受限的发育潜能。
[0052] 在一个实施方式中，干细胞和/或祖细胞是全能的、多能的、多功能的或单能的。 如本文所使用，术语"全能"意思是具有无限能力产生身体的任何细胞类型和所有胚胎外细 胞类型。如本文所使用，术语"多能"意思是具有无限能力产生身体的任何细胞。如本文所 使用，术语"多能"意思是具有无限能力产生大于一种，但不是身体的所有的细胞类型。如 本文所使用，"单能"意思是具有产生仅仅一种细胞类型的能力。
[0053] 如本文所使用，提及细胞，术语"分离的"指在与该细胞天然存在的环境（例如细 胞天然存在于生物体中的情况）不同的环境中的细胞和从其天然环境移除的细胞。干细胞 可从胚胎、胎儿、出生后、幼年或成人组织中分离。也可通过形成体细胞的细胞和通过技术 人员已知的任何方式和方法（例如，病毒方法、RNA方法、蛋白质方法、miRNA方法、化学介导 的再编程方法）诱导成干细胞样状态而分离干细胞。祖细胞通常出现在出生后动物中，位 于需要细胞修复或替换的组织和器官中（例如肌肉中出现的卫星细胞、脑区域中出现的神 经祖细胞、骨髓中出现的内皮祖细胞）。
[0054] 在一个实施方式中，干细胞和/或祖细胞分离自骨髓（BM)。BM样品可通常获得自 对象的髂嵴、股骨、胫骨、脊椎、肋骨或其他脊髓空间。可容易使用本领域已知的方法分离骨 髓细胞。例如，可通过骨髓抽吸分离骨髓细胞。美国专利号4, 481，946描述了骨髓抽吸方 法和装置，其中可通过在期望移除的位点插入一对抽吸针实现从供体有效的回收骨髓。通 过连接一对注射器，可调节压力，以通过一个抽吸针选择性移除骨髓和正弦血液，同时通过 另一抽吸针积极迫使静脉内溶液替换从位点移除的骨髓。骨髓和正弦血液可吸入腔用于和 另一静脉内溶液混合并且其后迫使进入收集袋。
[0055] 美国专利号4, 486, 188描述了骨髓抽吸的方法和装置，其中一系列线从腔部分引 导至静脉内溶液来源。抽吸针、静脉内溶液的第二来源和适当的分离或收集来源。腔部分 能够同时施加负压至从静脉内溶液源引导的溶液线，以便准备好它们并且清除它们的任何 空气。然后闭合溶液线并且施加正压，以重新引导静脉内溶液进入供体，同时施加负压，以 将骨髓材料吸收至腔，用于和静脉内溶液混合，其后施加正压以将静脉内溶液和骨髓材料 的混合物转移至分离或收集源。
[0056] 在另一实施方式中，干细胞和/或祖细胞分离自外周血液。收集外周血液的方法 是本领域已知的，并且任何已知的方法可用于收集外周血液。
[0057] 在一个实施方式中，干细胞和/或祖细胞是纯化的骨髓内皮祖细胞。通过使用 系细胞消耗试剂盒，消耗系 +(Lin+)细胞的骨髓（BM)或外周血液纯化内皮祖细胞（EPC)。 用抗c-Kit、抗FLK-1或EPC的本领域技术人员已知的任何其他标记物，比如⑶34使 Lin细胞染色。也用7-氨基-放线菌素D(7-AAD)标记细胞，以区分活细胞和死细胞。 c-Kit+7-AADFlk-Γ群体表示纯化的活EPC。可通过本领域已知的任何方法进行细胞分选， 以分选细胞。优选的分选程序是通过荧光激活细胞分选（FACS)。内皮祖细胞的磁珠细胞 分选（MACS)是优选的。Miltenyi等，Cytometry. 11:231-238(1990)描述了常规的MACS程 序。尤其优选的分选程序是无标签分选方法。可使用本领域技术人员熟知的技术分离和纯 化EPC。
[0058] 可体外扩展本文提供的干细胞和/或祖细胞一段时间，然后使用本领域已知的细 胞培养方案施用至个体。用于体外生长和扩展EPC的方法可以是，例如，比如Eggermann等， Cardiovascular Research. 58:478-486 (2003)描述的那些。在一些方法中，细胞可使用本 领域已知的分化方案体外分化成内皮系的细胞。用于扩展和将干细胞分化成内皮细胞的方 法可以是，例如，比如Li等，Stem Cells and Development. 20:1701-1710(2011)描述的那 止匕 -、〇
[0059] 在一个实施方式中，干细胞和/或祖细胞是同种异体细胞。如本文所使用，术语 "同种异体"表示细胞获得自如对象接收细胞相同物种的遗传上不同的供体。同种异体细胞 可由与对象不相关的来源捐献，但是优选地是非常亲近的亲属，最优选地对象的家庭成员， 比如对象的父母或兄弟姊妹。
