专利名称：月季热激蛋白启动子、其克隆方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，涉及一种热诱导型启动子 RcHSP17. 8P核苷酸编码序列的克隆，此启动子重组表达载体的构建，以及转入草本植物的 双子叶植物中启动下游蛋白表达的方法。
背景技术：
启动子可以与依赖于DNA的RNA聚合酶识别并与之结合，从而起始基因转录的一 段DNA序列，是基因表达调控的重要元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基处.在核 心启动子上游通常会有一些特殊的DNA序列，即顺式作用元件，转录因子与之结合从而激 活或抑制基因的转录。它与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用是 启动子调控基因转录的实质。根据启动子的转录模式可将其分为3类组成型启动子、组织或器官特异性启动 子和诱导型启动子。诱导型启动子与另外两类相比特点在于它可根据需要在植物特定的 发育阶段、组织器官或特定的生长环境下，诱导基因准确而又选择的起始转录。温度效应启动子是受温度诱导活性的启动子，可分为热效应和冷效应启动子 两类。热效应启动子对高温产生响应，含HSE、CCAAT-盒、AT-rich等活性元件序列。 HSE含有一个3碱基的5’ -GAA-3，序列，或反方向的5’ -TTC-3’序列，这种三核苷重 复序列相间排列，两者之间被两个碱基隔开，形成5’-[nGAAn][nTTCn]-3’结构。Coca 等(Maria A. Coca, ConcepcionAlmoguera, Terry L. Thomas and Juan Jordano(1996) Differential regulation ofsmall heat-shock genes in plants analysis of a water-stress-inducible anddevelopmentally activated sunflower promoter. Plant Molecular Biology, 31 863-876)将向日葵的 HaHSP17. 7G4 基因的启动子与 gus 连接， 转化烟草，发现其对对高温(42°C)、脱落酸都有应答，在胚胎形成过程中也有积累。拟 南芥AtHsp90-l基因启动子CCAAT-box缺失表明，CCAAT-box自身对热激无反应，只有与 启动子中其它的热激元件，如HSEs或STREs(stressresponse elements)共同作用才 能增加热诱导启动子的特性(Haralampidis K.，Milioni D. and Rigas S. (2002)Plant Physiol, 129，1138-1149·)。将大豆热激蛋白 GmHSP17. 3B 启动子与 gus、GFP-talin 融 合，转入苔藓。通过控制热激温度和来调节⑶S的表达量(Younousse Saidi, Andrija Finka, MickhailChakhporanian, Jean-Pierre Zry “ d, Didier G. Schaefer and Pierre Goloubinoff, (2005)Plant Molecular Biology，59，697-711)，这使将启动子调节功能应 用于生物技术，使在植物细胞中表达可控制数量的内源或重组蛋白成为可能。与本发明相 关的参考文献有1. Concepcion Almoguera, Pilar Prieto-Dapena and Juan Jordano (1998)Dual regulation of a heat shock promoter during embryogenesis stage-dependentrole of heat shock elements. The plant Journal,13 (4),437-4462. D. CRONE, J. RUEDA, K. L MARTIN, D. A. HAMILTON and J. P. MASCARENHAS (2001)The differential expression of a heat shock promoter infloral and reproductive tissues. Plant. Cell and Environment,24,869-8743. Dorothea K.Thompson and Charles J. Daniels (1998) Heat shockinducibility of an archaeal TATA-Iike promoter is controlled by adjacentsequence elements. Molecular Microbiology,27 (3),541-5514. Maria A. Coca, Concepcion Almoguera, Terry L. Thomas and JuanJordano (1996)Differential regulation