专利名称：烟草根特异启动子的克隆及其在转基因植物上的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过以基因组学及功能基因组学为手段克隆烟草根特异表达启动子的方法，属于植物基因工程技术领域。
背景技术：
长期以来烟草根茎病害是影响烟草产量和品质的主要病害，如烟草青枯病、黑胫病等， 烟草青枯病是毁灭性病害，病菌从根部侵入，该病目前主要在我国的南方烟区如福建、湖南 等省份普遍发生，局部地块发病率达到80%以上，且常与烟草黑胫病混合发生，严重时可 使全田烟草枯死(刘勇等2007)。迄今已知，青枯病菌为害XX科的XX物种，但对烟草青枯病 的防治至今没有特效药可治。关于根部特异表达的启动子报道较少。SchneiderK等利用T-DAN标签技术分 离克隆了可在Arabidopsis根毛表皮细胞中特异表达的核蛋白基因；XuY等对编码水稻根 部特异表达蛋白的两个cDNA克隆(RCc2和RCc3的特性进行深入分析，发现其编码的蛋白 主要在幼根中表达)。目前在烟草上已克隆出一些组织特异性的启动子，如种皮特异性启动 子、花药特异启动子TA29等(Fobert, 1994;李国胜等，1995)。Yamamoio等人(1991)报道 烟草根特异表达的TobRB7基因的cds片段5’上游ISOObp区段中的片段，具根组织特异表 达调控功能，但主要在烟草幼根中表达。目前尚未见将烟草组织特异表达启动子应用于转 外源目的基因的报道。由于烟草是四倍体，遗传背景及其复杂，选育良好的栽培种非常困难，而目前主要 栽培的品种经过多年栽培，已经容易产生根茎部病虫害。植物基因组学与功能基因组学的 快速发展，通过分子育种来解决以往常规育种没有办法解决的科学难题已经成为了可能。 分子育种首先要考虑到启动子，不同类型的启动子给植物生长也带来不同的影响，随着转 基因安全性得到了普遍关注，因此选择有效的启动子成为了当前分子安全育种的热点与难 点。目前通过生物手段已经成功获得了相应的特异启动子。为植物安全育种提供了基础。本发明针对以上背景技术，通过构建烟草SSHcDNA文库，对文库进行筛选，克隆得 到烟草根、茎特异启动子ATTtVJ ，并利用特异启动子构建高效植物表达载体，建立以抗生素 为筛选剂的转基因遗传体系，以及快速、高效的转基因检测技术，确定了烟草根部特异启动 子的遗传表达，为烟草抗根茎部病害品种的培育奠定了良好的技术基础。
发明内容
本发明提供了一种烟草根特异启动子的克隆及其在转基因植物上的应用，利用特异启 动子来安全有效的解决烟草生产过程中的根茎部病虫害。本发明的烟草根特异启动子，其至少含有SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。克隆烟草根特异启动子的方法，包括SSH文库的构建，探针的制作，文库杂交筛选 特异基因，RT-PCR鉴定特异基因的时空表达，克隆全长基因序列，进而克隆上游的烟草根特 异启动子；所述全长基因序列的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。具体地说，从我们所构建的烟草品种K326SSH差异表达文库中筛选得到根特异表 达基因片段，对筛选得到的根特异表达基因进行鉴定，并克隆得到了全长特异基因，进而克隆特异基因上游的启动子，然构建特异启动子驱动GUS基因的植物表达载体，经农杆菌介 导将目的启动子导入烟草品种翠碧一号上，对转基因烟草进行GUS组织化学鉴定，确定了 烟草启动子的特异性。其特征在于
1、构建烟草根差异文库，对文库进行筛选，得到差异表达基因；
2、烟草根特异启动子NTR12的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示； 3、构建的植物表达载体为PBI121-NTR12:⑶S；所述的pBI121_NTR12:⑶S指以NTR12 为启动子，⑶S为报告基因，Nos为终止子，Kam为筛选转基因阳性植株的植物表达载体；
