专利名称：一种棉花生长点特异性启动子及其克隆和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物转基因技术领域，具体地说，本发明涉及一个新的棉花基因的特 异性启动子的克隆。
背景技术：
棉花是我国重要的纤维作物和主要的经济作物。以棉花为研究材料，利用转基因 技术提高棉花产量、质量和育种效率具有重要的实际意义。生长点是植物细胞不断进行分 裂增生的部位，位于根和茎的顶端。茎的生长点往往呈锥状，故又称“生长锥”。茎和根的生 长点分别是由胚芽和胚根的生长点发育形成的。健全的棉子，播种后如果条件适宜，就会吸水膨胀，通过内部一系列的酶促变化， 逐渐恢复旺盛的生命活动，开始进行胚细胞的分裂、伸长及分化，从形态上看有胚根的生长 及胚芽的伸长，这个过程叫萌发。一般要经历三个阶段吸胀阶段、萌动阶段和发芽阶段。 萌动阶段，胚不断吸收营养物质进行细胞分裂，胚根伸长，从珠孔突破种皮长出幼根；发芽 阶段，细胞继续分裂增生，胚轴向上生长，形成幼茎。生长点是种子萌发过程中细胞分裂和 增大的关键部位，细胞旺盛分裂的生长点有助于胚突破种皮，因此研究生长点基因的表达 对种子萌发具有重要意义。棉花的主茎是由胚芽发育而成的。胚芽顶端的分生组织不断地分裂分化形成主茎 的节与节间，叶原基与腋芽原基。叶原基将来长成叶片，腋芽原基变成叶枝或果枝。因此， 胚芽生长点是棉株地上部分各器官分化建成的总的发源地。棉花的主茎具有一个重要的特 性，就是具有无限生长习性。只要环境适宜，主茎生长点就能不断地分裂分化增长枝叶，其 中果枝的增加有助于棉花的产量增加。当然也不可以让主茎徒长而发生早衰、棉桃脱落，造 成减产。因此通过控制某种影响茎生长点细胞分裂分化的基因的表达有望通过增加果枝的 数量来提高棉花产量，具有重要的应用价值。在植物转基因工程研究中，目前大多数采用的是组成型启动子，如CaMV35S启动 子、玉米Ubiquitin启动子，但是这些启动子能够驱动外源基因在植物的所有组织和器官 中表达，造成能量浪费，给植物的正常生长发育带来很大负担。为保证植物的健康生长，在 转基因时，能够使所需基因在一定时期和一定的组织中表达非常重要。因此寻找时空特异 性启动子具有重要意义。
发明内容
基于上述的原因，本发明克隆了一个新的棉花MPK7基因的特异性启动子，该启动 子在特定时期驱动基因在植物细胞分裂分化的关键部位尤其是生长点特异表达。本发明 构建了该启动子和GUS报告基因的的植物表达载体，并转拟南芥。实验表明在种子萌发阶 段和幼苗期，该启动子驱动GUS基因在茎或根的生长点特异表达；而在繁殖期，所有器官和 组织中均无表达。6BA、GA、IAA等激素是在植物种子萌发和生长过程中起重要作用的的信 号分子，用上述激素对子叶期幼苗进行诱导，GUS染色表明该启动子的表达受上述激素的诱导。因此这一特异性启动子的克隆对研究植物种子萌发及生长，提高种子发芽率，控制植株 生长速度具有重要的实际意义和应用价值。该启动子能驱动GUS基因在植物种子萌发和生长时期在茎或根的生长点特异表 达，繁殖期无表达，其基因序列如Seq ID No:l所示。该启动子是在已得到的棉花GhMPK7基因的基因组序列(该基因其序列为如 Seq ID No :2所示)的基础上，通过反向PCR的方法，得到的1298bp的启动子序列，如 Seq ID No:l所示。通过PlantCARE软件和查阅资料对该启动子进行顺式作用元件分 析，有三个与细胞分裂素(6-BA)作用相关的CPBCSP0R元件(Naoki Fusada，2005，Plant Molecular Biology, 59 :631_645)，分别处于 _878—864bp、_860—866bp、-702—706bp 处；在-569—575bp和-405—412bp处分别有一个与赤霉素(GA)作用相关的元件，分别 是 TATCCA0SAMY 和 GARE10SREP1(Keita Sutoh and Daisuke Yamauchi，2003， The Plant Journal, 34 635-645)；有三种与生长素(IAA)诱导相关的元件分别是ARFAT、NtBBFl 禾口 TGA-element (Jennifer L.Nemhauser,2004, PLoS Biology, 9 1460-1471), ARFAT 在-1072—1078bp 处，在-316—322bp(_)，-354—360bp (-)，-417—423bp (-)各有一个 NtBBFl元件，TGA-element处于_148—154bp (-)；此外，增强转录水平的元件CAAT_box、 G-box(未标注)，胚乳表达所需的控制元件Skn-1-motif也是与信号转导途径密切相关的 顺式作用元件，元件的位置如附图2。