专利名称：一种用于预防和治疗i型糖尿病的药物复合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防和治疗I型糖尿病的药物复合物及其应用。具体地，本发明涉及一种包括1)能够治疗I型糖尿病的多肽；2)包括分别与胰岛素原、GAD65和可以结合T细胞负调节蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50％同源性的多肽的核酸疫苗的用于预防和治疗I型糖尿病的药物复合物，及其应用。
背景技术：
糖尿病是造成人类死亡的主要病因之一，严重危及人类健康。I型糖尿病和II型糖尿病是糖尿病的两种主要形式。凋亡即程序性死亡是I型和II型糖尿病胰岛细胞死亡的主要原因。I型和II型糖尿病人都表现有进行性的胰岛B-细胞质量减少和B-细胞功能降低。
胰高血糖素类似肽(GLP-1，从7位到36位氨基酸的氨基化合物)是一种主要的生理性胰岛素类似激素。由于天然GLP-1独特的促胰岛素样作用和抗高血糖素样作用，以及对胰脏B细胞的营养作用，因此在治疗糖尿病方面展现了极大的药学应用前景。这一点与临床治疗糖尿病重新制定的治疗目标不谋而合。其药学的重要意义还在于，与当今使用的磺基脲、胰岛素等治疗糖尿病的一线药物相比，它并不会产生增加体重等副作用。实际上，由于GLP-1能促进涨饱的感觉，可自然减少食物的摄取，因此限制了患者体重的增加，甚至有可能造成体重的降低。
进行治疗的主要困难在于一些酶类(如二肽酰二肽酶(DPPIV))可以使GLP-1快速失活，再加肾脏对GLP-1的排出作用，使得GLP-1本身的半衰期很短(t1/2＜2min)。因此采取持续性的皮下灌流可以维持机体内GLP-1的功效。DPPIV抑制剂能够延长GLP-1的半衰期并且正在临床实验中进行测试，但是这种方法仍然缺乏特异性，这是因为DPPIV同时还能使其他几种多肽激素和趋化因子失活，将其抑制会产生各种不利反应。
Exendin-4(Ex-4)是一种39个残基的蜥蜴唾液腺多肽，是GLP-1的同功因子，有55％的序列同源性，药学性质与GLP-1相似。与GLP-1相反，Ex4在水溶液中能形成单体螺旋。这种螺旋由于疏水性C端的首尾相互作用，表现出罕见的热稳定性。由于GLP-1缺乏C端首尾的相互作用、其自身的柔韧性以及16位的甘氨酸残基(是指甘氨酸还是氨基酸的残基)被认为是降低单体螺旋状态稳定性的因素。而Ex4螺旋内部的稳定性可减少结合受体时的正位功效，这一结合需要C末端保持螺旋状态。
此外，白蛋白偶联的GLP-1(Albugon)也同样具有和较长的半衰期和治疗糖尿病的功能。
尽管像Ex4一样具有DPP-IV-抗性的GLP-1受体激动剂在治疗糖尿病方面展示很大的药用价值前景，但这些多肽需每日注射1-2次或配合口服药物使用。由于Albugon分子较大，由肾脏排出量较少，因而也具有较长的半衰期。然而体外实验结果显示融合蛋白的功效不如Ex-4。而且，更重要的是多肽类药物可以产生危险的致敏反应。这使得人们投入更多精力去开发在体内功效更持久，稳定性更高的效应分子。
I型糖尿病是一种复杂的自体免疫性疾病，当胰岛抗原反应性T细胞侵润到胰岛兰氏小岛，会启动炎症过程杀死胰岛细胞。这种由T杀伤细胞对胰岛细胞造成的伤害是自体免疫主要的和持续性的效应，也是I型糖尿病难以治愈的主要原因之一。基因治疗目前已应用到糖尿病动物模型上。例如，基因疗法已经应用于调节性的淋巴因子如IL-4，IL-10，TGF-beta-1的全身给药方面，或是用于体内B细胞移植的体外修饰方面。研究人员也选择了将bcl-2基因转染至用于细胞移植的B细胞，以防治细胞的凋亡。但这些治疗措施都有极大的局限性。在临床应用方面可能有许多负面效应，如将基因导入移植的胰岛中会受到抗胰岛免疫反应和某些质粒相对较短的表达时间所限。此外，已经通过基因疗法投送胰岛素或胰岛素类似物到肝脏，肌肉和其它组织，但并没有取得预期的对血糖水平的生理调节。另类疗法涉及到体内投送基因(如PDX-1)诱导肝细胞分化胰岛细胞，但初期的成功实验却很难重复。近年来确实提出了许多以基因为基础的治疗方法，但这些疗法几乎都建立在病毒载体基因转移的基础上，有许多局限性诸如病原性和免疫原性，还没有一例可以应用于人类。显然，只要I型糖尿病的自体免疫反应得不到控制，新移植的胰岛或是由于再生而产生的新的胰岛终究会被肌体排斥。
发明内容
本发明的目的之一是一种用于预防和治疗I型糖尿病的药物复合物。组成药物复合物之一的GLP-1-IgG-Fc融合蛋白及其类似物能促进胰岛B细胞增殖、再生和减少凋亡，从而增加胰岛细胞质量，并且能促进胰脏B细胞分泌胰岛素和对葡萄糖的耐受性，激活cAMP和其耦联的第二信使途径和促进B细胞中蛋白激酶(Akt1和MAPK)的表达以及增加其含量，降低caspase-3的活性。
