化合固体剂型比如片剂和胶囊中使用的那些载体配制。例 如，胶囊可设计为在胃肠道点释放制剂的活性部分，当生物利用度最大和循环前降解最小 化时。可包括另外的试剂，以利于选择性粘合剂的吸收。也可采用稀释剂、风味剂、低熔点 蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
[0150] 另一的制剂可涉及在与适于制造片剂的无毒赋形剂的混合物中有效量的干细胞 和/或祖细胞和其抗原特异性疗法。通过将片剂溶解在无菌水，或另一适当的媒介中，溶液 可制备为单位剂量形式。适当的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂，比如碳酸钙、碳酸钠或碳 酸氢钠、乳糖或磷酸钙；或粘合剂，比如淀粉、明胶或阿拉伯胶；或润滑试剂比如硬脂酸镁、 硬脂酸或滑石。
[0151] 可根据本公开和制剂技术的公知常识确定适当的和/或优选的药物制剂，这取决 于期望的施用路径、递送形式和期望的剂量。无论施用的方式，可根据患者体重、身体表面 积，或器官尺寸计算有效剂量。用于确定与本文所述的每个制剂相关的治疗的适当的剂量 的进一步优化的计算在本领域常规进行并且在本领域常规进行的工作范围内。适当的剂量 可通过使用适当的剂量响应数据确定。
[0152] 药学组合物可结合其他活性试剂（例如，干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗 法之外的）包括干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法。可选地，药学组合物可结合其 他药学组合物，包括，例如，包括一个或多个活性试剂（例如，干细胞和/或祖细胞和其抗原 特异性疗法之外的）的药学组合物，包括干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法。这样 的组合是用于它们期望目的的那些。是本发明一部分的组合可以是干细胞和/或祖细胞和 抗原特异性疗法，比如例如本文所述的那些，和至少一种另外的试剂。可用于下面阐释的组 合的活性试剂的例子是该目的示意性的并且不旨在是限制性的。如果组合使得形成的组合 物可执行其期望的功能，组合也可包括大于一种另外的试剂，（例如，两种或三种另外的试 剂）。
[0153] 本公开进一步考虑包括一个或多个其他活性试剂的另外药学组合物可分别从干 细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法施用（例如，同时治疗方案，对象接收同时治疗），并 且这样分开的施用可同时或不同时进行，比如例如同一天或不同一天，或同一天的不同时 间。其他药学组合物和/或活性试剂的施用可根据本领域已知的标准医学实践，或当结合 施用干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法时，施用可被修饰（例如，剂量之间更长的间 隔、更小的剂量水平、延迟开始），比如本文公开的。
[0154] 在一些实施方式中，活性试剂可包括抗微生物试剂包括，例如，抗生素比如青霉素 (例如，青霉素、阿莫西林、苄青霉素、氨苄西林、沃格孟汀）、聚酮抗生素（例如，大环内酯 类、阿奇霉素、红霉素、克拉霉素）、头孢菌素（例如，头孢羟氨、头孢克肟、头孢氨苄）、林可 酰胺（例如，克林霉素）、喹诺酮（例如，环丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星）、叶酸合成抑制 剂（例如，二氢叶酸还原酶抑制剂、甲氧苄氨嘧啶、氨苯砜、复方新诺明）、四环素（例如，四 环素、米诺环素、强力霉素、去甲金霉素、土霉素）、利福霉素（例如，利福平、利福布汀、利福 喷丁）、磺酰胺（例如，磺胺甲基异唑、磺胺醋酰）、氨基糖苷类（例如，新霉素、阿米卡星、妥 布霉素）、梭链孢酸、多肽抗生素（例如，杆菌肽、多粘菌素B)、脂肽抗生素（例如，达托霉 素）、氯霉素和莫匹罗星。
