肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体， 还涉及该siRNA表达载体的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] RNAi是在生物进化上高度保守的特异性转录后基因沉默过程，并已经成为强大的 基因操作工具。它几乎可以用来研宄任何一种基因的分子途径以及表型和基因型之间的关 系。但仍存在些许不足之处，如RNAi时间和空间上的不可控性及非靶向性，上述不足严重 限制了RNAi在基因治疗领域中的广泛应用。因此，RNAi在时间和空间上的不可控性以及 非靶向性是需要亟待解决的难题。诱导型RNAi技术可以通过诱导物介导shRNA的表达进 而实现对靶基因的有效调控，因此也成为了近些年RNAi技术的研宄热点。目前所存在的诱 导型RNAi系统主要包括两大类：一种是利用已经构建成熟的调控系统（例如：Tet-〇n和 Tet-off)，另一种是基于胁迫诱导型PolII类启动子（如HSP70)。相比较而言，前者成本 高，耗时长，调控系统比较复杂，不可控因素较多，其中诱导药物对细胞的毒性较大。而后者 可直接在外界因素（如：缺氧、热激和冷激）的刺激下实现对目的基因的调控，操作简单，成 本较低，同时对细胞无明显损伤，但是胁迫诱导型PolII类启动子受外界因素调控，并不具 有靶向性，同样不能满足RNAi在基因治疗领域中的应用。
[0003] 因此，急需一种在时间和空间上可调控的靶向RNAi表达载体，为RNAi在基因治疗 领域中应用奠定基础。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供肿瘤特异性和可热调控的SiRNA表达载 体；本发明的目的之二在于提供肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的制备方法；本 发明的目的之三在于提供肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0006] 肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体，所述siRNA表达载体含有由肿瘤特异 性启动子和热休克元件调控表达的siRNA表达框。
[0007] 优选的，所述肿瘤特异性启动子为人端粒酶逆转录酶启动子，其核苷酸序列如SEQ IDNO. 3 所示。
[0008] 优选的，所述热休克元件为HSE(MN)或HSE(XY)，所述HSE(MN)的核苷酸序列如SEQ IDNO. 4所示，所述HSE(XY)的核苷酸序列如SEQIDNO. 5所示。
[0009] 优选的，所述siRNA表达框如SEQIDNO. 6所示。
[0010] 2、所述肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体的制备方法，包括如下步骤：
[0011]a.以SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示序列为引物克隆人端粒酶逆转录酶启动 子，然后合成热休克元件，所述热休克元件的核苷酸序列如SEQIDNO. 4或SEQIDNO. 5所 示；
[0012] b.将步骤a克隆的人端粒酶逆转录酶启动子和热休克元件替换pMHSP70psil质粒 的HSP70启动子，所述热休克元件位于所述人端粒酶逆转录酶启动子的5'端；再将SEQID NO. 6所示序列连入启动子的3'端，得肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体。
[0013] 优选的，步骤a中，克隆人端粒酶逆转录酶启动子的扩增条件为95°C预变性5min ; 95°〇变性3〇8,56°0退火3〇8,721：延伸3〇8,30个循环；最后721：延伸1〇111111，41：保存。
[0014] 3、所述肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载体构建靶向干扰肿瘤治疗基因表 达的载体中的应用。
[0015] 优选的，所述肿瘤治疗基因为SNCG基因。
[0016] 本发明的有益效果在于：本发明公开了肿瘤特异性和可热调控的siRNA表达载 体，该载体具有如下优点：
[0017] 1)具有良好的肿瘤特异性，从而可以降低其对正常细胞产生的毒副作用；
[0018] 2)由hTERT和热休克元件HSE启动子调控的siRNA本底表达水平很低，具有较强 的热诱导性；
[0019] 3)由hTERT/HSE启动子调控的siRNA表达载体在热激的条件下可高效率地敲除目 的基因，由于本发明是用热来控制siRNA的表达而不是传统的外源诱导物，因此避免了免 疫反应。
【附图说明】
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0021] 图 1 为pHSP70-EGFP、phTERTp-EGFP质粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/ HSE(XY)p-EGFP质粒在人永生化表皮细胞（HaCaT)和人正常肝细胞（HL7702)细胞中荧光分 布情况。
[0022] 图 2 为pMHSP70psil、phTERTp-EGFP质粒、phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒和phTERT/ HSE(XY)p-EGFP质粒在人永生化表皮细胞（HaCaT)和人正常肝细胞（HL7702)细胞中EGFP 蛋白表达情况。
