用于调节肿瘤特异性表达的组合物和方法

专利名称：：用于调节肿瘤特异性表达的组合物和方法1.引言本发明涉及控制一种肾细胞癌相关蛋白MN-CA9表达的启动子、增强子和其它调节元件。具体地说，本发明涉及包含来自控制MN-CA9表达的5’调节区的核苷酸序列及其转录活性片段的组合物。特别提供其中MN-CA9启动子能够控制一种异源基因的表达、能够过量表达一种内源基因或一种病理过程的抑制剂、或者能够使一种在癌症发生和/或发展中被认为是重要的特定基因的表达失效的表达载体、宿主细胞和转基因动物。本发明也涉及使用所述载体、细胞和动物来筛选作为癌症发生和/或发展之激动剂和拮抗剂的候选分子的方法。本发明也涉及用于调节与癌症发生和/或发展有关的化合物之表达的组合物和方法。另外，本发明涉及筛选在癌症发生和/或发展期间调节表达的化合物。也提供应用通过筛选测定而鉴定的分子与化合物进行治疗性治疗的方法。本发明另外涉及包含MN-CA9启动子及其转录活性片段的组合物与方法，所述启动子及其活性片段能够以组织特异性方式选择性地启动异源基因的表达。更详细地讲，所述启动子能够选择性地在各种各样的肿瘤内增强异源基因的表达。因此，由于本发明启动子的组织特异性，故可以使治疗基因的传递靶向癌细胞，而用不着向正常的非肿瘤细胞传递治疗基因。此外，组织特异性表达提供附加的、便于给予治疗基因的有利条件，所述给予治疗基因即不仅通过直接应用例如通过注射给予治疗基因，而且通过静脉内给予、口服给予或诸如此类地系统性给予治疗基因；因为基因的表达将被限制和定位于特定的细胞类型。2.发明背景2.1基因治疗体细胞基因治疗是一种用于治疗目的的策略，在这种策略中一般以DNA形式给予核酸从而改变靶细胞的所有遗传组成部分。虽然在实验性基因治疗方面的研究是一个相对的年轻领域，但是在最近十年期间，已取得了重要的进展(Arai，Y.等，1997，OrthopaedicResearchSociety，22-341)。体细胞基因治疗治疗人类疾病的潜力已激发了许多科学家的想像，主要是因为两种新技术进步。首先，有许多能在实验动物中于体内有效转移及表达基因的病毒和非病毒基因治疗载体。其次，加强对人类基因组计划的支持，将在不久的将来，为构成人类基因组的推算的80,000个基因的标识与测序创造条件。最初设想基因治疗为一种用于矫正遗传缺陷以传递功能活性的治疗基因到靶细胞中的特定基因替代疗法。对体细胞基因治疗的最初尝试依靠将基因引入到组织中的间接手段，称为离体基因治疗；例如，从机体中取出靶细胞，用携带重组基因的载体转染或感染，并重新植入到所述机体中去(“自体细胞转移”)。各种各样的转染技术通常是可用的，且使用各种各样的转染技术在体外将DNA转移到细胞中去；所述技术包括磷酸钙-DNA沉淀、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔、脂质体介导的DNA转移或用重组病毒载体的转导。已提出了将DNA转移到各种各样不同细胞类型中去的这样的离体处理方案，所述各种各样不同细胞包括上皮细胞(美国专利4,868,116；Morgan和MulliganWO87/00201；Morgan等，1987，Science2371476-1479；Morgan和Mulligan，第4,980,286号美国专利)、内皮细胞(WO89/05345)、肝细胞(WO89/07136；Wolff等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA843344-3348；Ledley等，1987Proc.Natl.Acad.Sci.845335-5339；Wilson和Mulligan，WO89/07136；Wilson等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.878437-8441)、成纤维细胞(Palmer等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA841055-1059；Anson等，1987，Mol.Biol.Med.411-20；Rosenberg等，1988，Science2421575-1578；Naughton和Naughton，第4,963,489号美国专利)、淋巴细胞(Anderson等，第5,399,346号美国专利；Blaese，R.M.等，1995，Science270475-480)以及造血干细胞(Lim，B.等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868892-8896；Anderson等，第5,399,346号美国专利)。近来，已尝试了用包封在脂质体中的DNA制剂(Ledley等，1987，J.Pediatrics1101)、用包封在含有病毒被膜受体蛋白中的DNA制剂(Nicolau等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A801068)和偶联到聚赖氨酸-糖蛋白载体复合物上的DNA进行体内直接基因转移。