治疗和/或预防1型糖尿病的方法和组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 优先权要求
[0002] 本申请要求2013年3月8日提交的美国临时专利申请系列号61/775, 115的优先 权，其全部内容通过引用和参考并入本文。
[0003] 关于联邦咨助研究的声明
[0004] 本工作受来自美国政府通过国立卫生研究院资助的资助号R56-AI-095235的支 持。美国政府享有本发明的某些权利。
技术领域
[0005] 本发明一般地涉及治疗或预防1型糖尿病（"T1D"）的方法和组合物。
【背景技术】
[0006] 1型糖尿病（T1D)，曾经称为青少年糖尿病，是自身免疫介导的疾病，其特异 性靶向胰腺β细胞（Castano等，Ann.Rev.Immunol. 8:647-680 (1990))。疾病发病机 理涉及T细胞浸润至胰岛，其导致随后产生胰岛素的β细胞的破坏（Bach，Endroc. Rev. 15:516-542(1994))。没有胰岛素，不能储存血糖（葡萄糖）并且稍后用作能量（Bach， Endroc.Rev. 15:516-542(1994))。T1D的早期症状包括尿频、过度疲劳和兴奋（VanBelle 等，Physiol.Rev. 91:79-118(2011))。延长暴露于血流中的高水平的葡萄糖可造成对整 个身体器官系统的严重损伤（Bach，Endroc.Rev. 15:516-542(1994))。不清楚T1D的准 确原因，但是怀疑自身免疫、遗传和环境因素（Tisch等，Cell. 85:291-297(1996))。世界 上大概三百万人遭受T1D，一百万是美国人，报道的增加速度是每年3至5%范围的增加 (Melmed等，WilliamsTextbookofEndocrinology:第 12版（2011))。尽管该疾病的高 发病率，但是糖尿病仍不能治愈。受T1D折磨的人必须求助于膳食改变，持续监测他们的血 糖水平和胰岛素注射或通过栗持续胰岛素注入（Freeborn等，J.Clin.Nurs.doi:10. 1111/ jocn. 120462013))。即使短时间血糖水平处理不当可造成严重的后果，包括：肾衰竭、视力 改变、心脏病、中风或甚至死亡（Simone等，DiabetesCare.22(Suppl.2):B7_B15(1999); Livingstone等，PLoSMed。9(10) :el001321 (2012);Secrest等，Diabetes Care. 33:2573-2579(2010))〇
[0007] 就许多自身免疫性疾病，T1D可能涉及多个自体抗原和不同的T细胞特异性 (Bach，Endroc.Rev. 15:516-542 (1994).;Tisch等，Cell. 85:291-297 (1996))。基因修饰 以表达自身和改变的自身肽（Ig-嵌合体）的免疫球蛋白（"Igs"）可用于抑制病理学免 疫应答（Miller等，Nat.Rev.Immunol. 7:665-677(2007))。这些Ig-嵌合体已经显不，由 于Ig-嵌合体的内化、在内体隔间中加工和肽对新合成的MHC分子的无限获取，对T细胞的 呈递相对于游离肽增加了 100 倍（Zaghouani等，Science. 259:224-227(1993);Legge等， J.Exp.Med. 185:1043-1053 (1997);Brumeanu等，J.Exp.Med. 178:1795-1799 (1993))。因为 Igs是自分子，即使当需要重复注射时副作用最小，并且因此有助持续疗法。Ig_嵌合体允 许特异性阻断自活性免疫细胞的有害作用，同时保持身体的免疫系统清理外源抗原的能力 (Miller等，Nat.Rev.Immunol. 7:665-677(2007))。所以，表达致糖尿病肽的Ig-嵌合体是 吸引人的治疗或预防T1D的抗原特异性治疗方法。
【发明内容】
[0008] 本公开提供了在需要其的对象中治疗或预防1型糖尿病（"T1D"）的方法和组合 物。在一个方面中，本公开提供了递送抗原特异性疗法用于下调致糖尿病T细胞（免疫调 节）和同时施用干细胞和/或祖细胞用于在胰岛中再生内皮细胞用于治疗或预防T1D的方 法。