为了完成该启动子的初步功能分析，本发明采用了花粉管通道法进行转基因，构 建了一种该启动子的植物真核表达载体，即用棉花GhMPK7基因的启动子序列取代pBI121 中的35S启动子，构建GUS融合基因，转化农杆菌，将该表达载体转拟南芥，具体方法是进行 花序侵染，即待拟南芥繁殖期开花时，配制侵染液，用农杆菌侵染花序。本发明在经过上述转基因后的拟南芥的不同发育时期检测了 GUS活性，并用不同 的条件进行诱导，研究该启动子驱动基因的表达情况，具体如下本发明分别取种子发芽时期、幼苗生长时期、繁殖期的转基因拟南芥，通过现有的 方法检测⑶S基因的表达情况。本发明发现，在种子发芽时期，在茎和根的生长点有⑶s基 因的表达(图4A、B)；在幼苗生长时期，在茎生长点检测到有⑶S基因活性(图4C、D)；在 繁殖期，所有组织器官中均无⑶S基因的表达。由此可见，本发明克隆所得的棉花GhMPK7 基因的启动子具有不同生长发育时期的表达特异性，即时间表达特异性。同时发明人发现该启动子具有生长点特异性，并且根据对启动子顺式作用元件的 分析，发现该启动子具有ABA、GA、6BA、IAA等激素的响应元件，而上述的激素是几种与植物 细胞分裂、分化及凋亡相关的激素，因此我们选用上述激素对转基因拟南芥幼苗诱导，分析 本发明克隆的启动子的功能。无诱导条件下，GUS基因只在茎的生长点有表达(图5A、B)。 在转基因拟南芥子叶期对其进行诱导，具体结果如下ABA诱导后，进行GUS组织化学染色， 发现⑶S基因在茎和叶脉中表达，并且在茎中的表达量很高；不同的赤霉素(GA)生物活性 不同，GA3的活性最高，用GA3诱导后，在子叶和茎的生长点检测到GUS活性(图5C、D) ；6BA 诱导，⑶S基因只在茎的生长点高效表达(图5G、H) ；IAA诱导，发现⑶S基因仍在茎的生长 点高效表达，在茎中其它部位也有表达(图5E、F)。因此本发明指出该启动子驱动基因的 表达具有组织特异性，并且是一种激素诱导型启动子。通过上述的实验，发明人证实了，通过本发明克隆所得的特异性启动子，在生长点特异表达，又由于ABA、GA、6BA、IAA这些激素对植物种子的萌发、芽的生长和茎的伸长有重 要作用，因此该启动子影响着棉花种子的发芽、芽和子叶的生长及茎的生长速度。因此，本 发明所克隆的启动子在植物生长点的特异表达，有望在提高种子发芽率中应用；构建该启 动子和相关基因的表达载体，调控植株茎的生长速度，可能会影响棉花及其它作物的结实 率；该启动子是一个时空特异性表达和诱导型的启动子，因此该启动子的克隆对植物转基 因技术领域启动子的研究也具有重要意义。
图1 扩增的棉花GhMPK7基因启动子的电泳图(A为目的片段，B为2kb的 Marker)；由图中可知，扩增得到的序列为1298bp，包括1223bp的启动子序列和部分5’非编 码区序列。图2 棉花GhMPK7基因特异性启动子区域可能的顺式作用元件及扩增转基因序列 所用的引物；图3 棉花GhMPK7基因启动子序列与GUS基因的融合表达载体的构建流程图；图4 转基因拟南芥不同生长发育时期的GUS活性检测图；图中可见，在种子发芽时期，在茎和根的生长点有⑶S基因的表达(图4A、B)；在 幼苗生长时期，在茎生长点检测到有GUS基因活性(图4C、D)；图5 不同诱导条件下，转基因拟南芥中GUS活性检测图；图5中可见无诱导条件下，⑶S基因只在茎的生长点有表达(图5A、B)；在转基因 拟南芥子叶期对其进行诱导，具体结果如下ABA诱导后，进行GUS组织化学染色，发现GUS 基因在茎和叶脉中表达，并且在茎中的表达量很高；不同的赤霉素(GA)生物活性不同，GA3 的活性最高，用GA3诱导后，在子叶和茎的生长点检测到GUS活性(图5C、D) ；6BA诱导，GUS 基因只在茎的生长点高效表达(图5G、H) ；IAA诱导，发现GUS基因仍在茎的生长点高效表 达，在茎中其它部位也有表达(图5E、F)。
