启动子组合物的制作方法
【专利说明】启动子组合物
[0001] 相关专利申请 本专利申请要求在2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/794,818的优先 权，该申请以通过引用整体并入本文。
【背景技术】
[0002] 当前用于神经退行性疾病的基因治疗的方法缺乏开启和关闭被递送的治疗基因 的表达的能力。另外，当前方法缺乏在递送后定量调节治疗基因的表达的能力。对可调控 的启动子有着现实的需求。
[0003] 发明概沐 在某些实施方案中，本发明提供一种分离的启动子序列，包括长度在500至1700个 核苷酸之间的核酸或由长度在500至1700个核苷酸之间的核酸组成，所述核酸与SEQID N0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6或SEQIDN0:7 具有至少90%的同一性。在某些实施方案中，该启动子与SEQIDNO: 1、SEQIDN0:2、SEQ IDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、SEQIDN0:6或SEQIDN0:7具有90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
[0004] 在某些实施方案中，本发明提供一种包含上述启动子的表达盒，所述启动子有效 连接至编码蛋白质或RNA转录物的预选的DNA区段而在转化细胞中起作用。在某些实施方 案中，该预选的DNA区段包含选择标记基因或报告基因。在某些实施方案中，该预选的DNA 区段编码治疗组合物。在某些实施方案中，该治疗组合物为RNAi分子。
[0005] 在某些实施方案中，本发明提供一种包含上述表达盒的载体。在某些实施方案中， 该载体为腺相关病毒（AAV)载体。
[0006] 在某些实施方案中，本发明提供一种包含上述表达盒或上述载体的转化细胞。在 某些实施方案中，该宿主细胞为真核细胞。在某些实施方案中，该真核细胞为动物细胞(例 如哺乳动物细胞，如人类细胞)。
[0007] 在某些实施方案中，本发明提供一种产生转化细胞的方法，包括步骤：（i)将包含 上述有效连接至DNA区段的启动子的重组DNA引入细胞以便产生转化细胞，和（ii)识别或 选择转化细胞系。在某些实施方案中，表达该重组DNA以便将表型特征赋予该转化细胞。在 某些实施方案中，当将其引入源自亨廷顿氏病患者的细胞时，相比源自对照个体的细胞，该 转化细胞表现出显著增加的报告基因表达。
[0008] 在某些实施方案中，本发明提供通过上述方法制备的转化细胞。
[0009] 在某些实施方案中，本发明提供包含上述分离的启动子的转化细胞。
[0010] 在某些实施方案中，本发明提供包含上述表达盒的转化细胞。
[0011] 在某些实施方案中，本发明提供在哺乳动物中治疗神经退行性疾病的方法，包括 施用（a)上述载体或（b)上述转化细胞。
[0012]附图简沐 图1 :当与健康对照个体比较时，在亨廷顿氏病死亡后脑患者材料中，对五种启动子的 表达分析显示出其内源性转录物的上调。
[0013] 图2A-2C:在6周大（图2A)、11周大（图2B)和19周大（图2C)的亨廷顿氏病小鼠 脑中内源性转录物的上调。
[0014] 图3 :克隆的基因启动子序列的活性。
[0015] 图4 :通过报告基因（荧光素酶）表达所显示的克隆的基因启动子序列的诱导。
[0016] 发明详沐 本发明提供基因启动子序列的用途，所述基因启动子序列可以在神经退行性障碍发作 时或神经退行性障碍病理进展期间激活、增强或抑制基因序列的表达。本发明可直接应用 于基因治疗领域。作为在神经退行性疾病受调控的基因治疗方法的开发中的工具，它具有 潜在的商业价值。本发明提供一种在病程期间基于神经退行性疾病进展的状态或进展速率 定量调节或调控治疗基因表达的方法。例如，在疾病进展期间，该基因启动子序列可以激活 治疗基因的表达。如果该治疗停止了疾病进展，该基因启动子序列的活性会减弱，导致减少 的/有限的治疗基因表达。此治疗基因表达的疾病调控动态方法在基因治疗领域是独特的 和需要的。