组成药物复合物之一的核酸疫苗，通过与CTLA-4配体结合，使得提供负调节信号的T-细胞受体与抗原识别的联结，通过持续产生的T-调节细胞(Tr)抑制了肌体T-细胞对胰岛素或GAD65多肽的反应，因此控制了存在于1型糖尿病的持续的自体免疫反应。解除了由T-杀伤细胞造成的胰岛B细胞损伤和肌体持续的自体免疫状态。加上GLP-1促进胰岛B-细胞再生的效应，从而在控制了自体免疫的同时，促进了胰岛B细胞的增殖和功能的改善。总之，该药物复合物有针对性地对导致1型糖尿病无法治愈的两个关键病因双管齐下，从根本上为预防与治疗1型糖尿病提供了崭新的思路与有效的途径。
本发明的再一目的是提供上述药物复合物的给药途径。
本发明的再一目的是提供上述药物复合物的给药剂量。
本发明的再一目的是提供上述药物复合物用于制备治疗糖尿病的药物的应用。
根据本发明的技术方案，本发明提供了一种用于预防和治疗I型糖尿病的药物复合物，其中，该药物复合物包括1)能够治疗I型糖尿病的多肽，或含有该多肽的基因的表达质粒；2)包括分别与胰岛素原、GAD65和可以结合T细胞负调节蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50％同源性的多肽的核酸疫苗。
根据本发明的药物复合物，其中，所述多肽能够治疗I型糖尿病的多肽为胰高血糖素类似肽GLP-1或与其具有50％以上同源性的同功因子与IgG-Fc的融合蛋白，所述IgG-Fc可以为鼠IgG-Fc或人IgG-Fc。
在上述药物复合物中，所述融合蛋白可以为胰高血糖素类似肽GLP-1与IgG1-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc为IgG1、IgG2或IgG3；或GLP-1的同功因子extendin-4与IgG1-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
根据本发明的药物复合物，其中，所述融合蛋白为突变体GPL-1-A8G-IgG-Fc，并且IgG-Fc为IgG1、IgG2或IgG3。其中GPL-1的氨基酸序列的第8位的丙氨酸被甘氨酸取代，或者被其它氨基酸取代，或者对GLP-1序列其它氨基酸修饰使得突变体GPL-1耐受其降解酶(如二肽酰二肽酶，DPPIV)。
根据本发明的上述药物复合物可以口服、肌肉注射、静脉注射、经皮给药、经粘膜给药，并且，被给药的具有蛋白活性的药物复合物的量为0.05nmol～1nmol/kg体重，或有效cDNA的量为1μg-10μg/kg体重。
根据本发明的药物复合物可以用于制备治疗糖尿病的药物。
根据本发明的药物复合物，GLP-1-IgG-Fc结合核酸疫苗(胰岛素原，GAD65和能结合CTLA-4(CD152)的突变体B7(B7-1wa)接种以促进B细胞再生和同时控制自体免疫过程。这样，可以完全免除有高度危险发生I型糖尿病患者的发病，或者完全治愈新近诊断为I型糖尿病的病人或是那些多年的1型糖尿病人只要他们的胰脏仍然有少量有活性的胰岛B细胞。
用于本研究的NOD鼠是自体免疫性糖尿病极佳的实验模型。NOD鼠发生糖尿病与T-helper 1(Th1)和细胞毒T淋巴细胞(CTL)对胰岛抗原反应有关，也与T调节细胞(Tr)失调有关。改变产生生长因子B1(TGF-β1)-的Tr细胞对该病可起保护作用，但其功能随年龄而下降。我们发现TGF-β1基因疗法可以预防NOD鼠发生糖尿病，多种治疗措施如CD3Ab疗法可以部分诱导Tr细胞产生TGF-β1，其他Tr细胞也可能参与其中，如CD4+CD25+细胞通过引导细胞接触，来诱导天然Tr细胞(nTr)。
研究发现，通过核酸疫苗接种，即通过递送抗原基因与CTLA-4(CD152)配体结合可以产生Tr细胞。核酸疫苗接种对预防NOD鼠I型糖尿病效果显著。CTLA-4是高效的T细胞负调节因子，它对某些Tr细胞的活性是必不可少。CTLA-4与其相关分子CD28之间有天然配体的区别，因为二者都结合B7-1和B7-2(由抗原呈现细胞[APCs]表达)。我们使用了突变体B7-1分子(B7-1wa)，该分子有氨基酸点突变(W88 to A)，其能结合CTLA-4但不能结合CD28。如果用前胰岛素原1(PPIns)作为核酸疫苗接种的目标分子并与B7-1wa同时接种，则因Tr细胞无法识别而只有部分的保护作用。因此用PPIns/GAD65融合(Ins-GAD)作为目标抗原以诱导产生大量的自体抗原目标抗原决定簇(autoantigenic target epitopes)。双核酸疫苗的接种使得提供负调节信号的T-细胞受体(TCR)与抗原识别的联结，这样持续产生的Tr细胞抑制了对胰岛素或GAD65多肽的反应，保护机体免于自体免疫疾病。重要的是特异性抑制作用只针对免疫胰岛抗原。