4、通过农杆菌介导法，获得转基因烟草阳性植株，通过GUS染色，证实了烟草启动子 NTRl2的特异性。本发明通过分别构建烟草根和茎叶SSH抑制性消减杂交文库，经文库杂交获到了 烟草根特异表达基因，经定量RT-PCR鉴定后为烟草根、茎特异表达基因。之后提取烤烟栽 培品种K326DNA，经酶切和加接头后，通过FlankingPCR技术，克隆得到一段956bp的序列， 生物信息学分析表明为启动子序列，定名NtR12。在pBI121上构建由NtR12::⑶S融合基因 的植物表达载体，转化烟草K326中，对转基因烟草的根茎叶等各个器官进行GUS染色，表明 NTR12启动子在烟草的根部表达量大于35S启动子的表达，在茎部有表达，而在烟草的叶片 部位检测不到GUS活性，已应用于烟草抗青枯病转基因利用。因此，得出该启动子是一个重 要的根部表达启动子，可以作为一种高效特异启动子用于烟草等植物基因工程。根据上述培育方法，已经成功获得转PBI121-NTR12::⑶S载体的转基因烟草，通 过与35S组合型启动子进行对比鉴定，在根部的表达量高于35S，在烟草的茎部表达量低于 35S启动子，而在叶片不表达，证实了烟草NTR12启动子的特异性，为烟草转基因安全育种 提供了有利的前景。本发明的烟草根部特异启动子在转基因植物上的应用所述转基因植物的制备方 法，包括下述步骤
(1)将烟草根部特异启动子序列插入表达载体中，构建带该特异启动子驱
动功能基因的植物表达载体。(2)利用所述植物表达载体导入农杆菌，获得转化体。(3)将所述的转化体转化植物，获得转基因植株。本发明的特异基因序列是烟草未报导过的序列，所克隆的启动子序列是全新的， 通过promoterprediction和sigscan预测了 NtR12的启动子序列，在NtR12启动子中，存在 两个转录单元起始转录单元875 925，聚合酶起始识别位点可能是37、7，且起始转录单 元得分为0. 97，基本可确定为完整的启动子阅读框架。通过PLANTCARE分析这NtR12启动 子序列中存在基本的启动子序列TATA-box和CAAT-box。序列的碱基组成含量显示NtR12 启动子AT占64. 6%，GC占35. 8%。AT丰富序列的低复杂度有利于DNA双链结构的解螺旋， 提高基因的转录效率。启动子存在GC盒，因为GC盒一般位于TATA-box和CAAT-box的上 游，所以猜测这两个基因启动子序列可能都接近完整的启动子。使用PLANTCARE预测显示， 这两个基因启动子都存在根启动子的保守序列盒，这为下一步连入抗病基因，进一步进行 烟草转基因鉴定打下坚实的基础。已有报导TobRB7基因启动子是唯一的烟草根特异表达启动子，主要在根端即 幼根的伸长区表达，不在整个根系表达和伸长区以后的根部表达，因此，不能应来驱动抗性基因解决烟草的根茎部病害；而本发明得到的NtR12启动子在烟草根组织和茎部都有表 达，我们用NtR12启动子RIP基因，发现抗病基因可在根和茎表达，不在叶片表达。本发明的烟草根特异启动子有以下优点传统的分子育种所用的启动子为组 合型35S启动子，它在植株各组织器官发育的不同阶段均表达，随着转基因安全性受到普 遍的关注，组合型35S启动子已经不能满足转基因发展的需要，而且35S组合型启动子容易 发生基因沉默；本发明的NtR12根部特异启动子，在烟草的根部表达量比35S启动子要高， 而叶片不表达，烟草是以收获叶片器官的经济作物，叶片上基因不表达，能提高烟草转基因 的安全性。大田烟草种植过程中容易受到许多根、茎病虫害的危害，而给烟草生产和品质造 成很到的损失，克隆烟草根茎特异启动子，通过分子设计育种，能够安全有效的解决烟草种 植过程中的根茎病虫害。