[0009] 本公开提供了在需要其的对象中治疗或预防糖尿病的方法，方法包括：向对象施 用治疗有效量的包括一定量的一个或多个干细胞和/或祖细胞和一定量的至少一种抗原 特异性疗法的组合物。
[0010] 本公开也提供了组合物，其以治疗有效量包括一定量的一个或多个干细胞和/或 祖细胞和一定量的至少一种抗原特异性疗法。
[0011] 本公开也提供了以治疗有效量包括一定量的一个或多个干细胞和/或祖细胞和 一定量的至少一种抗原特异性疗法的组合物，以维持β-细胞和内皮细胞形成和逆转糖尿 病。
[0012] 本公开也提供了在需要其的对象中治疗或预防糖尿病的方法，方法包括：向对象 施用治疗有效量的包括一定量的纯化骨髓内皮祖细胞和免疫球蛋白Ig-GAD2的组合物。
[0013] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，糖尿病是1型糖尿病。
[0014] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，对象是哺乳动物包括，例如，人。
[0015] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，干细胞和/或祖细胞是全能的、多能的、 多功能的或单能的。
[0016] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，干细胞和/或祖细胞分离自骨髓。
[0017] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，干细胞和/或祖细胞是纯化的骨髓内皮 祖细胞。
[0018] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，干细胞和/或祖细胞是同种异体细胞。
[0019] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，干细胞和/或祖细胞是自体细胞。
[0020] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，至少一种抗原特异性疗法是免疫球蛋 白-多肽嵌合体。
[0021] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，免疫球蛋白-多肽嵌合体是可溶的。
[0022] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，免疫球蛋白-多肽嵌合体是聚集的。
[0023] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，免疫球蛋白-多肽嵌合体包括具有CDR3 区域的免疫球蛋白，和其中致糖尿病抗原决定部位插在CDR3区域中。
[0024] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，致糖尿病抗原决定部位源自GAD，例如包 括GAD2(SEQIDN0:1)或GAD1(SEQIDN0:2)。
[0025]在任何上述方法或组合物的实施方式中，致糖尿病抗原决定部位源自INSβ，例 如，包括INS0(SEQIDΝ0:3)。
【附图说明】
[0026] 当结合附图阅读时，将更好理解本公开的前述内容，以及下述详细说明。为了图解 本公开的目的，图中显示了显示了目前优选的实施方式。但是，应理解，本公开不限于显示 的精确布置、实施例和手段。
[0027] 图1A-D显示单独Ig_GAD2治疗不能克服明显T1D，尽管诱导免疫耐受。图1A显示 在用Ig-GAD2治疗的明显糖尿病小鼠中没有恢复血糖量正常。下图指示，在Ig-GAD2治疗 的糖尿病小鼠中，尽管Ig_GAD2不能恢复血糖量正常，但是治疗导致如脾中根除Thl7细胞 但是Thl细胞驻留显示的致诱导免疫耐受，和IFNγ和/或IL-10的增加（图1B-D)。
