10的⑶4+⑶8Vβ8. 1/8. 2+T细胞（图2C)，但是脾和胰腺中的Thl7细胞 消失（图2D)。相反，单独BM的糖尿病小鼠接受者仍患病并且产生IFNγ和/或IL-10的细 胞不增加或Thl7细胞减少（图2C-D)。而且，在Ig-GAD2+BM组的胰腺中，T-bet和R0Rγt 的mRNA相对于单独BM的动物接受者明显减少（图2E)，指示Thl和Thl7细胞二者在该位 点最少。因此，添加BM移植至Ig-GAD2方案持续从糖尿病恢复，而不影响免疫调节。
[0192] 卖施例4 :BM務棺与Ig_GAD2协同驱动健康腠岛的形成
[0193] 因为Ig-GAD2+BM而不是单独Ig-GAD2恢复血糖量正常，可能添加BM移植维持 细胞的再生，所述细胞能够在Ig_GAD2削减的最小炎症下兴旺。为了测试这些假 设，用Ig_GAD2+BM治疗展示持续恢复至血糖量正常的的小鼠与单独Ig-GAD2或BM的那些 接受者比较（图3A)，检查胰腺渗透和健康胰岛的形成的减少。Ig-GAD2+BM治疗的小鼠 接受者具有的胰岛大部分没有胰岛炎或胰岛具有胰岛周围炎形式的最小渗透（图3B-C)。 单独Ig-GAD2的小鼠接受者，其不能从糖尿病恢复，具有的胰岛没有胰岛周围炎，指示有 效的免疫调节。相反，单独BM的动物接受者具有非常严重的胰岛炎（图3B-C)。而且，尽 管用Ig-GAD2+BM治疗的小鼠具有结构化的具有丰富胰岛素阳性细胞的胰岛，而给予单独 Ig-GAD2或BM的那些具有较少的具有更少β-细胞的胰岛，如未治疗的、刚刚诊断糖尿病的 小鼠（图3D)。汇集结果指示Ig-GAD2+BM治疗的小鼠中产生胰岛素的β-细胞的数量、胰 岛的数量和β-细胞群明显增加，在单独Ig_GAD2或ΒΜ的动物接受者中不明显（图3E-G)。 因此，BM细胞协同Ig-GAD2驱动的免疫调节的富集，维持能够兴旺并且维持血糖量正常的 β-细胞的数量。
[0194] 卖施例5 :ΒΜ務棺和Ig_GAD2治疗的小鼠接夸者展示腠岛中增加的内皮细朐数量
[0195] 为了确定用Ig_GAD2+BMN0D-GFP治疗的小鼠中新的形成的β-细胞的起源， 小鼠用作ΒΜ的来源并且产生胰岛素的β-细胞评估治疗之后的GFP表达。结果显示在 Ig-GAD2+BM治疗期间在任何时间点没有GFP/胰岛素共定位（图9)。此外，无糖尿病的 小鼠中富含的GFP+细胞在具有相同方案但是仍糖尿病的那些接受者中最小（图9)。因 此，BM移植好像不用作产生胰岛素的β-细胞的来源但是在恢复小鼠的胰岛中产生GFP+ 细胞的移植。因此，BM移植好像不用作产生胰岛素的β-细胞的来源但是在恢复小鼠的 胰岛中产生GFP+细胞的移植。所以，β-细胞令人吃惊地不源自供体细胞，如在其他模 型中观察到的（Hess等，Nat.Biotechnol.，21:763-770 (2003);Mathews等，Diabetes， 53:91-98 (2004);Choi等，Diabetologia，105:16242-16247 (2003);Lechner等，Diabetes， 53:616-623(2004))〇
[0196] 接下来的问题是GFP+移植是否表示这样的细胞，其不能被宿主的BM提供但是 对于维持内源细胞是必要的。结果显不在糖尿病对健康小鼠中，循环的和膜岛内 PECAM1+EC的频率明显下降（图4)。的确，随着小鼠朝着明显糖尿病进展，外周血液EC的 频率明显下降（图4A-B)。类似地，随着小鼠变得是糖尿病胰岛中EC的频率下降，其是与 β-细胞丢失的现象（图4C-D)。这指示EC的频率在糖尿病小鼠的外周血液和胰腺二者中 都下降。