图1为烟草根、叶文库的检测；其中a表示根的cDNA文库中菌落PCR产物电泳图， b表示叶的cDNA文库中菌落PCR产物电泳图2为膜杂交获得差异基因；a表示根cDNA探针与根cDNA点阵膜杂交部分结果，b表 示叶的cDNA探针与根cDNA点阵膜杂交部分结果； 图3为烟草特异基因0G-12RT-PCR结果； 图4为转PBI121-NTR12基因烟草⑶S染色。
具体实施例方式
实施例1烟叶根与叶片总RNA的提取
将K326原种盘栽，待烟株长至旺长期时，取烟株倒2、倒3、倒5、倒6、倒9叶位的叶 片洗净，迅速将叶片以主脉为界，倒2、倒3叶位的叶片二等分；倒5、倒6叶位的叶片4等分， 倒9叶位的叶片取叶片中间部位四等分，各取一份置于液氮中冷冻后置-80°C冰箱中保存。 待叶片取样完毕时，迅速将根洗净，取白根置于液氮中冷冻后置-80°C冰箱中保存。取2. 5g 根(实验组Tester)与叶(驱动组Driver)置于研钵中加液氮研磨，取0. lg倒入预冷的0. 5ml 异硫氰酸胍变性勻浆液中，充分混勻lmin。加入0. lml2mol/LNaAc (pH4. 0)混勻lmin ；加 A 0. 5ml水饱和酚，振荡30秒，冰浴5min。加入0. 2ml氯仿异戊醇(24 :1)，剧烈振荡2次 3min，冰上放置lOmin。4°C，12000g离心15min。小心移取上层水相，弃去中间和下层有机 相。加入等体积酚氯仿异戊醇(25 24 :1)，振荡2次3min，冰上放置5min。4°C,12000g 离心10-15min，移取上层水相，弃去中间和下层有机相。加入等体积异丙醇，放置-20°C 30 分种以沉淀RNA。4°C，12000g离心15min收集RNA沉淀，用75%乙醇洗涤沉淀；将RNA沉淀 在空气中干燥。用30ulRNaSe-freeddH20或去离子甲酰胺溶解RNA沉淀；实施例2烟草根、叶cDNA抑制性消减杂交文库的构建
对实施例1提取的RNA质量进行检测，参照Proiega公司的polyATtract mRNAIsolationSystonsIII步骤进行分离mRNA,合成cDNA，第一链合成，取4ul的mRNA与 lulcDNASynthesisPriner混勻；短暂离心后，70°C温育2nin后立刻冰置2nin，短暂离心后，依次加入 5XFirst-StrandBuffer2ul, dNIPMix(lOmMeach) lul, sterileH201ul, AMVReverseTranscriptase (20units/ ul) lul，DEPCH205ul，混勻后短暂离心，42°C反应lhr后，置冰上终止反应，第二链合成，在IHEP管中加入 sterileMMS. 4ul, 5XSecond-StrancBufferl6. Oul,dNIFMix (IQiM) 1.6ul, 20XSecond-StrancEnzynBCockta il4 Oul，短暂离心后在16°C反应2hr ；加入2ul (6U)的T4DNA聚合酶，混勻后16°C反应0. 5hr,力口入4ul 的 20XEDTA/Glycogen 终止反应。加入 lOOul 酚:氯仿异戊醇(25 24 :l)(pffi. 05-8. 35)振荡后 14D0Qrpn 离心2(Mn ；移取上层水相，加入lOOul氯仿异戊醇(24 :1)，振荡后MDOOrpm离心2(Mn ；移取上层水 相，加入40ul4M的NtpVC和300ul95%的酒精，振荡后14D0Qrpn离心2(Mn ；用80%的酒精洗涤沉淀后， 室温干燥l(Mn，溶于50ul的RNase-free水，取2ul合成的dsdM电泳检测质量，其余的置_20°C保存。cDNA 的 Rsal 酶切与接头(Adaptor)的连接，接头 1 5，-CTMTACGACTCACTATAGGGCTC GAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，接头 2R :5，-CTMTACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，； 3，-GCCGGCTCCA-5，)。