of small heat-shock genes in plants analysis of a water—stress—inducible and developmentalIy activated sunflowerpromoter. Plant Molecular Biology,31 :863_8765. Haralampidis K. ,Milioni D. and Rigas S. (2002)Combinatorialinteraction of Cis elements specifies the exp ression of the A rabidopsisAtHsp90_l gene Plant Physiol，129，1138-1149.6. Ralf Prandl and Fritz Schoffl(1996)Heat shock elements are involved inheat shock promoter activation during tobacco seed maturation. Plant MolecularBiology,31,157-1627. Younousse Saidi, Andrija Finka, Mickhail Chakhporan i an, Jean-PierreZry “ d, Didier G.S chaefer and Pierre Goloubinoff, (2005)Controlled expressionof recombinant proteins in Physcomitrella patens by a conditional heat-shockpromoter -.a tool for plant research and biotechnology. Plant Molecular Biology,59,697-7118.夏江东等(2006)高等植物启动子功能和结构研究进展，云南农业大学学报，第 21卷第1期P7-149.伊淑莹等(2007)番茄多胁迫诱导型LeMTshsp启动子的分子克隆及其功能分 析，云南植物研究，29 (2)，223 230
发明内容
本发明的目的在首先在于提出一种从月季中分离出的编码细胞质I型小分子热 激蛋白17.8的基因RcHSP17. 8的启动子，该启动子是热诱导型，是月季中一种新的热诱导 型启动子。本发明的第二目的是提供这种RcHSP17. 8的启动子的制备方法。本发明的第三目的是提供这种RcHSP17. 8P启动子的应用。本发明提供了一种月季热激蛋白启动子，其核苷酸编码序列如SEQ IDN0. 1所示。本发明的月季热激蛋白启动子是月季细胞质I型小分子热激蛋的基因RcHSP17. 8 上游的一段转录区，全长1.91kbp，本发明中称为RcHSP17.8P。其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，也包括与SEQ ID NO. 1序列同源度75%甚至在90%以上，与SEQ ID NO. 1编码的DNA 具有相同功能的核酸分子。本发明的月季热激蛋白启动子的顺式作用元件3个热激元件(□:标识)和2个 冷感应元件(._ 标识)，以及1个对干旱产生响应的调控元(—标识)。具体位置见图 7中的标识元件。
本发明还提供了上述月季热激蛋白启动子的克隆方法，依次包括如下步骤(1)取月季嫩叶，抽提DNA;(2)选择月季热激蛋白ORF中无酶切位点的限制性内切酶，对(1)所得DNA充分酶 切，酶切产物经沉淀纯化后环化自连；(3)根据月季热激蛋白ORF的序列，采用反式PCR方法克隆得到权利要求1所述的 月季热激蛋白启动子。上述克隆方法中，所述的月季嫩叶是温室中正常培养4周的月季组培盆苗的嫩 叶。例如，本发明的一个实施例中采用温室中正常培养4周的月季‘曼海姆宫殿’(Schloss mannieim,以下简写为SM)组培盆苗，取其嫩叶。上述克隆方法中，所述的月季热激蛋白ORF中无酶切位点的限制性内切酶是Bgl II,Apa I.BamH I.Sal I, Sph I, Sca I, Eae I, Hpa I, NotI, Rsa I 中的一种或者几种。上述克隆方法中，步骤(3)中利用反式PCR引物进行三轮PCR扩增获得所述的月 季热激蛋白启动子。反式PCR(I-PCR)可以快速、高效地扩增cDNA或基因组中已知序列两侧位置的片 段。其基本实验程序是基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片 段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知 片段的扩增产物(流程如图8所示)。上述克隆方法中，采用三对反式PCR引物进行扩增。较好的，第三对反式PCR引物 中一条即为ORF的5’端序列，另一条尽量靠近月季热激蛋白ORF的3’端。本发明提供了用于调取获得RcHSP17. 8(月季热激蛋白)的三对核苷酸引物。该 引物根据RcHSP17. 8的ORF设计，使用此引物对BglII酶切过的月季基因组DNA进行三次 反式PCR扩增可获得长2. 