反应性部分和效应物局 部部分以并入模板化装配反应物中。这些部分被设计成当发生模板化装配反应时可以重建 活性效应物部分。
[0129] 确定核酸模板化策略
[0130] 当合适的核酸靶序列被识别且活性效应物产物被确定时，可以产生用于设计一组 相应的模板化装配反应物的策略。选择一组相应的模板化装配反应物以使得：
[0131] a)它们将在由其核酸识别部分的杂交位点所确定的合适的空间接近位置结合靶 核酸模板；且
[0132]b)模板化装配反应物的选择性反应性部分可以以促进由效应物局部部分形成活 性效应物产物的方式相互反应。
[0133] 以下部分描述了每个个别部分的设计和合成，以及用于合成整个模板化装配反应 物的方法。还描述了可以并入模板化装配反应物中的任选的化学连接子或附属基团。
[0134] 核酸识别部分的设计和合成
[0135] 核酸模板化装配反应物包括至少一个核酸识别部分。核酸识别部分是组合物中的 革巴向组分，其识别特定革巴序列并且以序列特异性方式经由Watson-Crick或Hoogsteen碱基 配对相互作用与靶核酸相互作用。核酸识别部分可以结合至靶核酸或可以促进结合至靶核 酸。在一个实施方案中，核酸识别部分直接结合至靶核酸。
[0136] 如本文所使用，短语"核酸识别部分"是指促进与靶核酸的序列特异性结合的化合 物。核酸识别部分的主要功能是使用靶分子作为用于模板化装配的位点。这与许多当前技 术不同，因为其杂交经常被优化来直接阻断或抑制靶分子。
[0137] 在一些实施方案中，核酸识别部分结合至靶核酸。该结合可以通过核酸识别部分 与靶核酸的直接杂交或间接通过结合核酸识别部分和靶核酸二者的中间体例如连接子。短 语"靶核酸序列"和"靶核酸"可以交换使用且是指旨在充当核酸模板化装配的模板的单元 或核酸的序列。
[0138] 核酸识别部分可以包括碱基对形成单元（例如核酸或核酸类似物）的寡聚物。 寡聚物可以由多个单元组成，其中这些单元中的一些或全部是能够形成Watson-Crick或 Hoogsteen碱基配对相互作用的碱基，从而允许序列特异性结合至双螺旋或复合体结构中 的靶核酸。
[0139] 寡聚物序列可以是DNA核苷酸、RNA核苷酸、经硫代磷酸酯修饰的核苷酸、2-0-烷 基化RNA核苷酸、卤代核苷酸、锁核酸核苷酸（LNA)、肽核酸（PNA)、吗啉代核酸类似物 (morpholino)、假尿苷核苷酸、黄噪呤核苷酸、次黄噪呤核苷酸、2-脱氧肌苷核苷酸、能够 形成碱基对的其它核酸类似物或其组合。在一个实施方案中，核酸识别部分包括核酸且与 mRNA标靶杂交。
[0140] 寡聚物还可以合并专用单元、与其相互作用或结合。例如，当在可以降解标准DNA 或RNA的核酸酶的存在下（例如在活细胞或裂解物中）使用核酸识别部分时，可以期望将 抗核酸酶碱基并入寡聚物中。一些非限制性实例可以包括硫代磷酸酯碱基、2-0-烷基化或 2-卤代RNA碱基、锁核酸、肽核酸、吗啉代或包含这些中的至少一个的嵌合体。与取决于RNA酶Η活性的反义探针不同，寡聚物的内部碱基不需要诱导靶RNA转录物的RNA酶Η水解。因 此，在核酸识别部分中的任何位置都不需要RNA酶Η诱导碱基。
[0141] 核酸识别部分中的碱基序列可以与靶核酸上的杂交位点互补，以允许核酸识别部 分与靶核酸的序列特异性结合。在一个实施方案中，选择该杂交位点以使得其序列不类似 于已知存在于非靶核酸中的序列。在另一个实施方案中，该杂交位点包括发现