二次抑制性消减杂交，第一次杂交，Rsal-digestedDrivercDNAl. 5ul, Adaptor1-1igatedTester 1 - 1 1 5u 1 (Adaptor 2R-1igatedTester 1 -2 ), 4XHybridizationBuffer 1. 0ul，98°C 反应 1. 5min 后置 68°C 反应 8hr,马上进行第二次杂交。 取一个Ep管，依次加入下列物质，往管中加一滴矿物油，并瞬间离心后，98°C反应1.5min 后取出；加入 DrivercDNAlul，4XHybridizationBufferlul，sterileH202ul,将新鲜反应 Testerl-1与Testerl-2混合后，加入上述反应液2ul ；短暂离心后，68°C过夜反应，编代号为 Tester。同样处理Driver，第二次杂交后仍编代号为Driver。加200ul的dilutionbuffer， 离心混勻，68°C反应7min后，置-20°C保存。将杂交后的产物进行两次PCR，PCR所用 的引物为Primer 1 5，-CTMTACGACTCACTATAGGGC-3，，用于第一次PCR扩增；巢式引物1 (NestedPCR primerl) 5' -TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，；巢式引物 2R (NestedPCRprimer2R) 5’ -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’)；巢式引物用于第二次 PCR 扩增。进行第一次PCR，PCR反应程序为94°C25sec— (94°C lOsec — 66°C 30sec — 72°C 90s ec)27_33cycles。第二次 PCR 在 27cycles、30cycles、33cycles 时各取出 3ul 反应液，加水 27ul，混勻；取出lul的稀释液，进行第二次PCR
在15cycle与20cycle时各取出8ul反应液电泳检测PCR扩增效果。PCR产物的纯 化，操作参照 Promega 公司 pGEM -TandpGEM 3 -TEasyVestorsKit 进行，扩增产物 4°C
过夜连接，电激转化，电激转化设置的参数电压1500V、电容50uF、电阻129 Q，涂板培 养质粒，进行菌落 PCR，PCR 程序 94°C 5min — (94°C lOsec — 68°C 30sec — 72°C 90sec) 35cycles — 72°C lOmin。cDNA检测结果表明如图1所示，根、叶菌落PCR的结果以单克隆 为主，所扩增的片段大小在200bp至1000bp之间，大小在文库所要求的范围之内。即所构 建的K326的根、叶的抑制性消减cDNA文库在库容量、重组率以及插入片段的大小等方面均 符合良好文库的质量标准，能够满足测序的要求。实施例3烟草根特异基因的克隆及序列特征分析
分别制备烟草根和茎、叶的cDNA，通过地高辛标记制备探针，杂交筛选烟草根特异表达 文库做成的DNA点阵膜Macroarray，荧光拍照，比对地高辛标记杂交后的照片，从中找出存 在差异的斑点，重新培养单克隆送测序如图2所示。结果表明筛选出130个差异较为明显 的克隆送测序，测序的结果在NCBI上进行比对，有71个片段与烟草、番茄等双子叶植物已 发表的序列有较高的同源性，其中得到差异基因片段0G-12，经5’和3’ RACE后，得到了一 个长度为848bp的带完整阅读框的全长cDNA,利用FGENESH (http//linuxl. softberry. com/berry, phtml)进行预测分析，预测结果表明其编码框为720bp，编码239个氨基酸，经 Blast分析表明，该基因表达蛋白与蓖麻表达主茎28kDa糖蛋白前体具有97%的同源性。是烟草上的一个新的基因。实施例4烟草根特异启动子的克隆及特性分析