[0197] 有趣地，Ig_GAD2+BM的小鼠接受者而不是单独给予Ig-GAD2或ΒΜ的那些恢复胰岛 中的PECAM1+内皮细胞（EC)(图5A)。而且，当分析编码表示EC的功能标记物的VE-钙粘着 蛋白（Cdh5)、血管生成素受体（Tiel)和VEGF受体l(Fltl)的基因表达时，相对于未治疗的 糖尿病动物，在Ig_GAD2+BM的小鼠接受者中，这些基因有明显的mRNA增加（图5B)。给予 单独Ig-GAD2或BM的那些不显示基因表达的类似增加（图5B)。EC的增加可能促进血管生 成，用于胰岛形成血管和β-细胞的兴旺。事实上，在用Ig_GAD2+BM治疗的无糖尿病的小鼠 胰腺中存在编码血管生成因子，包括VEGFa(vegfa)、血管生成素l(angptl)和血管生成素 2(angpt2)的基因的强上调（图10A)。此外，新形成的β-细胞产生VEGFa(图10B)，其对于 内皮细胞的发展和胰岛形成血管是重要的（Brissova等，Diabetes，55:2974-2985 (2006); Lammert等，Curr.Biol. ,13:1070-1074 (2003))。Ig-GAD2+BM细胞移植小鼠中，β-细胞分 裂的平行恢复进一步证明了内皮和β细胞之间的共生关系（图5C)。的确，当与正常小鼠 的静息β-细胞或与未治疗的糖尿病小鼠中残留的β-细胞比较时，β-细胞显示对增殖 标记物ki-67的明显的染色（图5C)。这些结果提示用Ig-GAD2治疗期间的ΒΜ移植持续修 复内皮网络，导致β-细胞的有效再生。后者能够产生重要的血管生成因子VEGFa，以维持 共生关系和胰岛的健康。
[0198] 实施例6 :供体BM務棺产牛腠岛内皮细朐
[0199] 为了测试源自GFP+细胞的移植供体BM是否表示EC，我们检查了GFP+细胞表达内 皮标记物PECAM1和相对于产生胰岛素的β细胞的定位。结果显示，在无糖尿病的小鼠中， 在表达PECAM1的胰岛中有GFP+细胞，如通过在治疗的30和60天的两个标记物的共定位 所指示（图6A)。在仍糖尿病的相同方案的小鼠接受者中没有观察到这样的共定位。而且， GFP+PECAM1+细胞不与胰岛素染色共定位，指示BM移植在保护T1D期间产生EC。这些观察得 到当BM移植来自雄性供体时，在内皮细胞但不是β-细胞中的Y染色体的测所支持。的确， 当DNA提取自Ig-GAD2+BM小鼠接受者中大量胰腺细胞时，可检测到Υ染色体（图6Β)。更具 体而言，当PECAM1+和胰岛素+细胞使用激光捕获系统微切割并且通过PCR分析基因组DNA 时，在PECAM1+中检测到Y染色体但是胰岛素+细胞中没有，以及这限于给予Ig-GAD2+BM移 植的无糖尿病的小鼠（图6C-D)。这些结果指示供体BM产生从糖尿病恢复需要的EC。
[0200] 实施例7:内皮祖细朐替换BM務棺并目有助于Ig-GAD2逆转T1D
[0201] 为了测试供体EPC的移植与Ig_GAD2治疗一起是否产生能够有助于β细胞的生 存和发挥功能成熟的EC和恢复血糖量正常，从健康N0D-GFP小鼠的ΒΜ纯化EPC并且代替 全部的ΒΜ。注意，ΒΜ系阴性（Lin_)群体表达EPC标记物c-Kit并且糖尿病小鼠相对于年 龄相当的健康小鼠中FLK-1明显减少（图7A-B)。
[0202] 用Ig_GAD2治疗期间，来自健康供体的纯化的GFP+Lin-c-Kit+FLK-l+ (hFLK-Γ)细胞的移植，替换全部BM移植，使得大部分小鼠从疾病恢复，而给予 Lin_c-Kit+FLK-l_ (hFLK-1 _ )细胞的对照组，尽管接收60倍更高细胞数量，具有相当更 低的恢复速度（图7C)。另外，当hFLK-Γ细胞被移植而没有Ig-GAD2时，没有观察到从疾 病明显的恢复（图7C)。当FLK-Γ细胞源自患病N0D-GFP小鼠（sFLK-Ι+)时，疾病的恢复 最小（图7C)。此外，在这些小鼠的胰岛中，没有明显的GFP+细胞，其解释了PECAM1+细胞 中没有PECAM1+细胞的增加（比较图7D中的右图与左图）。事实上，在Ig-GAD2+FLK-1 _ 或FLK-Γ细胞而没有Ig-GAD2下，在未从糖尿病恢复的小鼠中观察到类似的结果（图7D)。 这些结果指示EPC可替换BM移植并且产生成熟的EC，其有助于β-细胞兴旺和恢复血糖量 正常。此外，仅仅当EPC源自健康的供体时出现EPC的成熟和EC的增加，其解释了糖尿病 小鼠不能使用它们自己的EPC修复胰腺内皮网络。
[0203] 实施例8 :治疗患1铟糖尿病的对象