2kbp的DNA片段。具体的引物序列信息参见SEQ ID NO. 2-SEQ ID NO. 7。上述克隆方法中，克隆此启动子的PCR酶可以采用LA Taq，buffer为相应的GC缓 冲液(LA-Taq专用)。上述克隆方法中，克隆此启动子的PCR程序中采用68°C进行复性及延伸。例如，可 以设定为94°C预变性4min ；98°C变性10s，68°C复性及延伸15min，30个循环；最后72°C延 伸 IOmin0本发明还提供了含有所述月季热激蛋白启动子的重组载体。即将本发明的月季 热激蛋白启动子根据常规方法与适当的植物表达载体连接，例如本发明实施例中采用的 PCAMBIA1300植物表达载体等等。最后，本发明提供了所述月季热激蛋白启动子的应用，即将所述启动子的重组载 体转入植物中，以启动下游基因的表达。根据月季启动子RcHSP17.8P序列1910bp，设计扩增出完整序列的引物，并在正反 向引物上分别引入限制性内切酶识别位点(视选用的载体而定)，以便构建表达载体。将 PCR产物与经过同样双酶切的改造过的植物表达载体连接，转化，测序，确保序列正确。将其 转入农杆菌中，对正常培养(生长条件为光周期16h/8h(L/D)，22°C)的目标植物进行转基 因，采用浸花法转化适当花期的该植物。正常培养，收取种子，获得Tl代幼苗后GUS显色。以双子叶植物拟南芥为例，具体步骤如下
(1)将含有所述月季热激蛋白启动子的重组表达载体转入共转化农杆菌GV3101。(2)于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10 μ 1 IOml接种。28°C,3000rpm 摇过夜，约30h，次日下午6点将已摇活的菌按(1 400)及750 μ 1菌液转至汉IOOml YEP+Kan+Rif中培养28°C，300rpm约14h，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照， 当菌液达到0D600为1. 2时，可收集菌体于50ml离心管(灭菌)，4°C，4000g离心lOmin。 用5%蔗糖(含0.03% silwet)稀释至0D600约为0. 8 1. O左右，用5%蔗糖作对照。转 化时将花苞在溶液中浸泡5s左右，暗培养24h。转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥 苗子浇水至透。(3)将转化好的苗正常培养，每3d浇水1次。(4)收取转化拟南芥，烘干(37°C 24h)。用乙醇消毒后并撒于抗生素潮霉素筛选培 养基上，4°C春化2d，正常培养，一周后获得转化植株的Tl代幼苗。(5)将Tl代幼苗移到土中培养。(6) PCR鉴定其HYG基因的表达，样品分别为转基因和野生型的拟南芥基因组DNA。(6)鉴定后的植株⑶S显色。本发明中，可选用本领域已经知道的各种载体，如市售的载体以及质粒。本研究分离的月季启动子RcHSP17. 8P，是新型的诱导型启动子，是一种温度依赖 型基因RcHSP17. 8的上游一段DNA序列，具体为一种编码月季细胞质I型小分子热激蛋 RcHSP 17. 8的启动子，记为RcHSP17. 8P。将本发明所获基因通过农杆菌介导的转基因的方 法，转入双子叶植物拟南芥中，启动下游重组基因在转化细胞中具有高温诱导表达的特性。 本发明利用分子生物学方法分析该片段控制下的报告基因GUS的表达模式，结果表明产生 的转基因拟南芥幼苗在37°C热激处理下诱导下游基因GUS的表达，并且表达活性随着发育 时期而变化。本发明的月季启动子RcHSP17. 8P将可作为一种有效的温度感应的生物传感 器系统的基础。
图1月季SM基因组酶切结果。1-10泳道分别为BglII、Apa I,BamHI,Sal I、SphI、 Sca I、Eae I、Hpa I、Not I、Rsa I 酶切产物电泳检测。图2为第二轮反式PCR电泳检测结果。图3为第三轮反式PCR电泳检测。图4为转基因拟南芥潮霉素基因(HYG)和启动子片段的PCR鉴定结果，其中，左右 两幅分别用潮霉素基因和启动子片段的一对特异引物PCR鉴定样品中潮霉素(图左)和启 动子(右)；M 为 DL2000Marker 从上至下:2000bp，IOOObp, 750bp, 500bp ；+ 拟南芥转基因 阳性植株苗鉴定；-未转化启动子序列拟南芥阴性苗鉴定。图5为不同发育时期转基因拟南芥植株苗热处理下进行⑶S显色鉴定结果，其中， aa、bb、cc、dd 为没有处理的 12h、24h、2d、6d 的苗的 GUS 染色情况，ee、ff、gg、hh 为 12h、 24h、2d、6d的苗37°C处理Ih后GUS染色情况。图6为花和果荚中⑶S显色鉴定结果。a、b、e为对照，c、d、f为37°C热激Ih后 染色。图7为启动子RcHSP17.8P序列中作用元件的标示图，图中有正、负两条互补链，有3个热激元件(1 ~~!标识)，2个冷感应元件(一.标识)，1个对干旱产生响应的调控元 (一标识)O 图8为反式PCR的基本流程图。