I型糖尿病是T-细胞依赖性的自体免疫性疾病。由于患者广泛的胰岛B细胞损伤和持续的自体免疫状态，因此很难治愈。成功的治疗手段必须能补充胰岛细胞质量，控制自体免疫过程。根据本发明，GLP-1-IgG-Fc结合核酸疫苗(胰岛素原，GAD65和能结合CTLA-4(CD152)的突变体B7(B7-1wa)是一种双管齐下的治疗方法。它既能够通过GLP-1的作用促进B细胞再生和增殖，改善B细胞功能，进而恢复胰岛B细胞正常分泌胰岛素，增加胰岛B细胞质量，和减少分泌高血糖素，从根本上解除了患者高血糖症状的病因，改变以往治标不治本的治疗方法；同时通过核酸疫苗的作用控制患者的自体免疫过程，终止T杀伤细胞对胰岛B细胞的持续伤害所造成的B细胞程序性死亡过程，结束I型糖尿病患者必须终生依赖外源胰岛素但仍然无法逆转病程恶化的悲惨局面。本发明的药物复合物的应用可以完全免除有高度危险发生I型糖尿病患者的发病，或者完全治愈新近诊断为I型糖尿病的病人或是那些多年的1型糖尿病人只要他们的胰脏仍然有少量有活性的胰岛B细胞。此外，使用本发明的药物复合物的方法简便、疗效持久、副作用少、费用低廉，从而为彻底战胜I型糖尿病提供了一条崭新的途径。
图1说明构建GLP-1-IgG-Fc质粒示意图，其中图A和图B表示鼠GLP-1-IgG1-Fc；图C和图D表示人GLP-1-IgG2-Fc。
图2说明IgG-Fc融合蛋白在COS-7细胞中的表达和检测。
图3说明检测转染COS-7细胞分泌的GLP-1。
图4(A)说明COS-7细胞大量表达IgG-Fc融合蛋白，图4(B)说明GLP-1在哺乳细胞和大肠杆菌中的表达。
图5说明GLP-1融合蛋白在COS-7细胞系稳定表达。
图6说明GLP-1-IgG-Fc融合蛋白对INS-1细胞胰岛素分泌的影响。
图7说明GLP-1-IgG-FC对INS-1细胞产生cAMP与Ex-4有相似的功效。
图8说明GLP-1-IgG-IgG-Fc在二型糖尿病模型db/db受试鼠中表达的效果。
图9说明在经STZ诱导形成的胰岛素分泌缺陷的I型糖尿病模型鼠体内表达GLP-1-IgG-Fc的效果。
图10说明GLP1-IgG-Fc在大型哺乳动物猪中表达对血糖的影响。
图11说明用PPI/GAD和B7.1-wa进行双重疫苗接种的效果。
图12说明移植双重疫苗接种的鼠脾细胞能够预防由糖尿病NOD鼠脾细胞诱导的自家免疫疾病。
图13抗原刺激引起的致糖尿病细胞(D)释放IFNγ在体外被给以双重疫苗接种鼠(V)脾细胞所抑制。只有CD4+，而不是CD8+抑制了致糖尿病细胞的反应。
图14显示抗原刺激所致致糖尿病细胞(D)被来自双重疫苗接种的鼠脾悬浮培养细胞CD4+B7.1+级分所抑制。
图15显示致糖尿病脾细胞抗原刺激引起的IFNγ释放被双重疫苗接种的鼠脾细胞抑制。
图16说明显型抑制细胞实验的结果。
具体实施例方式
糖尿病动物模型体内实验体内实验是用来自JacksonLaboratories(Bar Harbor，ME，USA)4周龄的雌性db/db模型鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb，批号000642)，来自Charles River Canada(Montreal，QC，Canada)作为对照的C57BLKS/J鼠和CD1鼠。购自Taconic Farms(Germantown，NY)的雌性NOD鼠。受试鼠饲养在有控光照(12hs/12hs)、恒温、无病原菌的条件下，提供充足的适宜啮齿类的食物和饮水。NOD鼠给以常规的灭菌的Charles River#5075食物。每日注射低剂量的STZ(55mg/kg，i.p.)连续5天诱导产生胰岛素分泌缺陷的糖尿病鼠。
糖尿病的诊断受试鼠血糖水平每周用AccuSoft AdvantageTM测试仪或血糖仪(Roche Diagnostics)测试。当连续2次测量血糖水平高于17.0mmol/L即诊断为糖尿病。
核酸疫苗的制备装有鼠野生型GAD65 cDNA的Bluescript KS+质粒为市售可得。无终止密码子的全长PPIns I序列已由本发明人于2002年在Hum.Gene Therapy杂志公开。。重叠PCR法将PPIns I与全序列的GAD65融合，得到5‘-PPIns-GAD65-3’的PCR产物Ins-GAD，然后通过限制性酶切位点装入已经删除荧光素酶基因的VR1255表达质粒(Vical Inc.，San Diego，CA)，起名VR-Ins-GAD。在COS-7细胞表达装有VR-Ins-GAD基因的质粒，得到分泌到细胞培养液的Ins-GAD杂交分子，并经免疫印迹法确认。同样，注射这个质粒并结合电转移，在肌肉细胞里产生Ins-GAD蛋白。提取后经免疫印迹和ELISA实验确认。空的VR1255-质粒取名VR作为对照。VR-B7-1wa的序列编码B7-1分子并在88位点以色氨酸置换丙氨酸，置换方法为现有点突变技术。这些VR1255衍生的质粒有人细胞巨化病毒(CMV)直接早期强化子和启动子(IE-EP)元件，CMV内含子A，以及兔球蛋白终结序列。