[0028] 图2Α-Ε显示在用Ig_GAD2和骨髓（ΒΜ)移植治疗的明显糖尿病小鼠中恢复血糖量 正常。图2A描绘了治疗方案的示意性表示。图2B显示与单独接收BM或Ig-GAD2的小鼠 相比，在接收Ig-GAD2+BM的组合治疗之后，维持血糖量正常的小鼠的百分数增加。图2C显 示在接收Ig_GAD2+BM的小鼠的脾和胰腺细胞中产生的细胞因子的增加。图2D显示在脾和 胰腺的细胞中产生的IL-17的下降。图2E显示Thl和Thl7细胞的签名转录因子的下降。
[0029] 图3A-G显示Ig_GAD2+BM接受小鼠中胰腺β-细胞的再生。图3A-D显示在 Ig-GAD2+BM治疗的小鼠接受者中相比单独Ig-GAD2或ΒΜ治疗，血糖量正常的持续恢复。 Ig-GAD2+BM治疗的小鼠接受者具有更多的胰岛和更多的β-细胞，所述胰岛大部分没有胰 岛炎，其具有最小渗透和丰富胰岛素阳性细胞（图3B-C。而且，用Ig-GAD2+BM的治疗恢复 产生胰岛素的细胞和β-细胞群的数量（图3E-G)。
[0030] 图4A-D显示从健康至高血糖至糖尿病的讲展期间，在外周血液和腠腺中表达 PECAM1的内皮细胞的下降。
[0031] 图5A-C显示内皮细胞的恢复与β-细胞再生平行。图5Α显示与单独接收Ig-GAD2 或ΒΜ的那些小鼠相比，来自用Ig-GAD2+BM治疗的小鼠的胰腺胰岛切片中增加的PECAM1和 胰岛素染色。图5B显示相对于未治疗的糖尿病小鼠，接收Ig-GAD2+BM的小鼠中内皮细胞 的功能标记物的增加。来自Ig_GAD2+BM治疗的小鼠的胰腺切片显示和增加数量的胰岛素 +ki-67+胰腺细胞（图5C)。
[0032] 图6A-B显示新的胰腺内皮细胞源自供体BM。
[0033] 图7A-D显示Ig_GAD2的治疗期间内皮细胞祖细胞的转移维持β-细胞再生并且 恢复血糖量正常。图7Α-Β显示与年龄相当的健康的小鼠相比，糖尿病小鼠中表达内皮祖细 胞（EPC)标记物c-kit和FLK-1的ΒΜ细胞明显减少。相比全ΒΜ-接受者小鼠，接收来自健 康供体的EPC的糖尿病小鼠展示更高的恢复速度（图7C)。从糖尿病N0D-GFP小鼠分离的 EPC产生最小疾病恢复和最小移植GFP细胞至胰岛（图7C-D)。
[0034] _显示用Ig_GAD2+BM治疗糖尿病小鼠使得消除与出现糖尿病相关的胰岛 素-抗性。
[0035] 图9显示在Ig_GAD2+BM治疗期间，源自供体BM的细胞和产生胰岛素的细胞在第 30、60或120天没有共定位（左图）。在无糖尿病的小鼠中富含源自供体BM的细胞，但是 在相同方案的仍糖尿病的那些接受者中最小（右图）。
[0036] 图10显示用IgGAD2+BM治疗的无糖尿病的小鼠的胰腺中上调编码血管生成因子 的基因，包括VEGFa、血管生成素1和血管生成素2(图10A)。图10B显示新形成的产生胰 岛素的β-细胞也产生VEGFa。
[0037] 发明详述
[0038] 用于治疗包括1型糖尿病（T1D)的糖尿病的有效疗法仍具有重要的医学需要。最 近发现，抗原特异性疗法（例如，Ig-GAD)诱导高血糖对象中的免疫调节，其能够控制胰腺 炎、刺激细胞再生和预防T1D进展。但是，当相同的抗原特异性疗法给予具有明显T1D 的对象时，尽管与在治疗高血糖对象中看到的类似的免疫调节，不能逆转疾病的过程。令人 吃惊地，发明人已经发现当伴随着骨髓（ΒΜ)细胞（例如，祖细胞）的转移时，抗原特异性疗 法能够维持从明显T1D的恢复。这样，本公开提供了用于治疗或预防T1D的组合物和方法。 这样的方法可包括选择患T1D的对象，和向对象施用有效量的组合物，其包括大量（例如， 有效量）的一个或多个干细胞和/或祖细胞和大量（例如，有效量）的至少一种抗原特异性 疗法。公开的组合物和方法可用于替换或补充用于治疗和/或预防T1D的其他药学方法。
[0039] 本公开提供了在需要其的对象中治疗或预防糖尿病的方法，方法包括：向对象施 用治疗有效量的组合物，其包括一定量的一个或多个干细胞和/或祖细胞和一定量的至少 一种抗原特异性疗法。
[0040] 本公开也提供了组合物，其以治疗有效量包括一定量的一个或多个干细胞和/或 祖细胞和一定量的至少一种抗原特异性疗法。
[0041] 本公开也提供了组合物，其以治疗有效量包括一定量的一个或多个干细胞和/或 祖细胞和一定量的至少一种抗原特异性疗法，以维持β-细胞和内皮细胞形成和逆转糖尿 病。