[0060] 在一个实施方式中，干细胞和/或祖细胞是自体细胞。如本文所使用，术语"自体" 表示细胞获得自需要治疗和/或预防糖尿病的同一对象。自体细胞的使用可提供某些优 势，包括不需要免疫抑制剂和/或避免从另一个体意外传播致病因子。
[0061] 在一个实施方式中，当收获和/或体外扩展细胞时，通过简单离心浓缩细胞。细胞 可进一步冲洗和再悬浮在最终临床上使用的溶液，比如生理盐水，缓冲的生理盐水或，可选 地，再悬浮在冷冻介质比如介质加二甲亚砜，或任何其他适当的冷冻保护剂，并且冷冻用于 储存。
[0062] 本公开也提供了基因修饰的干细胞和/或祖细胞。在一些实施方式中，干细胞和 /或祖细胞是用下述基因修饰的：1)外源VEGF核酸；2)外源ANG-2核酸；3)外源VCAM核 酸；4)外源HGF核酸；5)外源CADHERIN核酸；或6)上面提到的核酸的任何组合。术语"基 因修饰"指细胞中引入外源核酸序列之后，诱导的永久性或瞬时基因改变。"外源核酸序列" 是通常或天然不出现在和/或天然细胞产生的序列。在一些实施方式中，细胞是体外基因 修饰。将核酸引入细胞的方法是本领域已知的，并且任何已知的方法可用于将核酸引入细 胞。适当的方法包括，例如感染、脂质转染、电穿孔、微注射、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导 的转染、脂质体介导的转染等。
[0063] 本公开也考虑有或没有干细胞和/或祖细胞的抗原特异性疗法。
[0064] 在任何上述方法或组合物的实施方式中，至少一种抗原特异性疗法是免疫球蛋 白-多肽嵌合体。
[0065] 如本文所使用，术语"抗原特异性疗法"涉及其中免疫球蛋白（Igs)用于递送用于 抑制病理学免疫应答的自体肽和改变的自体肽的治疗。基因修饰以表达疾病特异性肽的Ig在本文称为"免疫球蛋白-多肽嵌合体"或"Ig_嵌合体"。对应疾病特异性T细胞或B 细胞抗原决定部位的肽可被基因修饰成Ig，以使得下调病原性免疫应答和治疗自身免疫性 疾病，如T1D。递送Ig-嵌合体相对于游离肽明显增加对T细胞的呈递（Legge等，J.Exp. Med. 191:2039-2051(2011);Zaghouani等，Science. 259:224-227(1993)) 〇
[0066] 在本公开的仍另一实施方式中，免疫球蛋白或其上的部分可以是人的或人源化 的，比如，例如，人IgG，比如IgGl、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3 和 / 或IgG4。
[0067] 在一些实施方式中，肽插入免疫球蛋白或其部分的可变区，并且免疫球蛋白或其 部分，包括人IgG或人源化的IgG。
[0068] 在仍另一实施方式中，肽插入免疫球蛋白或其部分的至少一个可变区，包括互补 决定区（⑶R)⑶R1XDR2和/或⑶R3区域。说明性地，通过缺失D区段和插入肽，将肽插在 免疫球蛋白或其部分的CDR3 区域中。（Legge等，J.Exp.Med. ,191:2039-2052 (2000);Legge 等，J.Exp.Med.，196:217-227 (2002);Gregg等，J.Immunol.，173:7308-7316 (2004);Gregg 等，J.Immunol. ,174:662-670(2005))。技术人员可容易制备大规模转染瘤并且通过柱分离 纯化Ig-嵌合体。（Jain等，J.Exp.Med.，205:207-218 (2008))。
[0069] 在一个实施方式中，用于下调致糖尿病T细胞的抗原特异性疗法包括与蛋白质片 段或肽连接的免疫球蛋白或其部分。在仍另一实施方式中，免疫球蛋白，或其部分，可结合 或能够结合Fc受体。
[0070] 在本公开的实施方式，免疫球蛋白-多肽嵌合体包括具有CDR3区域的免疫球蛋 白，和其中肽插在CDR3区域中。