质粒构建为扩增GLP-1的全序列和鼠IgG-Fc cDNAs序列，以GLP-1/PCR2.1和IgG质粒为模板，以下列特异性序列5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCA-3’和5’-TGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’为引物进行第一轮交迭PCR(overlap PCR)。以PCR产物为模板进行第二轮交迭PCR产生GLP-1-IgG-Fc cDNA序列。将扩增的产物亚克隆到质粒Vmew的BamHI和Eco RV位点。为扩增GLP-1和人IgG-Fc cDNAs序列，以GLP-1/PCR2.1和IgG质粒为模板，以下列特异性序列构建人IgG2 FC(铰链-CH2-CH3)所用引物为5’-AAGGATATCGATCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCA-3’和5’-CGTAAGCTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3’。所用载体同上。为构建IgG-Fc对照质粒，以下列特异性序列5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’；和5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’为引物进行PCR，扩增产物克隆到质粒Vmew的Bam HI和Eco RV位点。载体含有CMV增强子和启动子，单一真核生物转录单元，兔最小贝它球蛋白多聚腺嘌呤尾和转录终止序列。
Vrnew载体是由VR1255载体删除荧光素酶报告基因的衍生载体，并添加了限制性内切酶位点。为使GLP-1或Exendin-4序列分泌，通过PCR于5‘端引入Igκ链信号肽或GHRH信号肽序列。为在细菌中表达GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，通过PCR扩增Vrnew载体的融合cDNA序列，并亚克隆至pET-28a质粒(Novagen)。构建质粒的示意图如图1所示。
GLP-1-IgG-Fe融合蛋白的表达在哺乳动物细胞中的表达，是将GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc的cDNA通过脂质体Lipofectamine2000(Invitrogen)转染到COS-7细胞系。其过程是先将密度为每孔2.5×105个的COS-7细胞生长在6孔细胞培养板。添加含有4μg DNA IgG-Fc cDNAs和10μL转染脂质体的无血清无抗菌素的DMEM培养液(Invitrogen)在37℃的CO2培养箱进行培养。6h后，转换为DMEM全培养基。转染后48h分别收集培养液和细胞，转染的COS-7细胞分泌的融合蛋白见图3。为了大规模地表达GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，将COS-7细胞培养在150mm培养皿，分别用150mM NaCl将阳离子转染试剂Poly(ethyleneimine)(PEI，25kDa)和80μg相关cDNA稀释，混合后放置20min.然后将DNA/PEI复合物加到盛有无血清无抗菌素DMEM培养液的细胞培养皿在37℃的CO2培养箱放置6h后，以加有10％FBS和1％P/S的DMEM培养液取代。该方法的转染率可高达85％。大量表达融合蛋白的结果见图4A。
为建立稳定表达GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的COS-7细胞系，细胞以每孔2.5×105的密度在6孔细胞培养板培养，并按照上述步骤转染4μg线性化的GLP-1/IgG-Fc质粒或作为对照的IgG-Fc质粒。转染以后24h，细胞在含有G418(500μg/mL)的DMEM培养液培养，以筛选已经稳定整合重组外源cDNA的细胞。培养过程中，每3天换培养液一次直至稳定表达外源基因的细胞克隆形成。分离单克隆细胞培养成稳定表达细胞系。培养在24孔培养板的细胞以及细胞培养液分别用鼠GLP-1 RIA试剂盒检测融合蛋白。将能分泌融合蛋白的细胞拣出并供以后的特性分析。稳定表达融合蛋白的COS-7细胞系RIA测定结果见图5。在细菌细胞系中表达GLP-1-IgG-Fc融合蛋白，是将GLP-1-IgG-Fc/pET28a质粒或将作为对照的IgG-Fc/pET28a质粒转化大肠杆菌Rosetta gami 2细胞系(Novagen，EMD biosciences，San Diego，CA)。方法可以是传统的氯化钙法或是应用电穿孔仪进行电转化。其具体参数可以从任何分子生物学实验手册中查到。转化后的细菌涂布于培养皿过夜培养，挑拣并筛选最佳表达融合蛋白的细菌菌斑。挑拣单个菌斑在50mL加有卡那霉素的2XYT培养液于37℃以225rpm过夜培养。而后将培养液以1∶50稀释到新培养液，直至细胞密度达到O.D600读数值0.6后，再在培养液中添加1mM的IPTG(EMD)以诱导融合蛋白表达。添加后3hr离心收集细菌细胞并在-80度保存。融合蛋白在哺乳动物细胞系和大肠杆菌的表达结果见图4B。
GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的纯化本发明的实例是从转染的哺乳动物细胞系或是大肠杆菌中以中小规模提取纯化融合蛋白。小规模提取纯化的具体做法是从培养哺乳动物转染细胞的6孔培养板中每孔取2.5mL培养基，转移至以含100mM Tris pH 8.0和150mM NaCl的缓冲液平衡过的装有70μL满体积事先结合G蛋白的葡聚糖凝胶4快速洗脱树脂(Amersham-Pharmacia)。经过4℃过夜后，以Tris缓冲液冲洗，然后以30μL含SDS的样品缓冲液将融合蛋白洗脱。
中规模提取纯化是用来获得较大量的融合蛋白。其具体步骤是从转染后48h的哺乳动物细胞，或是从稳定表达的细胞中，收集50mL的DMEM培养液。装入1mL满体积事先结合G蛋白的葡聚糖凝胶柱(Amersham-Pharmacia).并在1％Triton X-100下4℃过夜。而后反复用含0.1％Triton X-100的PBS冲洗，最后一步用150mM NaCl冲洗。用1mL 0.1 M glycine(pH 2.7)洗脱融合蛋白。洗脱液用Tris缓冲液(pH 9.0)中和，融合蛋白用PD-10柱(Amersham-Pharmacia)脱盐并用PBS洗脱。经凝胶柱纯化的蛋白经以上洗脱、中和、除盐后的最终体积为1mL。
用同样的方法也可以从细菌中纯化融合蛋白。将转化有融合蛋白基因质粒的细菌过夜培养，次日离心后的沉淀重新溶于含有多种蛋白酶抑制剂(Sigma，MO)的冷PBS缓冲液并通过超声波裂解细胞。缓冲液中加入1％Triton X-100保持30min后离心(12,000g，10min)，得到含有融合蛋白的上清液。其经凝胶柱纯化的过程以及洗脱、中和、除盐的过程与上述相似。
GLP-1-IgG-Fc融合蛋白的检测1.使用一步法RT-PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)确定GLP-1-IgG-Fc融合蛋白基因在转录水平上的表达。设计基因特异性引物5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCCCAGCGAGACCGTCACC-3’和5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’。
从转染融合蛋白质粒的COS-7细胞系取100ng的总RNA作为模板和添加0.6μM的引物5’-CCGGATATCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACCATGCTGAAGGGACCTTTACCAGTG-3’和
5’-CGCGGATCCCTATCATTTACCAGGAGAGTGGGAGAGG-3’。其它条件无特殊要求。一步RT-PCR的条件是50℃，30min；95oC，15Min；40循环。94℃，30sec，55℃，30sec；72℃，60sec，最后10min，72℃.RT-PCR产物通过1％agarose电泳分离，用溴化乙锭染色检测。2.SDS-PAGE和免疫印迹反应对表达的融合蛋白进行翻译水平上的检测。取小规模提取的融合蛋白30μL经10％SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移至醋酸纤维素膜，并用抗鼠抗体(15000，Amersham-Pharmacia)探测，用ECL显影(Amersham-Pharmacia)。30μL中等规模提取的融合蛋白则经10％SDS-PAGE凝胶电泳分离后用考马斯亮兰染色检测。融合蛋白在转录水平和翻译水平上的表达分别见图2a和图2b。
模型鼠体内表达GLP-1-IgG-Fc对糖尿病db/db模型鼠、NOD模型鼠和注射STZ的CD1鼠分别于肌肉注射GLP-1-IgG-Fc/Vmew载体或注射IgG-FcVRnew对照载体。注射后进行电转化用来促进基因体内的转移。对受试鼠施行麻醉，用27号针头于肌肉注射50mg溶于PBS的GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc质粒。注射针头套以塑料套以限制针头进入肌肉深度小于5mm。注射后进行电转移，在电极之间施加100V方波电脉冲(1S间隔)。注射DNA后4、6、32周在空腹情况下取隐静脉血。空腹血糖含量用一步法基本血糖计(Lifescan Canada)测定，GLP-1，胰岛素和高血糖素含量的检测见下述。GLP-1-IgG-Fc在受试鼠中表达效果见图8。