[0155] 进一步考虑根据本公开施用至对象的干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法 可结合（例如，同时）至少一种另外药学组合物（例如，包括活性试剂），比如例如任何上 述活性试剂治疗施用。在一个实施方式中，保持用至少一种活性试剂的治疗。在另一实施 方式中，在治疗（例如，用在恒定给药方案中保持的干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗 法）过程期间，减少（例如，逐渐减少）或中断（例如，当对象稳定时）用至少一种活性试剂 的治疗。在另一实施方式中，减少（例如，逐渐减少）或中断（例如，当对象稳定时）用至 少一种活性试剂的治疗，并且减少（例如，更低的剂量、较不频繁的给药、更短的治疗方案） 用干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法的治疗。在另一实施方式中，减少（例如，逐渐 减少）或中断（例如，当对象稳定时）用至少一种活性试剂的治疗，并且增加（例如，更高 的剂量、更频繁的给药、更长的治疗方案）用干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法的治 疗。在仍另一实施方式中，保持用至少一种活性试剂的治疗并且减少或中断（例如，更低的 剂量、较不频繁的给药、更短的治疗方案）用干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法的治 疗。在仍另一实施方式中，减少或中断（例如，更低的剂量、较不频繁的给药、更短的治疗方 案）用至少一种活性试剂的治疗和用干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法的治疗。
[0156] 在一些实施方式中，减少用至少一种活性试剂（例如，干细胞和/或祖细胞和其抗 原特异性疗法之外的）的治疗是减少治疗过程期间施用的活性试剂的积累量。在一些实施 方式中，减少用至少一种活性试剂（例如，干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法之外 的）的治疗是减少施用的活性试剂的实际剂量。在一些实施方式中，减少用至少一种活性 试剂的治疗提供全身性免疫抑制的减少。
[0157] 本公开中使用的药学组合物可包括治疗有效量的或预防性有效量的干细胞和/ 或祖细胞和其抗原特异性疗法。治疗有效量指以必要的剂量和时间段，有效实现期望的治 疗性结果的量。治疗有效量的干细胞和/或祖细胞和抗原特异性疗法可根据下述因素变 化，比如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体或抗体部分引起个体期望响应的能 力。治疗有效量也是其中干细胞和/或祖细胞和抗原特异性疗法的任何有毒或有害作用超 过治疗有益作用的量。预防性有效量指以必要的剂量和时间段有效实现期望的预防性结果 的量。
[0158] 包括干细胞和/或祖细胞和其抗原特异性疗法的药学组合物的治疗或预防性有 效量取决于例如治疗目的，比如组合物使用的症状、施用的路径，和对象的病况。以治疗或 预防性有效量施用药学组合物，以治疗或预防糖尿病。
[0159] 不需进一步描述，相信本领域普通技术人员可，使用前述说明书和下述示意性实 施例，利用和使用本公开的试剂和实施要求的方法。提供下述工作实施例，以利于本公开的 实施，并且决不解释为限制本公开的其他部分。 实施例
[0160] 通过下述实施例进一步阐释本发明，其决不应解释为限制性的。下面描述如在下 述实验实施例中使用的材料和方法。
[0161] 实施例1 :材料和方法
[0162] 下述材料和方法用于下面提供的实施例中。显而易见，适当的这些材料和方法可 替换其他已知材料和方法以实现相同期望的目的和/或结果。
[0163] 动物模型
[0164]N0D和N0D-GFP(在β-肌动蛋白启动子下表达绿色荧光蛋白质）小鼠先前描述在 Wallet等，Proc.Natl.AcacLSci. 106:24810-4815(2009)中。所有的小鼠在实验期间保持 在动物设施中并且对这些动物进行的实验程序根据动物关爱与使用委员会的指导进行。
[0165] 糖尿病的评估
[0166] 每周从尾静脉对小鼠取血并且血液样品用于评估葡萄糖含量和抗胰岛素抗体。 为了测量葡萄糖，血滴直接放置在测试条上并且使用Accu-Chek高级监测系统（Roche Diagnostic，Indianapolis，IN)读取葡萄糖含量。为了检测抗胰岛素抗体，使血液在室温 下凝聚1小时并且分离血清并且用于ELISA。开始在10周龄开始血糖水平（BGL)监测。当 血糖连续两周高于300mg/dL时，认为小鼠是糖尿病的。