具体实施例方式本发明的实施步骤是根据棉花GhMPK7基因的DNA序列用反向PCR的方法克隆 得到该基因的启动子序列一启动子顺式作用元件分析及功能预测一设计带有酶切位点 Hindi 11和BamH I的引物从DNA上扩增得到目的启动子序列一用同样的酶Hindi 11和BamH I酶切pBI121 —连接目的片段和酶切的PBI121 —转拟南芥一⑶S组织化学染色检测⑶S 活性，分析启动子功能。本实施例中的其他技术均采用已有技术。实施例1棉花GhMPK7基 因启动子的克隆1. 1基因组DNA的提取l、5ml 提取buffer (lOOmM Tris,500mM NaCl,50mM EDTA，高压灭菌后 4°C用)中加 入40 ill 巯基乙醇，冰浴；2、称取lg幼嫩叶片，在液氮中研磨，快速转移到提取buffer中，涡旋混勻；3、加入 2ml 10% SDS，65°C水浴 lOmin ；4、加入 5ml 5M KAC,混勻，冰水浴 20min ；
5、4°C，llOOOrpm 离心 20min ；6、上清用无菌纱布过滤，加入10ml异丙醇充分混勻，_20°C放置30min ；7、4°C，llOOOrpm 离心 15min，弃上清；8、沉淀用 700 ill 溶解 buffer (50mM Tris, 10mM EDTA，高压灭菌后 4°C 保存)悬 浮；9、移入 1. 5ml eppendorf 管，加入 5 u 1 RNase A, 37°C温育 30min ；10、加入等体积苯酚氯仿异戊醇(25 24 1)，混勻，4°C，12000rpm离心 lOmin ；11、取上清，加入等体积的氯仿异戊醇(24 1)，混勻后4°C，12000rpm离心 5min ；12、取上清，加入1/10体积的3M NaAC和lml异丙醇，_20°C放置2h ；13、4°C，12，OOOrpm 离心 lOmin,弃上清；14、70%乙醇洗涤沉淀，室温干燥；15、60 ill TE 溶解沉淀，测 0D260，_20°C 保存。1. 2棉花GhMAPK7基因启动子的克隆该启动子的克隆是采用反向PCR(I-PCR)的方法。分别用六种核酸内切酶酶切棉 花总 DNA，这六种酶分别是 EcoR I，Kpnl, Sea I，Xba I，Xho I，Bgl II，Pst I, Vsp I，用 大连宝生物公司生产T4连接酶将酶切后的产物连接成环，以连接好的产物为模板扩增棉花 GhMPK7基因的启动子序列。酶切体系为80 ill 15iil的DNA，3iil酶，8iilBuffer (根据 每种酶说明书上有相应的各种Buffer)，54 ill ddH20 ；十二小时之后补酶1 yl。连接体系 为 20 ill 2111的酶切的0嫩，4111的5\1^吐€61~，2111114连接酶，12111 ddH20 ；常温连 接10分钟。用酶Sea I酶切连接的模板扩增出了一段GhMPK7基因启动子序列，第一轮PCR所 用的一对外侧引物是Supl和Sscal，第二轮PCR用的一对内侧引物是Sup2和Ssca2，得到 980bp的启动子序列。利用得到的这段启动子序列设计引物，所用模板是内切酶Vsp I所酶 切连接的环状DNA，第一轮PCR所用的一对外侧引物是Sup3和Svspl，第二轮PCR用的一对 内侧引物是Sup4和Svsp2，得到另外318bp的启动子序列；因此共得到1298bp的启动子序 列。启动子的克隆所需的引物如下表
6 1. 3棉花GhMPK7基因启动子序列的扩增设计克隆GhMPK7基因启动子所需引物引物 Szl (上游序列)序列如 Seq ID No 11 所示，AAGCTTAATAAATTACGTCCGCGAC ；弓| 物Szxl(下游序列)序列如Seq ID No: 12所示， GGATCCACTTTGAGATCATTCCACCAC ；引物Szl中的AAGCTT为Hindlll的酶切位点，引物Szxl中的GGATCC是BamHI的 酶切位点，下划线的部分是启动子序列。利用引物Szl和引物Szxl，以棉花DNA为模板将该 启动子从棉花基因组中扩增出来，扩增片段为1298bp，序列如序列表中SED ID NO. 1。