提前种植烤烟K326材料，60d后选取幼根为材料，在液氮中研磨植物组织成粉末，并转 移到在65°C预热的盛有抽提液的离心管中。在65°C温育45min，其间不时混勻。用等体积 的24 1的氯仿/异戊醇抽提勻浆，颠倒混勻(温和)。4°C，lOOOOrpm离心5min，回收上清液。 在上清液中加入1/10体积的65°C的CTAB/Nacl的溶液，颠倒混勻(温和)。用等体积的24 1的氯仿/异戊醇抽提勻浆，颠倒混勻(温和)。4°C，10000rpm离心5min，回收上清液。加 入1倍体积的CTAB沉淀液，翻转混勻，见到沉淀后进行下一步；否则于65°C温育30min。于 4°C，10000rpm离心5min。移出上清，但不要丢弃，用0. 5ml高盐的TE缓冲液重悬沉淀，如 果沉淀难于重悬，于65°C温育30min，重复至所有的或大部分沉淀溶解。加入0. 6倍体积的 异丙醇沉淀核酸，充分混勻(温和)，4°C，lOOOOrpm离心15min。用80%乙醇洗沉淀，晾干，并 用0. lml的缓冲液溶解沉淀。最后加入1/20体积的RNA酶在37°C放lh。最后放在_20°C 保存备用。用内切酶Hind III对基因组DNA进行完全酶切，反应结束后，用无水乙醇沉淀回 收DNA并溶解于10ul灭菌蒸馏水，DNA酶切产物与接头的连接反应，LongAd: 5'GTAATACGA CTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGC3
ShortEco 5 ’ P-AATTGCAGCCCG-NH23’，ShortHind5’ P-AGCTGCAGCCCG-NH2 16°C反应过夜③反应结束后，72°C处理15min，然后低温保存，进行两次PCR，将连接产 物0. 5ul加入16. 5ul灭菌蒸馏水中，94°C加热lOmin，依次加入
lOxLAPCRBufferll (Mg2+plus) 2. 50ul, TaKaRaLATaqO.25ul, dNTPMixture (2. 5m) 4. OOul, API (10pm) 0. 50 1, SP1 (10pm) 0. 50ul，进行第一次 PCR，
AP15，GtaATACgACTCACTATAgggC3，，spl5'GCTAGTCATGTACTCGCTCACGTAG3， PCR1 反应程序:94°C 5min — (94°C 30sec — 72°C 2. 5min)10cycle — (94°C 30sec — 67°C 3min) 30cycles，将PCR1产物稀释50倍取lul作为模板后，依次加入10xExTaqPCRBufferII (Mg2+plus) 2. 50ul,TaKaRaLATaqO. 25ul, dNTPMixture (2. 5m)4. OOul，灭菌蒸馏水 16. 25ulAP2 (10pm)0. 50ul，SP2 (10pm) 0. 50ul，进行第二次 PCR，所以得弓丨物为 AP2~C5，TggTCgACggCCCgggcTgc3，，NtR12sp25' 0GCCA TA0GCCAGCTCAAACAATTG3'。PCR2 反应程序 M°C 2min — (94°C 30sec — 72°C 2. 5min)5cycle — (94°C 30sec — 67°C 30sec — 72°C 3min)35cycles。PCR产物 1%琼脂糖凝胶电泳检测，回收 启动子目的片段。