[0167] 肽和Ig_嵌合体
[0168] 所有的肽通过HPLC纯化>90%纯度。GAD2肽（SEQIDN0:1)对应谷氨酸脱羧 酶-65(640)的氨基酸残基206-220。通过将6402肽序列插入9认31 86213，1〇^重链可变 区的⑶R3区域的可变区产生Ig-GAD2嵌合体。融合重链基因然后与亲本κ轻链基因一起 转染，用于作为完整的自Ig分子表达（Legge等，J.Exp.Med.，191:2039-2052(2000);Legge 等，J.Exp.Med.，196:217-227 (2002);Gregg等，J.Immunol.，173:7308-7316 (2004);Gregg 等，J.Immunol. ,174:662-670 (2005))。在DME培养基上进行转染瘤细胞的大规模培养并且 用琼脂糖珠纯化（Jain等，J.Exp.Med. ,205:207-218(2008)。源自GAD或人胰岛素蛋白质 (α和β链）的其他肽在本发明的范围内。
[0169] 用Ig-GAD2和供体ΒΜ或供体EPC治疗
[0170] 确定是糖尿病的小鼠首先给予2个持续释放胰岛素移植物（LinShin，Toronto， Ontario,Canada)，插入腹部皮下，以临时维持血糖量正常2-3周。然后，给予小鼠300μg Ig-GAD2腹膜内（i.p.)每周3次，5周并且然后一周一次，另外5周。从健康的（无糖尿病）NOD小鼠的股骨和胫骨分离供体BM细胞并且在诊断后第2、3和4周，每周静脉内（i.v.) 转移ΙΟχΙΟ6个细胞。监测小鼠的BGL，直到第120天。相同的治疗方案给予用内皮祖细胞 (EPC)治疗的小鼠，不同之处是FLK-1+EPC给予5xl04个细胞每次注射，而FLK-1EPC给予 3xl06个细胞每次注射。为了分离EPC，从健康的或糖尿病小鼠收获BM并且使用系细胞消 耗试剂盒根据制造商的指导（MitenyiBiotec)分离Lin细胞。用抗c-Kit、抗FLK-1和 7-AAD使Lin细胞染色并且适当分选。
[0171] 流式细胞术分析
[0172] 使样品染色，用于检测细胞表面标记物PECAM1 (PE-cy7_缀合的抗PECAM1 ; eBiosciences)、FLK-1 (APC-缀合的抗FLK1 ;eBiosciences)，c_Kit(PE_cy7_ 缀合的抗 c-Kit;BDBiosciences)和CD45(APC-缀合的抗CD45;BDBiosciences)。为了探测凋亡 细胞，用7-AAD(EMDBiosciences)使细胞染色。为了探测⑶4+T细胞中的细胞内IFNy、 IL-10和IL-17,在存在布雷非德菌素A(10yg/mL)的情况下，用PMA(50ng/mL)和离子霉素 (500ng/mL)刺激细胞4小时，并且然后用多甲藻素-叶绿体-蛋白质（PerCP) -cy5. 5-缀合 的抗CD4、PE-缀合的抗Vβ8. 1/8. 2和FITC-缀合的抗CD8抗体（BDBiosciences)染色。
[0173] 对于细胞内标记物，细胞随后用2%甲醛固定，用0.2%皂苷通透化并且用 PE-cy7-缀合的抗IFNγ、APC-缀合的抗IL-10或APC-缀合的抗IL-17抗体（eBiosciences) 染色。使用BeckmanCoulterCyAnADP读取样品并且使用SummitV4. 3 (Dako)分析数据。 使用BeckmanCoulterMoFloXDP分选器进行细胞分选（>98%纯度）。
[0174] 用于组织学分析的组织样品制剂。
[0175] 胰腺冷冻在组织冷冻介质（TriangleBiomedicalSciences)和非连续8_μm后 切片分开切割150-μπι。在组织学程序之前，切片固定在4%甲醛中10分钟。为了见组织 中的eGFP表达，胰腺在4°C下固定在4 %甲醛中4小时并且浸入30 %蔗糖中过夜然后冷冻。 然后进行H&E染色，以分析胰岛炎。
[0176] 免疫组织化学
[0177] 为了检测β-细胞，胰腺切片与HRP-缀合的抗胰岛素亲和体分子（Abeam) -起温 育并且通过温育玻片与DAB色原和底物（ScyTek) 5分钟鉴定胰岛素+细胞。用苏木精对细 胞核复染色。