[0204] 进行研究，以确定包括一定量的一个或多个干细胞和/或祖细胞和一定量的至少 一种抗原特异性疗法的组合物在患T1D的对象中的作用。例如，进行多中心、随机、双盲、安 慰剂-对照研究，以评估基于体重的或固定剂量的组合物在诊断患T1D的人对象中的治疗， 所述组合物包括一定量的一个或多个干细胞和/或祖细胞和一定量的至少一种抗原特异 性疗法。更具体而言，进行临床研究，以检查包括一定量的一个或多个干细胞和/或祖细胞 和一定量的至少一种抗原特异性疗法的组合物的效力和安全性。组合物有效治疗包括，预 防TlD〇
[0205] 除非另外指出，在本说明书和权利要求书中使用的表示成分、性质，比如分子量、 反应条件等的数量都已经解释为受术语"约"的修饰。因此，除非相反指出，在说明书和所附 权利要求书中阐释的数量参数是近似值，其可取决于本公开期望获得的期望特性而改变。 至少，并且不试图限制权利要求使用等同原则，每个数值参数应至少从报告的有效数字解 释并且施加普通的四舍五入技术。
[0206] 尽管阐释本公开宽范围的数值范围和参数是近似值，在具体实施例中阐释的数值 报告为尽可能精确的。但是，任何数值，固有地包含必定源自在它们各自测试测量出现的标 准偏差的某些误差。
[0207] 在描述本公开的背景下（尤其在下述权利要求的背景下）使用的术语"一个（a) "、 "一个（an) "、"所述（the) "和类似的指示物解释为覆盖单数和复数二者，除非本文另外指出 或明显与上下文相反。本文数值的范围的叙述仅仅旨在用作分别提及每个分开的值落在范 围内的速记方法。除非本文另外指出，每个单个值并入说明书，如同其在本文单独叙述。本 文所述的所有方法可以以任何适当的顺序进行，除非本文另外指出或否则明显与上下文相 悖。本文提供的任何和所有实施例，或示例性语言（例如，"比如"）的使用期望仅仅更好阐 释本公开并且不限制另外要求的本公开的范围。说明书的语言不应解释为指示对于实施本 公开必要的任何非要求的要素。
[0208] 本文公开的可选的要素或实施方式的分组不解释为限制性的。可单独提及或要求 每个组成员或与该组的其他成员或帮我出现的其他要素任意组合。预期，为了方便和/或 专利性，组中的一个或多个成员可包括在组中，或从组中删除。当任何这样的包括或删除发 生时，说明书视为包含这样修饰的组，因此满足在所附权利要求书中使用的马库什组的书 面描述。
[0209] 本公开的某些实施方式是本文所述的，包括发明人已知的进行本公开的最佳形 式。当然，在阅读前述说明书之后，这些描述的实施方式的变化对本领域技术人员显而易 见。发明人预期技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人期望本公开以本文具体所述 的其他方式实施。因此，本公开包括本文所附权利要求叙述主题的适用法律允许的所有修 饰和等同物。而且，在所有其可能变型中上述要素的任何组合包括在本公开中，除非本文另 外指出或以其他方式明确与上下文相悖。
[0210] 本文公开的【具体实施方式】使用由组……成或和基本上由……组成语言可进一步 限于权利要求中。当在权利要求中使用时，无论提交的或经修改添加的，过渡术语"由…… 组成"排除权利要求中未指出的任何要素、步骤或成分。过渡术语"基本上……由组成"将 权利要求的范围限于具体的材料或步骤和不实质上影响基本和新的特征（一种或多种）的 那些。如此要求的本公开的实施方式是本文内在或明确描述和可行的。
[0211] 应当理解，本文公开的实施方式是本公开原理的示意。可采用的其他修饰在本公 开的范围内。因此，作为例子，但是不是限制性的，可根据本文教导使用本公开可选的构造。 因此，本公开不限于精确显示和描述的。
[0212] 尽管通过参考具体的材料、程序和实施例本文已经描述和阐释了本公开，但是，应 理解，本公开不限于为该目的选择的材料和程序的具体组合。这些细节的许多变型可能是 暗示的，如本领域技术人员认识到。期望说明书和实施例仅仅解释为示例性的，本公开的真 是范围和精神由下述权利要求指示。本申请中提及的所有参考文献、专利和专利申请通过 引用以它们的整体并入本文。
[0213] 序列表
[0214]
【主权项】