[0017] 本发明可应用于基因治疗领域。它满足了在递送进入脑后对治疗基因的调控和/ 或定量调节的需求。基因表达分析已显示在神经退行性疾病进展发作时或神经退行性疾病 病程期间，大量基因启动子序列起到"开启"、增强、抑制或"关闭"基因表达的作用。本发明 人已在神经退行性疾病的细胞和动物模型中鉴定并克隆了在神经退行性疾病进展期间激 活和/或增强基因表达的基因启动子序列。这些基因启动子序列也可以在神经退行性疾病 模型中于神经退行性疾病进展期间激活和/或增强报告基因的表达。此方法是独特的并且 不同于现有的用于人工调控治疗基因表达的系统，该不同在于：其依靠神经退行性疾病相 关的分子事件来调制治疗基因的表达。这些事件以及因此特定的基因启动子序列的活性通 过依赖于疾病发作和/或进展的细胞内和/或细胞外信号来控制/诱导。
[0018] 本发明人已在得自对照个体或携带亨廷顿氏病（S卩，神经退行性疾病）基因突变 的个体的组织培养细胞中鉴定、克隆了七种不同的基因启动子序列并测试其活性。该实验 证明这些基因启动子序列在被引入源自亨廷顿氏病患者的细胞时，相比源自对照个体的细 胞，可以驱动显著增加的报告基因表达。同时，引入人造应激因子（stressor)(如蛋白酶体 抑制剂或促炎性刺激）导致来自基因启动子序列的活性增加，所述活性通过内源性控制的 转录物或报告基因在培养细胞中的表达来测量。另外，我们已在亨廷顿氏病（即，神经退行 性疾病）的小鼠模型的脑中检测出这些基因启动子序列活性的疾病进展依赖型增加，所述 活性的增加如通过内源性调控的基因转录物的定量PCR分析所测量。
[0019] 启动子序列 在某些实施方案中，本发明提供以下激活和/或增强基因表达的启动子序列：泛素 特异性肽酶 31 (USP31，SEQIDN0:1)，γ-FBG(SEQIDN0:2)，H2A组蛋白家族，成员 Y(H2AFY，SEQIDN0:3)，核转录因子Y，γ(NYFC，SEQIDN0:4)，DNA损伤诱导转录物 3 (CHOP，SEQIDN0:5),非编码 38ARNA(38A基因座，SEQIDN0:6)，和非编码 17ARNA (17A,SEQIDN0:7)〇 基因ID:USP31(SEQIDNO:1)
基因ID:β%?/5(SEQIDN0:5)
[0020] "启动子"是指通常位于其编码序列上游（5'）的核苷酸序列，它通过提供对RNA聚 合酶和正确转录所需的其它因子的识别来控制该编码序列的表达。"启动子"包括最小启 动子，所述最小启动子是由TATA框和其它用于指定转录起始位点的序列所构成的短DNA序 列，向所述转录起始位点加入调控元件以控制表达。"启动子"也指包括最小启动子加上能 控制编码序列或功能性RNA表达的调控元件的核苷酸序列。这种类型的启动子序列由近端 和更远端的上游元件组成，其中后者常常被称为增强子。因此，"增强子"是DNA序列，所述 DNA序列能够刺激启动子活性并且可以是该启动子的先天元件或是插入以增强启动子的水 平或组织特异性的外源元件。它能够在两个取向（正常的或翻转的）上操作，并且甚至能够 在被从该启动子移动至上游或下游时起作用。增强子和其它上游启动子元件均结合介导其 功效的序列特异性DNA结合蛋白。启动子可以是整体源自天然基因，或是由源自天然存在 的不同启动子的不同元件构成，或甚至是由合成的DNA区段构成。启动子也可以包含涉及 蛋白质因子结合的DNA序列，所述蛋白质因子控制应答于生理或发育状况的转录起始的效 率。
[0021] 如本文所用，"有生物活性的"意指该启动子具有至少约0.1%、10%、25%、50%、75%、 80%、85%、甚至9