体系如下 反应程序为预变性94°C，5min ；变性94°C，40s，退火52°C，40s，延伸72°C，lmin20s, 35 个循环；后延伸 72°C，lOmin。反应结束后，的琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小正确，回收目的片段，如图 1。实施例2植物表达载体的构建与转化2. 1棉花GhMPK7基因启动子序列与⑶S报告基因的融合选择pBI121作为植物表达载体，将PCR扩增得到目的片段酶切，电泳并胶回收。同 时用限制性内切酶Hindlll和BamHI酶切表达载体，并回收载体片段。连接基因片段与载 体片段，利用菌落PCR及质粒酶切方法筛选pBI121-GhMPK7启动子。具体过程可参考附图 31、用带有酶切位点的引物Szl和Szxl扩增棉花GhMPK7基因的启动子序列，并凝 胶电泳分离和回收目的片段。2、用Hindlll和BamH I双酶切回收目的片段和植物表达载体pBI121。3、回收进行琼脂糖凝胶电泳，切下含有GhMPK7启动子序列的DNA片段和pBI121 载体片段。4、连接，连接体系如下
10 x ligation Buffer l|ilGhMAPK7总动子4卩 1 PBI121 4^1 T4 DNA连接酶 lpl混勻后16 °C连接过夜。5、转化取5iU连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，菌液涂布于含卡那霉 素的固体培养基平板上；6、重组子的筛选对长出的菌落进行PCR及质粒的Hindlll和BamH I双酶切鉴定。2. 2农杆菌感受态细胞的制备1、挑取单菌落LBA4404，接种于5ml加有50mg利福平(Rifampicin)的液体LB培 养基中，28 °C，200rpm,过夜培养。2、取2ml培养物至液体LB培养基中，继续培养至0D800为0. 5左右。将培养物冰 浴 30min, 4°C, 5，OOOrpm,离心 5min。3、弃上清。用 10ml 0. lmol/L 冷的 NaCl 悬浮菌体；4°C，5, OOOrpm，离心 5min。4、弃上清，lml 20mmol/L冷的CaCl2悬浮，分装成50111/ ，液氮中速冻后，-801保存。2. 3冻融法转化农杆菌1、冰上融化农杆菌LBA4404感受态细胞，加入3iU带有目的片段的pBI121质粒， 冰冻30min，液氮中冷冻lmin，然后在37°C水浴5min。2、加入lml无抗生素的YEP培养基，28°C，200rpm,振荡培养3h。3、10，OOOrpm离心lmin以浓缩菌液，用100 u 1 YEP回溶菌体。
4、将回溶后的菌体涂于附加50mg/L卡那霉素(Kanamycin sulfate)和100mg/L 利福平的固体YEP培养基上，28°C下培养2-3d。5、酶切及PCR鉴定阳性菌落。2. 4农杆菌介导转化拟南芥农杆菌的培养从-80°C冰箱中取出所要的菌种，在冰浴中融化。分别取30 yl的 农杆菌接种于5ml的YEP培养基(100mg/L利福平，100mg/L卡那霉素)，28°C，200rpm过夜 培养。然后在附加50mg/L卡那霉素和100mg/L的固体YEP培养基上划板，以便将来挑单菌 落所用。侵染液的配制配制15ml侵染液，需加入0.81g蔗糖，加3. 6 ill sliwet。花序侵染挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那 霉素的YEP培养液中，28°C，250rpm,振荡培养约48h，至对数生长后期；将菌液用MS培养液 稀释10倍，待用。将拟南芥种子播种于MS基本培养基中，待种子萌发长出子叶后，移入蛭石 中，浇营养液，等待拟南芥开花。将摇好的菌液放入80ml大离心管中，5，500rpm离心7min ； 去上清，用侵染液5ml将沉淀重悬，稍震荡。将所有花序侵入约5S，时间过长花序容易死掉， 过短则侵染不上。2. 5转基因植株的鉴定待花序侵染的拟南芥接种后，将拟南芥种子播种于加有卡那霉素的MS培养基中 筛取转基因的拟南芥种子，能在加有卡那霉素的MS培养基中萌发生长的拟南芥种子，可初 步确定为转基因的拟南芥。种子萌发长出子叶后，移入蛭石中，浇营养液。