具体实施例方式下面结合具体实施实例进一步阐释本发明。应理解，这些实例仅以用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。下列实例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法进 行。如 Sambrook等分子克隆实验手册(New York Co Id Spring Harbor Labortary Press， 1989)中所述条件，或按照制造生产厂商的使用说明。所用试剂材料如非特别标注，则是从 上海生工、上海前尘生物科技有限公司购得。实施例1月季RcHSP17. 8启动子RcHSP17. 8P基因的克隆1月季(Rosa chinensis)品种曼海姆(Japonica)来自上海植物园；生长条件为 光周期 16h/8h(L/D)，27°C。2基因组DNA提取。取0. 05g嫩叶片，加入少许不溶性PVP，液氮中充分研磨， 迅速转移至1.5ml的EP管中；加入500 μ 1 65°C预热的提取缓冲液，快速混勻；65°C水 浴20min(期间倒置混勻1-2次)，冷却至室温；加入500 μ 1氯仿异戊醇(24 1)，轻 柔混勻，静置l-2min ；12000rpm、室温离心lOmin，上清转移至新管；加入等体积的氯仿 异戊醇(24 1)，轻柔混勻，静置l-2min;同上离心，上清转移至新管；加入1/10体积3M NaAc (pH5. 2)、2倍体积冰冷的无水乙醇(_20°C )，轻柔混勻，_20°C静置40min ；同上离心，弃 上清，沉淀用70 %乙醇(4°C预冷)洗涤2次；室温凉干，25 μ ITE (含1 % (V/V) RNA酶)充 分溶解沉淀；65°C水浴消化RNA Ih ；取5 μ 1用于0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测。3启动子的克隆。选择在RcHSP17. 8的ORF中无酶切位点(non-cutting)的限制 性内切酶Bgl II, Apa I.BamH I、Sail、SphI、Sca I, Eae I, Hpa I, Not I, Rsa I 对 SM 基 因组DNA进行充分酶切(图1)，酶切产物经沉淀纯化后用于环化自连。依据RcHSP17. 8的 ORF序列设计SM与KP的RcHSP17. 8启动子克隆使用的引物，第三对反式PCR引物IN3-F 即为ORF的5’端序列，IN3-R尽量靠近ORF的3’端设计。以上述连接产物为模板，以反式 PCR引物进行三轮PCR扩增，从Bgl II酶切产物中扩增到一条2. 2Kb的片段(图3)，小量 胶回收法将PCR产物进行割胶回收。反式PCR引物序列如下
第一对
INl-F 5，-AGGACAAGAACGACAAGTGG-3’
INl-R 5，-GTCATCTTCAATCTCAACCT-3’
第二对
IN2-F 5，-C GAGAGAAGCAGCGGCAAGT-3’
IN2-R 5，-CCTCTTCTTTCTTCAGCCCC-3，
第三对
IN3-F 5，-AGGCTGCTATGGAGAATGGA-3’
IN3-R 5，-GGAAATTTGGGATAAGCGACAT-3
实施例2月季启动子RcHSP17. 8P核苷I
登陆PlantCARE数据库在线进行预测RcHSP17. 8启动子DNA序列上的顺式作用元 件，分析其区域上的与热激、低温、干旱等胁迫相关，信息参见发明内容，具体序列如图7不 同标注。实施例3转化月季启动子RcHSP17. 8P的拟南芥植株潮霉素基因(HYG)和启动子片段的PCR
鉴定以SDS方法小量抽提转基因和野生植株的基因组DNA。利用潮霉素基因和启动子 片段的特异引物，进行PCR鉴定。检测结果如图4所示，PCR结果都表明携带启动子基因的 载体质粒已经整合到拟南芥基因组中。实施例4转化月季启动子RcHSP17. 8P的双子叶植物-拟南芥幼苗进行⑶S显色鉴定根据月季启动子RcHSP17.8P序列1910bp，设计扩增出完整序列的引物，并在正反 向引物上分别引入限制性内切酶识别位点，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增 产物为模板，在5’端和3’端分别加入EcoR I和SacI酶切位点。经EcoR I和SacI双酶 切的PCR产物与经过同样双酶切的改造过的pCAMBIA1300植物表达载体连接，转化，测序， 确保序列正确。将其转入农杆菌中。将含有RcHSP17.8P启动子序列的农杆菌，对正常培养 (生长条件为光周期16h/8h(L/D)，22°C )的拟南芥进行转基因，采用浸花法转化适当花期 的拟南芥。正常培养，收取种子，获得Tl代幼苗后GUS显色。具体步骤如下(1)将含有所述月季热激蛋白启动子的重组表达载体转入共转化农杆菌GV3101。(2)于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10 μ 1 IOml接种。28°C,3000rpm 摇过夜，约30h，次日下午6点将已摇活的菌按(1 400)及750 μ 1菌液转至汉IOOml YEP+Kan+Rif中培养28°C，300rpm约14h，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照， 当菌液达到0D600为1. 