[0178] 免疫荧光
[0179] 用包含1%BSA、10%山羊或驴血清，和(λ2%TritonX-100的PBS溶液处理胰腺 切片。然后，切片在4°C下在一抗（兔子抗胰岛素（SantaCruz)、荷兰猪抗胰岛素（Abeam)、 兔子抗PECAM1(SantaCruz)、兔子抗Ki67 (Abeam)、山羊抗VEGF(SantaCruz)温育过夜。 用PBS中的TritonX-100冲洗玻片三次，并且然后在室温下用相应的二抗（Texasred-缀 合的山羊抗兔子IgG、FITC-缀合的山羊抗荷兰猪IgG、FITC-缀合的驴抗山羊IgG;Santa Cruz);DyLight405-缀合的驴抗兔子IgG或DyLight549-缀合的驴抗山羊IgG(Jackson ImmunoResearch)染色1小时。在一些实验中，用DAPI(SantaCruz)对细胞核复染色。
[0180] 激光捕获显微切割
[0181] 胰腺切片为胰岛素或PECAM1染色并且用Arcturus脱水组分充分脱水。用CapSure HSLCMcaps和Autopix100激光捕获显微切割系统根据制造商的指导切割胰岛素+或 PECAM1+细胞。对于每个个体小鼠，从3-10个非连续切片切割细胞。使用PicoPureDNA提 取试剂盒（AppliedBiosystems)从切割细胞提取基因组DNA。
[0182] 通过PCR检测Y染色体。
[0183] 使用 20ngDNA模板和MaximaqPCRmastermix(Fermentas)进行检测Y染色体 和β-肌动蛋白。
[0184] 定量PCR分析
[0185] 使用TRIRNA分离试剂（Sigma)从胰岛提取总RNA。使用PowerSYBRGreen试剂 盒和StepOnePlus工具（AppliedBiosciences)进行定量PCR。在用内部对照18S核糖体 RNA表达归一化之后，基于△ △CT计算相对量（RQ)。
[0186] 应理解，本文所述的目前优选的实施方式的各种改变和修饰对本领域技术人员是 显而易见的。在不背离公开的方法的精神和范围的情况下，可做出这样的改变和修饰，而不 减少其期望的优势。所以，期望所附的权利要求覆盖这样的改变和修饰。
[0187] 卖施例2 :Ig_GAD2驱动的免痔调节不足以克服明显的I铟糖尿病
[0188] 在患明显T1D的对象中测试抗原特异性疗法。在一个示例性方法中，通过PCR诱 变将GAD2核苷酸序列插入91A3重链的⑶R3可变区并且通过DNA测序分析所得嵌合重链 基因。（见实施例1)。
[0189] 令人吃惊地，尽管Ig_GAD2治疗在所有的高血糖小鼠中恢复血糖量正常，但是明 显糖尿病动物都没有从糖尿病恢复（图1A)。更有趣地，患病的动物展示脾中Thl7细胞的根 除和Thl细胞的保留（图1B-D)，与先前在高血糖小鼠的治疗中观察的免疫调节类似（Jain 等，J.Exp.Med. 205:207-218 (2008))。事实上，Ig-GAD2治疗的糖尿病小鼠具有增加频率的 产生IFNγ和/或IL-10的⑶4+⑶8Vβ8. 1/8. 2+T细胞（图1B)，但是脾或胰腺中相对于未 治疗的患病动物消失了Thl7细胞（图1C)。而且，因为它们签名转录因子，分别T-bet和 RORyt的mRNA明显减少，胰腺中Thl或Thl7细胞减少（图1D)。总体上，Ig-GAD2驱动的 免疫调节不足以恢复明显糖尿病小鼠中的血糖量正常。
[0190] 卖施例3 :与Ig-GAD2治疗一起務棺BM细朐克服了明显T1D
[0191] 进行骨髓（BM)移植，以研究用Ig_GAD2和细胞替换疗法的同时治疗是否产生明显 糖尿病的持续恢复。因此，从健康供体的BM细胞移植结合70-天Ig-GAD2治疗并且评估血 糖量正常的恢复（治疗示意性显示在图2A中）。给予Ig-GAD2和BM移植二者（Ig-GAD2+BM) 的大部分小鼠避免了疾病，无论BM是否来自雄性或雌性供体，而在单独给予Ig-GAD2或BM 的小鼠中没有观察到保护（图2B)。治疗消除了与糖尿病出现相关的胰岛素-抗性（图8)。 用Ig-GAD2+BM方案治疗的糖尿病小鼠，如单独Ig-GAD2的那些接受者，具有增加频率的产 生IFNγ和/或IL-