大型哺乳动物体内表达GLP1-IgG-Fc将GLP-1-IgG-Fc或对照IgG-Fc质粒肌肉注射到Yorkshire公猪，每头4mg/23kg随后用ADViSYS电转移仪进行电转移。注射3天后，将能引起高血糖症的Alloxan水化物(80mg/kg，Sigma)溶于25ml盐水，PH调中性，在麻醉条件下静脉注射。因该中性溶液不能有效引起高血糖，随后又在仅注射空白IgG-Fc质粒的对照组注射以引起中等程度高血糖。每周测量空腹血糖2次并用ELISA检测Fc蛋白，结果见图10。
GLP-1分泌实验GLP-1分泌实验的检测是采用GLP-1放射免疫试剂盒(Linco)，对瞬时或永久表达GLP-1-IgG-Fc或IgG-Fc融合蛋白的COS-7细胞系的培养液或转化融合蛋白基因的细菌裂解液检测其总GLP-1(包括各种形式的GLP-1)水平。对体内实验GLP-1水平的检测是用GLP-1 ELISA试剂盒(Linco)对取自db/db受试鼠的血浆GLP-1水平进行检测。实验结果见图6。
胰脏胰岛素含量检测为了比较GLP-1-IgG-Fc(Ex4-IgG-Fc，或GLP-1A8G-IgG-Fc)基因注射的鼠与仅注射Fc片断的鼠胰脏胰岛素总量的差别，将胰脏提取液按照已发表的方法用鼠胰岛素RIA试剂盒(Linco，St.Charles，MO)测量。
胰岛灌注实验为了比较GLP-1-Fc(Ex4-Fc，或GLP-1A8G-Fc)基因注射的鼠与仅注射Fc片断的鼠胰脏胰岛素分泌量的不同，按照已发表的方法进行胰岛灌注实验。
B细胞质量测定胰腺切片(4mm)按如前描述的处理.简言之，通过脱蜡，脱水和在柠檬酸盐缓冲液中煮沸进行抗原修复，切片与豚鼠抗胰岛素抗体(Dako Diagnostics)在4℃孵育过夜，然后样品用生物素标记的抗豚鼠抗体(Vector Laboratories)孵育1h，随后用抗生物素蛋白/生物素复合物(Vectastain Elite ABC试剂盒；Vector Laboratories，Burlingame，CA)处理1h。切片然后用DAB(Sigma-Aldrich)染色10min。DAB染色后，切片用自来水冲洗，并用苏木精复染。通过连接带有彩色监视器和图像采集软件的视频照像设备的Nikon(ECLIPSE-E1000)显微镜，从切片上胰岛素抗体着色程度测定B细胞质量。由B细胞占据的样品切面区和所有胰腺组织的样品切面区进行定量。B细胞质量测定和以下B细胞质量分析结果见图9。
胰岛B细胞质量分析胰岛细胞质量，特别是B细胞质量，是评估胰岛B细胞功能的重要指标。为了弄清GLP-1-Fc(Ex4-Fc或GLP-1A8G-Fc)受试鼠或Fc对照鼠以及空白对照鼠细胞质量的不同，我们对先前的方法进行了改进，A-，B-和D细胞依次用抗胰岛素、抗高血糖素和抗生长激素抑制素抗体(11,000；DAKO)和相关的荧光二抗(DAKO)染色。所有3次染色的胰岛细胞以及胰脏组织切片置于装有数码相机和ImagePlus软件(NIH)的荧光显微镜定量检测。通过测定切面3重染色的胰岛细胞面积除以总的组织切面面积和固定前的胰腺重量，得到每个胰腺的总的B细胞质量。同样，胰脏总的B细胞(或alpha细胞)是通过测定切面胰岛素阳性染色的B细胞(或A细胞)面积除以总的组织面积和固定前的胰腺重量。
B细胞增殖和凋亡是应用文献所述BrdU和Tunel染色技术。胰脏切片用抗胰岛素和抗BrdU鼠IgG抗体(Sigma)双重染色，或是Tunel染色(ApopTag试剂盒；Intergen)并用Nikon显微镜(x1000)观察。BrdU+或Tunel+阳性B细胞计数以得到BrdU+或Tunel+的数值/B细胞总数。由于淋巴因子诱导的B细胞破坏是伴随着细胞坏死，B细胞坏死是用DAPI/propidium iodide染色技术确定。
胰岛再生的检测是采用现有技术中常规使用的方法，即切片上总的胰岛数目(包括单个的B细胞或3-5个B细胞群)除以切片上总的胰岛素阳性细胞。
口服葡萄糖耐受实验是为了确定GLP-1-Fc治疗的胰岛素分泌和体内葡萄糖利用情况，实验方法采用以前发表的文献的方法。
胰岛素和高血糖素分泌实验将胰岛素分泌细胞系INS-1细胞以每孔2.5×105的密度在24孔细胞培养板培养。使用含10％FBS血清的RPMI 1640细胞培养液。次日，以无葡萄糖的新鲜KRB缓冲液培养2次每次30min。然后细胞分别接受加有0.5或20mM的葡萄糖及不同浓度的纯化的GLP-1 IgG融合蛋白的KRB缓冲液处理1hr。按照使用说明书用鼠胰岛素RIA试剂盒(Linco，St.Charles，MO)测量25 LKRB缓冲液中的胰岛素水平。