为进一步鉴定所 得到的植株为转基因的植株，取每个植株的的一片小叶分别用微量法提取DNA，通过PCR的 方法进行转基因鉴定。所用引物和程序如扩增启动子时所用引物和程序，得到目的片段，连 接转化后，取阳性克隆，经测序证明所得植株中确实转入了该发明所克隆的启动子。实施例3对不同时期的转基因植株进行GUS活性组织化学染色3. 1⑶S活性组织化学染色的方法1、样品放入冰水混合物冰浴两分钟；2、将样品用滤纸吸干水，放入染色瓶中，加入90%丙酮浸过样品lOmin ；3、用buffer迅速清洗一遍倒掉；4、加入GUS染色液冲洗两遍，每遍5min，轻摇；5、抽气 2 次 lOmin ；6、37 °C恒温保存过夜。用显微镜观察。3. 2⑶S 染色 Buffer 配方
ddH20 定容至 100ml。3. 3GUS染色液配方用800 u 1DMS0 溶解 lOOmg 的 X-GluC，加入⑶S 染色 buffer 定容至 100ml。3. 4对不同时期的转基因植株进行GUS活性组织化学染色分别在转基因拟南芥的种子萌发阶段、幼苗期及繁殖期进行GUS活性组织化学染 色，发现在种子萌发阶段和幼苗期，该启动子驱动GUS基因在茎或根的生长点特异表达(如 图4)；而在繁殖期，所有器官和组织中均无表达，可见其为时间表达特异性启动子。实施例4对转基因拟南芥诱导的方法通过喷洒的方法将ABA、GA、6BA、IAA等激素喷洒到子叶期转基因拟南芥叶片上，6 个小时后取样，进行GUS活性组织化学染色；其具体结果如图5所示，由图中内容可见本发 明所得的启动子驱动基因的表达具有组织特异性，并且是一种激素诱导型启动子。<110>山东农业大学<120> 一种棉花生长点特异性启动子及其克隆和应用<160>12
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权利要求
一种棉花生长点特异性启动子的克隆及其应用，其特征在于该启动子的基因序列如Seq ID No1所示。
2.根据权利要求1所述的棉花生长点特异性启动子的克隆及其应用，其特征在于该 启动子能驱动GUS基因在植物种子萌发和生长时期在茎或根的生长点特异表达。
3.根据权利要求1或2所述的棉花生长点特异性启动子的克隆及其应用，其特征在于 该启动子是在棉花GhMPK7基因的基因组序列的基础上，通过反向PCR的方法获得的，所述 的GhMPK7基因其序列如Seq ID No 2所示。
4.根据权利要求1或2所述的棉花生长点特异性启动子的克隆及其应用，其特征在于 该启动子为是激素诱导型启动子，具有ABA、GA、6BA、IAA中各种激素的响应元件。
5.根据权利要求1或2所述的棉花生长点特异性启动子的克隆及其应用，其特征在于 该启动子具有时间表达特异性。
6.根据权利要求1。利用类似方法在棉花及其他植物中克隆MPK7基因启动子的同源 序列在权利要求范围之内。
7.根据权利要求2。利用该启动子构建的各种基因的植物表达载体。
8.根据权利要求2。利用该启动子序列与其他启动子组合构建任何基因的植物表达载 体也在权利范围要求之内。
9.如权利要求1所述的启动子，其应用于提高种子发芽率、调控植株茎的生长速度以 及影响棉花及其它作物的结实率。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，克隆了一个新的棉花MPK7基因的特异性启动子，该启动子在特定时期驱动基因在植物细胞分裂分化的关键部位尤其是生长点特异表达。本发明构建了该启动子和GUS报告基因的的植物表达载体，并转拟南芥。实验表明在种子萌发阶段和幼苗期，该启动子驱动GUS基因在茎或根的生长点特异表达；而在繁殖期，所有器官和组织中均无表达。6BA、GA、IAA等激素是在植物种子萌发和生长过程中起重要作用的的信号分子，用上述激素对子叶期幼苗进行诱导，GUS染色表明该启动子的表达受上述激素的诱导。因此这一特异性启动子的克隆对研究植物种子萌发及生长，提高种子发芽率，控制植株生长速度具有重要的实际意义和应用价值。
文档编号A01H5/00GK101875932SQ200910230310
公开日2010年11月3日 申请日期2009年11月10日 优先权日2009年11月10日
发明者于菲菲, 张良, 石静, 郭兴启 申请人:山东农业大学