[0071] 在一个实施方式中，肽包括致糖尿病T细胞抗原决定部位。在另一实施方式中，肽 包括后期抗原决定部位，其是在糖尿病晚期检测到的抗原决定部位。在其他实施方式中，肽 源自GAD65。在其他实施方式中，肽源自胰岛素。在其他实施方式中，肽源自IA-2。在其他 实施方式中，肽源自ZnT8。在仍其他实施方式中，肽源自IGRP。
[0072] 在一个实施方式中，致糖尿病抗原决定部位包括GAD2(SEQIDΝ0:1)。
[0073] 在一个实施方式中，致糖尿病抗原决定部位包括GAD1(SEQIDNO:2)。
[0074] 在一个实施方式中，致糖尿病抗原决定部位包括INSβ(SEQIDNO: 3)。
[0075] 在一些实施方式中，免疫球蛋白是可溶的，例如，可溶的Ig_GAD2、可溶的Ig-GADl 或可溶的Ig-INSi3。
[0076]在本公开的仍另一实施方式中，免疫球蛋白-多肽嵌合体是聚集的。嵌合体可通 过用50%-饱和（順 4)2304沉淀而聚集，如先前在Chase等，MethodsinImmunologyand Immunochemistry. 2 :249 - 341 (1968)中描述或使用本领域技术人员已知的其他技术。 [0077]治疗方法
[0078] 本公开也考虑治疗或预防对象中糖尿病的方法，包括向对象施用包括一定量的一 个或多个干细胞和/或祖细胞和一定量的至少一种抗原特异性疗法的组合物。
[0079] 在一个实施方式中，细胞被浓缩或稀释至适当的密度，其可以与施用细胞的细胞 密度相同或不同。细胞可用药学上可接受载体浓缩或稀释。如本文所使用，术语"药学上 可接受的载体"指稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介，利用其施用本公开的干细胞和/或祖细胞 并且其被联邦或州政府批准或列在美国药典或其他用于动物，和更尤其人的一般认可的药 典中。主要的药学载体可以是液体，比如水和油，包括下述那些：石油、动物、蔬菜或合成来 源的，比如花生油、大豆油、矿物质油、芝麻油等。药学载体可以是生理盐水、金合欢树胶、明 胶、淀粉糊剂、滑石、角质、胶体二氧化硅、尿素等。当施用至患者时，干细胞和/或祖细胞和 药学上可接受的载体可以是无菌的。当干细胞和/或祖细胞静脉内施用时，水是有用的载 体。生理盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可用作液体载体，尤其用于可注射的溶液。适 当的药学载体也包括赋形剂比如葡萄糖、乳糖、蔗糖、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙烯、 乙二醇、水、乙醇等。本组合物，如果需要，也可包含小量的湿润或乳化剂，或pH缓冲剂。本 组合物有利地可采用溶液、乳液、持续释放的制剂形式，或适于使用的任何其他形式。选择 适当的载体本领域普通技术人员的范围内。
[0080] 在一个实施方式中，细胞被浓缩的密度为约1，000至约200, 000个细胞/微升。在 一个实施方式中，使用的密度是约5, 000至约50, 000个细胞/微升。在另一实施方式中， 使用的密度是约10, 〇〇〇至30, 000个细胞/微升。
[0081] 一般而言，包括干细胞和/或祖细胞的组合物可施用的每个剂量的范围为 10.sup. 5-10.sup. 8细胞每kg体重，优选地范围是10.sup. 6-10.sup. 7细胞每kg体重。细 胞剂量取决于比如注射位点、施用途径、疾病状态，对于有益作用必须的最小剂量，和考虑 的毒副作用的因素。技术人员根据患者的具体情况，可容易确定优选的施用方案。
[0082]其中悬浮干细胞和/或祖细胞用于递送至治疗区域的溶液（例如，药学上可接受 的载体）的体积本文可称为注射体积。注射体积取决于许多因素，包括注射位点、施用细胞 的数量和疾病的状态。更具体而言，注射体积的下限可由高细胞密度的黏性悬液的实际液 体处理以及细胞聚簇的趋势确定。注射体积的上限可通过注射体积展示的必须避免宿主组 织损伤的压缩力的限制，以及实际的外科手术时间确定。