[0042] 在本公开的一种实施方式中，糖尿病是1型糖尿病。1型糖尿病（T1D)的特征在 于自身免疫攻击和损失胰腺中胰岛的产生胰岛素的贝塔细胞细胞）。疾病通过在本 领域通常称为胰岛炎前、胰岛炎、高血糖，和明显糖尿病的数个阶段进展。可通过血糖水平、 淋巴细胞渗透至胰腺细胞的程度，和胰腺β-细胞群确定疾病阶段的诊断。如本文所使用， 术语"胰岛炎"指发生胰腺渗透，使得受影响的胰岛已经丢失了它们的大部分细胞群 (约80%丢失）。如本文所使用，术语"胰岛炎前"指胰腺渗透的早期阶段使得有较小程度 的β-细胞群丢失（约〇%-40%丢失）。如本文所使用，术语"高血糖"指出现更高的正常 禁食血糖水平，通常大于约126mg/dL。如本文所使用，术语"明显糖尿病"指基于血浆葡萄 糖水平，通常为约300mg/dL或更高、胰腺渗透，和大大减少的β-细胞群，诊断对象中完全 发作的糖尿病。
[0043] 在一个实施方式中，组合物施用至在T1D的胰岛炎前阶段的对象。在仍另一实施 方式中，在对象经历ΙΑΑ血清转化之前，组合物施用至对象。在仍另一实施方式中，在对象 已经血清转化并且产生针对一个或多个β-细胞相关抗原的自抗体之前组合物施用至对 象。在仍另一实施方式中，组合物施用至ΙΑΑ阳性的对象。在另一实施方式中，组合物施用 至T1D胰岛炎阶段的对象。在仍另一实施方式中，在对象已经发展了高血糖之前化合物施 用至对象。在本发明的另一实施方式中，当开始治疗时，对象已经发展了高血糖。在仍另一 实施方式中，对象已经诊断患明显糖尿病。
[0044] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，对象是哺乳动物包括，例如，人。
[0045] 术语"治疗（treatment) "、"治疗（treat) "和"治疗（treating) "，如结合如本 文所描述的方法使用时，指临时或永久、部分或完全消除、减少、抑制或减轻T1D的临床症 状、表现或进展（例如，诊断的事件、疾病或病况的症状、表现或进展）。另外，或可选地，术 语"治疗（treatment) "、"治疗（treat)"和"治疗（treating)"，如本文结合如描述的方法 所使用指临时或永久、部分或完全抑制、延迟、抑制、减少、治疗、消除或减轻T1D的临床症 状或表现。在一些实施方式中，与在治疗之前进行的症状、迹象和/或病况的基线测量相 比，治疗包括有效减轻对象中T1D的症状、迹象和/或病况至少约10% (例如，15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 100%)。在一些实施方式中，与在治疗之前进行的基线评估相比，治疗有效改善包括用于诊 断对象中T1D的评估。如本文提供的这样的治疗不需要绝对有效。
[0046]如本文所使用，术语"预防（prevention) " "预防（prevent) "或"预防 (preventing) "指与没有进行测量的出现相比，消除或减少如本文所描述的T1D发病率或 出现。
[0047]如本文所使用，术语"需要治疗的"指护理人员判断患者需要或得益于治疗。该 判断的进行基于护理人员领域的各种因素，但是包括患者展示T1D的临床症状或表现的知 识。
[0048]如本文所使用，术语"有效量"指单独或作为药学组合物一部分的大量的组合物 (例如，包括一定量的一个或多个干细胞和/或祖细胞和一定量的至少一种抗原特异性疗 法的组合物），其当施用至对象（例如，作为一个或多个剂量）时，能够对疾病状态或病况 的任何症状、方面、参数或特征具有任何可检测的积极作用。这样的作用不需要是绝对有益 的。
[0049] 干细胞和祖细胞和抗原特异性疗法
[0050] 本公开考虑任何干细胞和/或祖细胞和抗原特异性疗法。
[0051] 干细胞和/或祖细胞可分离自身体的许多组织。如本文所使用，术语"干细胞"指 能够自我更新的未分化的细胞，意思是每个细胞分裂至少一个也是干细胞的子细胞。干细 胞也能够分化成更成熟的细胞类型（例如，外胚层细胞系、中胚层细胞系和/或内胚层细胞 系的细胞）。如本文所使用，术语"祖细胞"指源自干细胞的未分化的细胞，其能够自我更新 并且分化，但是通常与干细胞相比，具有更