cAMP的测量将INS-1细胞以每孔62,500个细胞的密度在24孔细胞培养板培养。在次日的实验前，细胞在加有100 M IBMX的450mL的无血清SF-RPMI培养基内培养5h。而后细胞在加有提纯的Fc融合多肽(120nM)或Exendin-4(100nM)的SF-RPMI培养液培养10min后，加入1mL冰冻乙醇结束反应。提取物保持在-20℃条件下3h或过夜。然后将每200μL分装并冻干。冻干的样品重新溶于50μL醋酸钠缓冲液并用cAMP RIAs试剂盒检测(Biomedical Technologies)。
实验结果见图7。
核酸疫苗的应用肌肉注射和体内电转移的方法为现有技术常规使用的方法。核酸疫苗的应用包括组成药物复合物的3种核酸疫苗分别单独使用，或共同使用，以及与GLP-1-IgG-Fc(或其突变体或Ex4-IgG-Fc)同时联合使用。简言之，小鼠麻醉后在后腿肌注射总量50μg的DNA。注射后立即实施电转移。使用ECM830型电转移仪的卡钳式电极(Genetronics Inc)以200V/cm电压，对受试鼠涂以传导胶的皮肤表面实施8次电脉冲，每次持续时间20ms。3-4周后重复注射。核酸疫苗的应用结果见图11-16。
体外脾细胞刺激实验从核酸疫苗免疫的受试鼠得到的脾悬浮培养细胞经去除血红细胞后置于无血清AIM V培养液(Invitrogen)并添加0.05mM B巯基乙醇。将免疫抗原加入培养液使其终浓度为0.05mg/ml。同时合成了同样摩尔数的3份GAD65多肽，这3份多肽的序列分别是TYEIAPVFVLLEYVTLKKMREIIGWPGGSGD(amino acids206-236)；AALGIGTDSVILIKCDERGK(amino acids 290-309)和VPPSLRTLEDNEERMSRLSKVAPVIKARMMEYGTT(amino acids509-543).它们覆盖了T细胞识别的大多数抗原决定簇。牛胰岛素购自Sigma Chemicals，MO.用MTT法测定细胞增殖。简言之，免疫抗原刺激后72h将MTT溶液加入96孔细胞培养板，终浓度为1mg/ml。实验平行做4份样品。4h后，加入异丙醇终止反应并加入0.04 M HCl酸化。溶解的MTT反应产物在540nm比色。以抗原刺激细胞MTT减少量的光密度增加值与非抗原刺激的对照组的光密度值的比值来评估细胞增殖。
淋巴因子白介素分泌实验上述脾细胞以每孔5×105cell的密度培养在96孔细胞培养板。培养72h后，取细胞培养液并分装后冷冻保存，用以测定IL-10，IFN和TGF释放量。在每100μL培养液加入10μL1NHCl酸化处理活化后测定TGF1含量。用BD Biosciences公司ELISA试剂盒按操作手册规定的程序测定淋巴因子白介素水平。
不同淋巴细胞的分离和调节性T细胞实验用干细胞技术公司(Toronto，Canada)生产的鼠CD4+和CD8+淋巴细胞EasySep试剂盒将分离红血细胞后悬浮培养的脾细胞中的CD4+和CD8+细胞进行分离。该试剂盒是采用负磁性分拣技术。分拣后的细胞纯度经流式细胞仪证实为92-95％。用该公司所产鼠生物素选择EasySep试剂盒将CD4+细胞又进一步分为CD25+和CD25-两类。并用生物素标记的大鼠抗小鼠CD25抗体(BD Pharmingen)、抗小鼠B7.1抗体(BD Pharmingen)、抗人/小鼠LAP-TGF抗体以及兔抗大鼠/小鼠Nrp1抗体和生物素标记的羊抗兔IgG(BD Pharmingen)与上述正筛选试剂盒联用，将B7.1+，Nrp1+，or LAP-TGF.淋巴细胞由总CD4+淋巴细胞中分离。以上操作都依照试剂盒实验手册进行，分离后淋巴细胞纯度经由流式细胞仪测定。流式细胞仪分析实验如下所述，实验结果见图11-16。
流式细胞仪分析实验FITC-或PE-标记大鼠抗小鼠CD4，CD25，CD 86(B7.1)，CD152(CTLA-4)和IgG同系物购自BD Pharmingen公司。非标记的和生物素标记的大鼠抗人/小鼠LAP-TGF购自R&D Systems公司。兔抗鼠neuropilinl(Nrp1)多克隆IgG购自Oncogene公司。抗LAP-TGF以及鼠IgG同系物标记了Molecular Probes公司的Alexa Fluor 488染料。抗Anti-Nrp1IgG和兔正常IgG标记了Alexa Fluor 647染料。由于抗Nrp1抗体含有0.2％明胶，猪明胶也标记了Alexa Fluor 647染料并加到抗体同系物中，其最终浓度为0.2％以便校正标记的作为细胞外基质蛋白的明胶结合可能造成的误差。