[0083]在一个实施方式中，包括大量的干细胞和/或祖细胞的组合物可根据已知的方法 施用至对象，比如静脉内给药，例如，作为药丸或通过在一段时间内通过肌内、腹膜内、脑脊 髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入路径持续注入。静脉内、腹膜内或皮下 施用细胞是优选的，静脉内或腹膜内路径是尤其优选的。可通过注射至门静脉施用干细胞 和/或祖细胞；但是，本领域熟知的可使用其他细胞施用方案。
[0084]在一个实施方式中，本发明干细胞和/或祖细胞的组合物配制为可注射的制剂并 且包括，例如，适于静脉内递送的活性成分的水溶液或悬液。当制备用于注射，尤其用于静 脉内递送的组合物时，可存在连续相，其包括张力调节剂的水溶液，缓冲至pH小于约7,或 小于约6,例如约2至约7,约3至约6或约3至约5。张力调节剂可包括，例如，氯化钠、葡 萄糖、甘露醇、海藻糖、甘油、或其他药物制剂，其使得制剂的渗透压力与血液等渗。可选地， 当大量的张度修饰剂用于制剂时，其可被稀释然后与药学上可接受的稀释剂一起注射以使 得混合物与血液等渗。
[0085] 在另一实施方式中，通过静脉内（IV)注入或动脉内施用在期望的时间段内（例 如，弹丸注射 5min、15min、30min、lhr、2hr、3hr、6hr、24hr、48hr、72hr或 96 小时注入）施用 本发明的组合物。在本发明的一个实施方式中，施用的时间段不大于约3小时。
[0086] 在一个实施方式中，用同种异体细胞移植的本公开的治疗涉及施用包括一个或多 个免疫抑制剂的组合物以控制干细胞和/或祖细胞的排斥。优选的免疫抑制剂包括但不限 于强的松、甲基去氢氢化可的松、硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢素、巴利昔单抗、他克莫司、吗替 麦考酚酯或西罗莫司。用于这样的免疫抑制剂的制剂和给药方案可使用根据制造商的说明 或从业者凭经验确定。
[0087] 在本发明的一个实施方式中，细胞施用一次。在另一实施方式中，每天（或每天1 至5次）、每周或每月施用细胞。说明性地，每周施用细胞三周，并且这样的施用实现，例如， T1D的抑制。但是，其他施用方案是本文可操作的。优选的施用方案取决于治疗的具体对 象、疾病状态、施用的干细胞和/或祖细胞的类型，和熟练的从业者熟知的其他因素。
[0088] 在任何上述的方法的一些实施方式中，施用包括大量的干细胞和/或祖细胞的组 合物施用一次。在任何上述方法的一些实施方式中，施用初始剂量的包括大量的干细胞和 /或祖细胞的组合物，接着施用一个或多个随后剂量。可用于本公开方法的给药方案的例 子（例如，第一次给药和一个或多个随后给药之间的间隔）包括约每周一次至约每12个月 一次的间隔，约每两周一次至约每6个月一次的间隔，约每个月一次至约每6个月一次的间 隔，约每个月一次至约每3个月一次的间隔，或约每3个月一次至约每6个月一次的间隔。 在一些实施方式中，每月、每两个月、每三个月、每四个月、每五个月、每六个月或T1D复发 时施用。
[0089] 本发明也涉及治疗或预防T1D的治疗性方法，其中用抗原特异性疗法的治疗是明 示的。
[0090] 在本公开的一种实施方式中，每天（或每天1至5次）、每周或每月施用抗原特异 性疗法。说明性地，一周施用组合物三次持续五周并且然后每周一次，持续另外的五周，并 且这样的施用实现了例如T1D的抑制。
[0091] 可施用的剂量和给药方案提供最佳期望的响应（例如，治疗响应）。抗原特异性疗 法的剂量可测量为单位mg/kg患者体重。可选地，抗原特异性疗法的剂量测量为单位mg/kg 患者瘦体重（例如，体重减去身体脂肪含量）、单位mg/m2的患者身体表面积，或单位mg/施 用至患者的剂量（例如，固定剂量）。剂量的任何测量可结合本发明的组合物和方法使用并 且剂量单位可通过本领域标准转换。
[0092] 方法包括施用本发明的抗原特异性疗法至需要其的对象。在一个实施方式中， 预防、缓解或减轻T1D的给药方案对应一天一次或一天两次剂量，并且可包括，例如，约 0·0001mg/kg、约 0·0005mg/kg、约 0· 001mg/kg、约 0· 01mg/kg、约 0· 05mg/kg、约 0·lmg