[0023] 图3为表达siRNA的质粒表达框结构图。
[0024] 图 4 为pMhTERTppsil质粒、pMhTERT/HSE(MN)ppsil质粒和pMhTERT/HSE(XY) ppsil质粒结构图。
[0025] 图5为SqRT-PCR和Western-blot检测IfepG2细胞中不同处理组SNCG基因含量； a为在H印G2细胞中通过SqRT-PCR检测SNCG基因的沉默效果；b为用柱形图显示SNCG基 因在RNA水平上的表达差异（均值土标准差，n= 3, *p〈0. 01)，Control组是指空白对照 组，Mockcontro1是指只在细胞中加入转染试剂，pMhTERTpsi1组是本实验中的阴性对照组 即不含有热休克元件组；c为在H印G2细胞中通过Western-blot检测SNCG基因的沉默效 果。
[0026] 图6为SqRT-PCR技术检测MCF-7细胞中不同实验组SNCG基因含量；a为在MCF-7 细胞中通过SqRT-PCR检测SNCG基因的沉默效果，b为用柱形图显示SNCG基因在RNA水平上 的表达差异（均值土标准差，n= 3，*p〈0. 01)，Control组是指空白对照组，Mockcontrol 是指只在细胞中加入转染试剂，pMhTERTpsi1组是本实验中的阴性对照组即不含有热休克 元件组）。
【具体实施方式】
[0027] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0028] 实施例1、克隆人端粒酶逆转录酶（hTERT)启动子
[0029] 根据人端粒酶逆转录酶（hTERT)基因启动子序列（Genbank:AF325900)设计克隆 hTERT启动子的引物，具体如下：
[0030]上游引物：5' -ggaagatctgattcgcgggcacagacg-3'(SEQIDNO.1)，下划线为 Bglll酶切位点；
[0031]下游引物：5' -cggggtaccccacgtgcgcagcaggac-3'(SEQIDNO. 2)，下划线为 Kpnl酶切位点。
[0032] 然后以乳腺癌细胞株MCF-7基因组为模板，SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示序列 为引物进行PCR扩增，PCR扩增条件为95°C预变性5min;95°C变性30s，56°C退火30s，72°C 延伸30s，30个循环；最后72°C延伸lOmin，4°C保存，将扩增产物切胶回收，获得hTERT启动 子，其核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0033] 实施例2、合成热休克元件（HSE)
[0034] 人工合成HSE(MN)和HSE(XY)序列，具体如下：
[0035]HSE(MN)序列为：5' -gaaggttcatttgaaggttcatttgaaggttc-3'（SEQIDNO. 4);
[0036]HSE(XY)序列为：5' -agaacgttctagaacgttctagaacgttcttctagaacgttct-3'（SEQ IDNO. 5) 〇
[0037] 然后设计根据hTERT启动子序列和HSE(MN)与HSE(XY)的序列，设计含hTERT和 HSE的启动子hTERT/HSE(MN)与hTERT/HSE(XY)的上游引物，具体引物如下：
[0038]hTERT/HSE(MN)启动子上游引物：5'-ggaagatctgaaggttcatttgaaggttcatttgaa 区区1:1:。831:1:。8。888。3。383。8-3'(5￡(>)10勵.6)，下划线为1^111酶切位点，黑体为批￡(1?);
[0039]hTERT/HSE(XY)启动子上游引物：
[0040] 5'-cggKgtaccagaacgttctagaacgttctagaacgttcttctagaacgttctccacgtgcgcagc aggac-3'(SEQIDNO. 7)，下划线为Bglll酶切位点，黑体为HSE(XY)。
[0041] 然后分别以SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7为上游引物，SEQ ID NO. 2为下游引物， 进行PCR扩增，分别获得hTERT/HSE (MN)启动子和hTERT/HSE (XY)启动子。
[0042]实施例3、构建phTERTp-EGFP和phTERT/HSEp-EGFP质粒
[0043] 1、构建phTERTp-EGFP质粒
[0044] 将实施例1克隆hTERT启动子用Bglll和Kpnl双酶切，回收目的片段，然后用 Bglll和Kpnl双酶切pHSP70_EGFP质粒（构建方法参见YiLiao,JianguoFeng,Qian Yi,HanweiCui,LingHeandLilingTang*.AsiRNAsystembasedonHSP70promoter resultsincontrollableandpowerfulgenesilencingbyheat-induction. BiotechnologyProgress. 2013 ;29 (5) : 1289-97)，回收骨架载体，将回收的目的片段和骨 架载体用T4连接酶连接，从而成功获得phTERTp-EGFP质粒。
[0045] 2、构建phTERT/HSE(MN)p-EGFP质粒
[0046] 将实施