得到一个长度为956bp的0G-12基因的5’上游序列，进一步利用PLACE (http://www. dna. affrc. go. jp/)预测分析了 NtR12基因5，上游序列956bp，发现其含有 大多数高等植物启动子的保守元件，说明它具有潜在的启动子活性。预测结果表明含多个 TATAbox和CAATbox，此外高等植物启动子区核心保守序列一般比较靠近转录起始位点，转 录起始位点位于883bp处，距转录起始位点_185bp处的TATAbox和_280bp处的CAATbox 很有可能是决定该启动子转录起始和转录效率的重要元件。另外，从0G-12基因的5’上游 序列的预测结果看出该启动子区存在若干器官特异性表达和植物激素应答的特异元件，如 含有多个YACT保守序列，该序列为植物细胞特异表达的顺式元件的重要组合部分。存在若 干器官特异性表达和植物激素应答的特异元件，如CANNTG-基序、响应诱导物的应答元件 W-Box (TGAC)及MYb元件响应植物激素元件。CANNTG和GATA等顺式作用元件是决定植物 组织器官特异表达的转录因子结合点，MYb元件控制植物次生代谢、调节细胞形态建成及信 号传导通路中起很大作用。通过上述分析可以说明0G-12基因的5’上游序列具有启动子功能并根据其相关保守序列说明该启动子具有一定的根特异表达的潜力，为下一步的功能 验证奠下良好的基础。通过特异基因0G-12RT-PCR如图3所示，所克隆得到的烟草NtR12 启动子是特异启动子，烟草特异启动子NtR12在生长的各个时期特异性不一样，生长期基 因在烟草叶片不表达，而在旺长期表现出高度的根特异性，基因只在烟草根本表达。结果表 明，烟草特异启动子NtR12在生长的各个时期特异性不一样，生长期基因在烟草叶片不表 达，而在旺长期表现出高度的根特异性，基因只在烟草根本表达。实施例5烟草0G-12基因启动子表达载体构建
通过设计引物 NT-ID12-F:5，-acgtgagcgagtacatgac-3，NT_ID12_R:5，-GTGCGCAACAA GAAGTCTAC-3’，利用PCR扩增出目的片段，在引物两头设计两个Hind III与BamH I两个酶 切位点，将含由⑶S基因的pBI 121载体和PCR扩增的到的NtR12启动子进行Hind III和 BamH I进行双酶切，回收载体和目的片段，利用T4连接酶16°C过夜连接，转化涂板，于37°C 培养箱过夜培养，挑取单克隆进行菌落PCR，将阳性克隆送出去测序，所得的载体命名为 pBI121-NtR12，将载体转入EHA105农杆菌中。实施例6烟草的遗传转化
1. 烟草无菌苗的获得以及根瘤农杆菌侵染液的制备
往1. 5毫升的离心管中放入大概200粒左右的CB—1烟草种子，用70%的酒精进行消 毒1分钟，在超净工作台上用事先准备好的无菌水清洗三次用0. 1%的砷汞进行消毒10-15 分钟无菌水再次清洗5次，将处理好的无菌种子种植在1/2MS培养基上。从YEB固体平板上挑取含有重组质粒的单菌落，接种到含有Rif和Km的液体培 养基中，28°C 250rpm培养过夜；取1ml过夜培养的菌液接种到30ml含有相应抗生素(或无 任何抗生素)的YEB液体培养基中继续振荡培养，至0. D. 600=0. 6-0. 8，4000rpm，4°C离心 lOmin，弃上清；沉淀用20mlMS液体培养基(MS大量+MS微量+20g/l蔗糖，pH=5. 8)重新悬 浮备用。分光光度计测得此时菌液的0. D. 600在0. 3-0. 6左右。2. 根瘤农杆菌介导的烟草遗传转化