核酸疫苗诱导免疫耐受性的实验为了确认GLP-1-Fc融合蛋白基因治疗方法对NOD自体免疫糖尿病的有效性，我们同时进行了核酸疫苗诱导免疫耐受性的实验，同时设立对照。使用了Ins-GAD核酸疫苗(pIns-GAD质粒)作为抗原。该疫苗特性已经了解得很清楚并在我们先前的疫苗接种实验中取得了鼓舞人心的结果。该疫苗编码I型糖尿病2种主要目标分子大部分的抗原决定簇，即前胰岛素原和GAD65。该疫苗将与第2个质粒同用，如pB7-1wa编码选择性的CTLA-4配体(B7-1分子的突变体B7-1wa)。基因转移如我们先前所进行的由体内电转移进行强化，基因电转移可以大大增加基因转移的效率并可能在人类和大型动物中应用，之前人类中使用基因转移技术较啮齿类动物中效率低的多。先前的实验我们已经观察到同时使用Ins-GAD/B7-1wa这2种核酸疫苗改善了新发糖尿病的NOD鼠葡萄糖的动态平衡，并获约32％的受试鼠完全的治愈率，对比只接受空质粒治疗的对照组只有＜5％的治愈率(p＜0.01)。多数受试鼠没有治愈是由于在治疗之前胰岛细胞受损程度太高，或是疫苗不完全诱导耐受性。在疫苗接种的同时施加GLP-1-Fc基因转移，目的在于确定胰岛细胞的再生是否可获治愈，并分析在已经出现糖尿病的受试鼠中是否能诱导调节性T-细胞的活性。实验结果见图11-16。
统计学分析所有数据都以平均值+标准差(mean±SEM)的形式表示。用SAS软件(Statistical Analysis Systems，Cary，NC)进行学生T检验和ANOVA”n-1”分析，以p＜0.05表示显著性差异。并应用SAS软件(StatisticalAnalysis Systems，Cary，NC)或是GraphPad Prism 3.0软件(GraphPadSoftware Inc.，San Diego，CA)。用Kaplan-Meier法对糖尿病影响范围作图，应用对数归类检验进行统计学比较。insulitis scores的显著性差异用Chi方检验。体外增殖实验各组之间差别以及淋巴因子释放实验用ANOVA分析确定，p＜0.05表示显著性差异。
以上列举对本专利的描述仅仅是一些实施举例说明。此将意识到，由于计算机系统或是由于提交本发明专利的方法引起的一些明显的误差包括笔误将很容易被行内专别。这些差异所寓本意也应属于本发明的描述和权利范围内。
权利要求
1.一种用于预防和治疗I型糖尿病的药物复合物，其特征在于，该药物复合物包括1)能够治疗I型糖尿病的多肽或含有该多肽的基因的表达质粒；2)包括分别与胰岛素原、GAD65和可以结合T细胞负调节蛋白CTLA-4的B7-1wa多肽具有至少50％同源性的多肽的核酸疫苗。
2.如权利要求1所述的药物复合物，其特征在于，所述能够治疗I型糖尿病的多肽为胰高血糖素类似肽GLP-1或与其具有50％以上同源性的同功因子与IgG-Fc的融合蛋白。
3.如权利要求2所述的药物复合物，其特征在于，所述IgG-Fc为鼠IgG-Fc或人IgG-Fc。
4.如权利要求2所述的药物复合物，其特征在于，所述融合蛋白为胰高血糖素类似肽GLP-1与IgG-Fc的融合蛋白，其中IgG-Fc为IgG1、IgG2或IgG3；或GLP-1的同功因子为蜥蜴唾液腺多肽extendin-4与IgG-Fc的融合蛋白，其中的IgG-Fc为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
5.如权利要求2所述的药物复合物，其特征在于，所述的融合蛋白的突变体GPL-1-A8G-IgG-Fc，其中GPL-1的氨基酸序列的第8位的丙氨酸被甘氨酸取代，并且IgG-Fc为IgG1、IgG2或IgG3。
6.权利要求1所述的药物复合物的给药途径，其特征在于，所述给药途径为口服、肌肉注射、静脉注射、经皮给药、经粘膜给药。
7.权利要求1所述的药物复合物的给药剂量，其特征在于，被给药的具有蛋白活性的药物复合物的量为0.05nmol～1nmol/kg体重，或有效cDNA的量为1μg-10μg/kg体重。
8.权利要求1所述的药物复合物用于制备治疗糖尿病的药物的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于预防和治疗I型糖尿病的药物复合物及其应用，该药物复合物包括1)能够治疗I型糖尿病的多肽；2)包括分别与胰岛素原、GAD65和可以结合T细胞负调节蛋白CTLA－4的B7－1wa多肽具有至少50％同源性的多肽的核酸疫苗。根据本发明的药物复合物可以有效地预防和治疗糖尿病。本发明的药物复合物能够促进B细胞再生和同时控制自体免疫过程，这样，可以完全免除有高度危险发生I型糖尿病患者的发病，或者完全治愈新近诊断为I型糖尿病的病人或是那些多年的Ⅰ型糖尿病人。
文档编号A61K48/00GK1935261SQ200610127238
公开日2007年3月28日 申请日期2006年9月14日 优先权日2005年9月14日
发明者王庆华, 黄晓航 申请人:王庆华, 黄晓航