2时，可收集菌体于50ml离心管(灭菌)，4°C，4000g离心lOmin。 用5%蔗糖(含0.03% silwet)稀释至0D600约为0. 8 1. O左右，用5%蔗糖作对照。转 化时将花苞在溶液中浸泡5s左右，暗培养24h。转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥 苗子浇水至透。(3)将转化好的苗正常培养，每3d浇水1次。(4)收取转化拟南芥，烘干(37°C 24h)。用乙醇消毒后并撒于抗生素潮霉素筛选培 养基上，4°C春化2d，正常培养，一周后获得转化植株的Tl代幼苗。(5)将Tl代幼苗移到土中培养。(6) PCR鉴定其HYG基因的表达，样品分别为转基因和野生型的拟南芥基因组DNA。(6)鉴定后的植株⑶S显色(方法同前所述)。通过与未转基因的对照组相比，可看到转基因阳性植株在37°C高温处理Ih后⑶S 活性上升，但仅限于不到6d的小苗，6d后不进行处理，GUS活性也很高(图6)。花中，37°C 热激处理Ih后，萼片、花丝、柱头等部位GUS活性增强。果荚两端的GUS表达量在热激后也 会上升。转此基因的植株与野生型营养生长没有区别，生长良好。序列表<210>1
<211>1910<212>DNA<213> 月季<220><221>热激元件<222>(1804)·· (1817)<223><400>1
0095]ccaagattcactttagtgagccctattagatttaggctagaatatatatctttttaatta600096]tccgattcggcatttaatatttttaggctagttttacatttgttttaggattctttttat1200097]ttttaggttcttagtttccttttaaatttggatcctttaggattccttgttagattatga1800098]ttttaggtcttggatgcctatatatgcatcatcatgctttgtattagaatcagtttatca2400099]tatcaaattt3.3. 3.3.3.3.3. gagagttttttctcaagttctctggtggactctagattta3000100]tcgttttagagtatattgattgtaaacttaggttacttcagactttgtcaaattcaattt3600101]agttgctattttgtttgagcttgatacaataaagatatcggagaggtctgttttgtattt4200102]gatttgaaaaactcatgccatctcttgctctcactcttgcgaaccctcacaacgccgcca4800103]caggtttcaagcacgttgcgcacgatctcggtagcgcttctacctttcgcgatcacccaa5400104]aacgattgtgtatattgacctctcctttttgttggtttcctgatggtttcctttggcttt6000105]ctttaggctggagaggatggccatgaagagggcggctggagggtggccttcagtttcgat6600106]gggttggaactcagatggattggttgagaaggatggcgacgctatggattgtgagacttt7200107]tggccaggcagatgctgttggcagcatggggygcatatctgcctaggtttggtggcggtc7800108]tgcatcgcttaggtgtccacatcaagagcttgggcttcttggttgggctgtgtttggacc8400109]caaagtagatgagtgtccagataagaagatggattcttccaggtgtctaagggacttgga9000110]tttgggatccaggaggtttgctatatattctattcaatgtcatagttgttacttgtttgg9600111]gtgtgttgttcttaatttttggtaaagtgatgctctctatattctatgaagactctaatt10200112]ttagtttgaaattttgttgattgctctgctctttcttattgatataaataagaaaaataa10800113]ggacaaaatgttgcattattcgacattattatattaattgtgtatccaggtcattttttt11400114]ccaaacctttcacaacatgttttcggaccaaaaaataaagttaacatttttttttggata12000115]aatttcagtttagtaccccttgtgggtttgggggttatatcatgttagtccatgctcttt12600116]caatttgatcagtaacacccctgtgctttcaatttcaatcagccgtgcccaaatttactg13200117]ttccgtccaattttgaacgttaactttgactggattgacaaagtaaaatttagacgaaac13800118]agtaaaatttgggcacggctgattgaaattgaaagcacaggggtgttgttgatcaaattg14400119]aaagagcagacactgacatgatattaccccC3.3.3.CCCC3.3.ggtactaaattgaaatcaat15000120]CCttttttttttttgagaataaataaatgtcaacttatgtgagagtaaaatcccaagaaa15600121]agtatgagccaacgtttaattccgctccccatccctactctcatctgacttcaagagccc16200122]ataatgtaacctactttgggcccatatttttattctcaacattcctagacagtttcctga16800123]ccattcttccgttccattgtatgagcccacgattatggaacctactttcggccgactttc17400124]tcattctcaggagtcctggaaagttcgagagaacagaaaaacgttttcaagtccgagcat18000125]tctccagaagattcttgggtctccttataaatacgcatccaatcttcccgtccaatcacc1860
aaaccagtta agcaaatact caaacattct gatcgtgcaa tccattcaca1910
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
aggacaagaa cgacaagtgg20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
gtcatcttca atctcaacct20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
cgagagaagc agcggcaagt20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
cctcttcttt cttcagcccc20
权利要求
一种月季热激蛋白启动子，其特征在于，其核苷酸编码序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述月季热激蛋白启动子的克隆方法，其特征在于，该方法依次包括 如下步骤(1)取月季嫩叶，抽提DNA;(2)选择月季热激蛋白ORF中无酶切位点的限制性内切酶，对(1)所得DNA充分酶切， 酶切产物经沉淀纯化后环化自连；(3)根据月季热激蛋白ORF的序列，采用反式PCR方法克隆得到权利要求1所述的月季 热激蛋白启动子。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的月季嫩叶是温室中正常培养4周的月 季组培盆苗的嫩叶。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的月季热激蛋白ORF中无酶切位点的 限制性内切酶是 Bgl II、Apa I、BamH I、Sal I、Sph I、Sca I、Eae I、Hpa I、Not I、Rsa I 中的一种或者几种。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中利用反式PCR引物进行三轮PCR 扩增获得权利要求1所述的月季热激蛋白启动子。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，克隆此启动子的PCR酶为LATaq，bufTer为 GC缓冲液。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，克隆此启动子的PCR程序为94°C预变性 4min ；98°C变性10s，68°C复性及延伸15min，30个循环；最后72°C延伸IOmin0
8.含有如权利要求1所述月季热激蛋白启动子的重组载体。
9.如权利要求1所述月季热激蛋白启动子的应用，其特征在于，将所述启动子的重组 载体转入植物中，以便在热激条件下启动下游基因的表达。
全文摘要
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，涉及一种热诱导型启动子RcHSP17.8P核苷酸编码序列的克隆，此启动子重组表达载体的构建，以及转入草本植物的双子叶植物中启动下游蛋白表达的方法。本发明利用分子生物学方法分析该片段控制下的报告基因GUS的表达模式，结果表明产生的转基因拟南芥幼苗在37℃热激处理下诱导下游基因GUS的表达，并且表达活性随着发育时期而变化。本发明的月季启动子RcHSP17.8P将可作为一种有效的温度感应的生物传感器系统的基础。
文档编号C12N15/11GK101993870SQ20091005663
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月18日 优先权日2009年8月18日
发明者张璇, 明凤, 蒋昌华 申请人:复旦大学