1. 治疗或预防对象中糖尿病的方法，所述方法包括：向所述对象施用包括一定量的一 个或多个干细胞和/或祖细胞和一定量的至少一种抗原特异性疗法的组合物。2. 权利要求1所述的方法，其中所述糖尿病是1型糖尿病。3. 权利要求1所述的方法，其中所述对象是哺乳动物。4. 权利要求3所述的方法，其中所述哺乳动物是人。5. 权利要求1所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞是全能的、多能的、多功能的 或单能的。6. 权利要求1所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞分离自骨髓。7. 权利要求6所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞是纯化的骨髓内皮祖细胞。8. 权利要求1所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞是同种异体细胞。9. 权利要求1所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞是自体细胞。10. 权利要求1所述的方法，其中所述至少一种抗原特异性疗法是免疫球蛋白-多肽嵌 合体。11. 权利要求10所述的方法，其中所述免疫球蛋白-多肽嵌合体是可溶的。12. 权利要求10所述的方法，其中所述免疫球蛋白-多肽嵌合体是聚集的。13. 权利要求10所述的方法，其中所述免疫球蛋白-多肽嵌合体包括具有CDR3区域的 免疫球蛋白，和其中致糖尿病抗原决定部位插在CDR3区域中。14. 权利要求13所述的方法，其中所述致糖尿病抗原决定部位包括GAD2(SEQID N0:1)、GAD1(SEQIDNO:2)或INS0(SEQIDNO:3)。15. -种组合物，其包括一定量的一个或多个干细胞和/或祖细胞和一定量的至少一 种抗原特异性疗法。16. 权利要求15所述的组合物，其中所述干细胞和/或祖细胞是全能的、多能的、多功 能的或单能的。17. 权利要求15所述的组合物，其中所述干细胞和/或祖细胞分离自骨髓。18. 权利要求15所述的组合物，其中所述干细胞和/或祖细胞是纯化的骨髓内皮祖细 胞。19. 权利要求15所述的组合物，其中所述干细胞和/或祖细胞是同种异体细胞。20. 权利要求15所述的组合物，其中所述干细胞和/或祖细胞是自体细胞。21. 权利要求15所述的组合物，其中所述至少一种抗原特异性疗法是免疫球蛋白-多 肽嵌合体。22. 权利要求21所述的组合物，其中所述免疫球蛋白-多肽嵌合体是可溶的。23. 权利要求21所述的组合物，其中所述免疫球蛋白-多肽嵌合体是聚集的。24. 权利要求21所述的组合物，其中所述免疫球蛋白-多肽嵌合体包括具有CDR3区域 的免疫球蛋白，和其中致糖尿病抗原决定部位插在CDR3区域中。25. 权利要求24所述的组合物，其中所述致糖尿病抗原决定部位包括GAD2(SEQID N0:1)、GAD1(SEQIDNO:2)或INS0(SEQIDNO:3)。26. 治疗或预防对象中糖尿病的方法，所述方法包括：向所述对象施用组合物，其包括 一定量的纯化骨髓内皮祖细胞和免疫球蛋白Ig_GAD2。27. 治疗或预防对象中糖尿病的方法，所述方法包括：向对象施用组合物，其包括一定 量的一个或多个干细胞和/或祖细胞。28. 权利要求27所述的方法，其中所述祖细胞包括一定量的纯化骨髓内皮祖细胞。29. 权利要求27或28所述的方法，其中所述干细胞和/或祖细胞直接递送至所述对象 的胰腺。
【专利摘要】本公开一般涉及治疗或预防糖尿病的方法和组合物，其是通过向对象施用包括一定量的干细胞和/或祖细胞和至少一种抗原特异性疗法的组合物。
【IPC分类】C12N5/16, A61K38/00, C12N5/07
【公开号】CN105358678
【申请号】CN201480022386
【发明人】H·扎奥阿尼
【申请人】密苏里大学董事会
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2014年3月10日
【公告号】CA2904586A1, EP2964750A1, US20160015811, WO2014138725A1