外植体制备取事先培养的无菌苗嫩叶，剪切成0. 5X0. 5cm大小。叶盘法转化将处 理好的外植体投入制备好的菌液中，浸泡侵染5mi后，用含有Cef500mg/L的无菌水冲洗3_5 次后，接种于共培养基中于28 °C暗培养；2天后转入含有Cef500mg/L、kam200mg/L的叶片芽 诱导培养基上筛选培养，控制温度为25-28°C、光强为20001eX、每天光照时间为12_14hr。 等叶芽长至1cm大hr，转入生根培养基。待基部伸出大量根系、上部生长至3 4cm的幼苗 转至盛有无菌沙土的培养盒内，炼苗后转入温室培养，并进行GUS检测。诱导培养基培养 基 +0. lmg/LNAA+lmg/L6-BA,共培养培养基MS 培养基 +0. lmg/LNAA+lmg/L6_BA，诱导筛选 培养基MS 培养基+0. lmg/LNAA+lmg/L6-BA+200mg/Lkam+500mg/LCef，生根培养基MS 培养 基 50mg/LKam+500mg/LCefo实施例7⑶S的组织化学染色及观察
取新鲜的转基因烟草植株，将烟草的根、茎、叶切成小块放入1.5ml的离心管中， 加入⑶S液(配置0. 2mol/L的磷酸二氢纳溶液A与0. 2mol/L磷酸氢二钠溶液B，取 溶液A39ml+61ml溶液B+100ml无菌水配置成溶液C，使PH=7. 0。取6. 25ml的溶液 C+13mgX-GLU+0. 25ml 二甲基亚砜+18. 5mlddH20配成GUS染色液)。将含有植物材料和GUS 染液的离心管，放到37°C的恒温培养箱里，染色3h。最后脱去染色液，通过70%的乙醇脱色后，观察照相。经过对转pBI121-NtR12基因的烟草各个不同组织染色观察如图4所示，为烟 草特异启动子驱使GUS基因在烟草翠碧一号的表达情况，从图中可以看出烟草特异启动子 在根部的表达远大于35S启动子诱导的GUS基因在烟草根本的表达量，而在烟草的茎部表 达量上特异启动子NtR12低于组合型35S启动子，在烟草叶片的表达上可以看出特异启动 子在烟草叶片不诱导GUS基因表达，而组合型35S启动子诱导GUS基因在烟草叶片表达量 很大。结果表明在烟草根、茎有蓝色出现，而烟草的叶片以原来的一样，未发现有蓝色。特别 是烟草的根部出现了很深的蓝色，即该启动子具有根部表达的特异性。而对照的转PBI121 空载体进行观察，在烟草各各个器官均出现了蓝色现象，表明了以往35S组合型启动子不 能适应未来转基因安全育种的要求。
权利要求
一种烟草根特异启动子，其至少含有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.种克隆如权利要求1所述的烟草根特异启动子的方法，包括SSH文库的构建，探针的 制作，文库杂交筛选特异基因，RT-PCR鉴定特异基因的时空表达，克隆全长基因序列，进而 克隆上游的烟草根特异启动子。
3.根据权利要求2所述的克隆烟草根特异启动子的方法，其特征在于所述全长基因 序列的核苷酸序列如SEQIDNo. 2所示。
4.一种含有权利要求1所述的烟草根特异启动子或由权利要求2或3所述的方法克隆 的烟草根特异启动子的植物表达载体。
5.根据权利要求4所述的植物表达载体，是PBI121-NTR12。
6.一种含有权利要求1、4或5所述的烟草根部特异启动子在转基因植物上的应用。
全文摘要
本发明提供了一种烟草根特异启动子的克隆及其在转基因植物上的应用。该烟草根特异启动子，其至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。克隆烟草根特异启动子的方法，包括SSH文库的构建，探针的制作，文库杂交筛选特异基因，RT-PCR鉴定特异基因的时空表达，克隆全长基因序列，进而克隆上游特异启动子。所述的烟草根部特异启动子应用于转基因植物。本发明的NtR12根部特异启动子，能提高烟草转基因的安全性。能安全有效地解决烟草种植过程中的根茎病虫害。
文档编号C12N15/10GK101875937SQ20101022815
公开日2010年11月3日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者兰岚, 庄伟建, 潘建箐, 蔡铁城, 闫利明, 陈华, 陈顺辉 申请人:福建农林大学