另外，已运用了“基因枪”将基因传递到细胞中(第9068389号澳大利亚专利)。甚至有人推测可以裸露的DNA或与脂质体结合的DNA配制到液体载体溶液中，供注射到胞间隙中，以转移DNA到细胞中去(Felgner，WO90/11092)。对于像囊性纤维化和癌症这样的不同疾病，利用基因治疗技术的许多临床试验正在进行中。虽然可以在于临床背景下成功应用这项技术之前仍有许多必须越过的障碍；但是这种治疗方法在显著改善医学实践方面的前景得到了广泛的支持。或许，不管是离体还是体内，与当前设计的基因治疗有关的最大的问题之一，是不能控制靶基因的表达以及不能将靶基因的表达限制于达到有益治疗效果所需的一种或多种细胞类型。已充分地认识到传递有毒的治疗基因到肿瘤细胞中且在肿瘤细胞中通过使用组织特异性启动子而表达有毒的治疗基因的理念。当载体(病毒、脂质体等等)基因的传递导致既感染正常细胞、又感染癌细胞时，这种方法则减少治疗基因对邻近正常细胞的毒性作用。实例包括应用甲胎蛋白启动子以靶向肝癌细胞(Koryama等，1991，CellStruct.Punct.，16503-510)、对于胃癌应用癌胚抗原(CEA)启动子(Tanaka等，1996，CancerResearch，461341-1345)、应用酪氨酸酶启动子杀伤黑素瘤细胞(Vile等，1994，CancerResearch，546228-6234)、对于脑应用骨形态发生蛋白启动子以靶向神经胶质瘤细胞(Shimizu，K.1994，NipsonRinsbo，523053-3058)、以及应用骨钙蛋白启动子以杀伤骨癌和前列腺癌(Ko，S.等，1996，CancerResearch，564614-4619；Gardener等，1998，GeneTherapyandMolecularBiology，241-58)。现在越来越频繁地使用分子治疗策略，例如通过使用组织限制性启动子和肿瘤限制性启动子的基因治疗。基因治疗方法的关键部分包括i)选择合适的组织特异性启动子或肿瘤限制性启动子，在某些情况下，所述启动子可以可由一种激素、维生素、一种抗生素、药物或重金属诱导；ii)选择治疗(或毒性)基因；iii)合适的载体，例如反转录病毒、腺病毒、脂质体等等。靶向合适的肿瘤组织而不损害正常宿主组织的关键是可以仅将治疗基因导向那些使用所挑选启动子的启动子。2.2MN-CA9蛋白的表达有人认为称为MN-CA9的蛋白产物是具有胚胎起源性质的，且可以解释具有这种表型表达的肿瘤的某些强转移行为。实质上，该基因产物的表现类似于胎儿癌基因，潜在地给予细胞局部发展、侵染以及转移到周围及远端器官的能力。免疫荧光和免疫电镜术的研究揭示了，MN-CA9具有54kd和58kd的分子量，并且该蛋白既存在于质膜上、又存在于细胞核中。免疫组织化学研究进一步揭示了，例如由宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌产生MN-CA9蛋白。此外，在正常的宫颈组织、卵巢组织或肾组织中不表达该蛋白。仅在今年，预期在美国的肾细胞癌、胃癌和结肠癌以及宫颈癌的新病例分别大约是30,000例、21,900例、12,800例。此外，预计这些癌症导致美国国内11,900人、13,500人及4,800人死亡。这种高死亡百分率与常常伴随这些特殊癌症发生的转移性疾病的发展有关。另外，如果考虑世界范围的由于这些癌症引起的死亡率，则这些数目急剧地增加。所有这些癌症都有最终的高死亡率及显著的发病率。例如，对于肾细胞癌，大约50％诊断有癌症的患者发生转移性疾病且通常是不可救药的。因此，由于当前在治疗包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌、胃癌和结肠癌的各种各样癌症方面的不足；因而对这些癌症，急需新的治疗方法。本发明满足这些需要且提供一种用于调节、诊断和/或治疗这样的癌症的有用模型。3.发明概述在这里公开的本发明提供一种用于肿瘤特异性基因转录的模型。本发明部分基于本文描述的一种新的MN-CA9启动子的功能特性描述，所述启动子是一种仅在各种各样癌中发现有活性的启动子；所述的各种各样癌包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌。本发明提供用于筛选调节癌症发生和/或发展期间化合物表达的化合物的组合物和方法。具体地说，本发明提供包含控制癌相关蛋白MN-CA9表达、来自MN-CA9的5’调节区的核苷酸及其转录活性片段、以及在高度严格条件下和中等严格条件下与这样的核苷酸杂交的核酸的组合物。特别提供包含可操作地与一个异源报道基因连接的MN-CA95’调节区及其转录活性片段的表达载体，以及提供含有这样载体的宿主细胞和转基因动物。本发明也提供使用这样的载体、细胞和动物来筛选作为各种各样癌之激动剂和拮抗剂的候选分子的方法。同样，提供应用所述筛选测定而鉴定的分子与化合物进行治疗处理的方法。例如(但不是作为限制)，将包含一个报道基因的组合物可操作地连接到本文称为MN-CA9调节区的一种肿瘤特异性调节序列上。该MN-CA9驱动的报道基因在动物中作为转基因表达。可以使用所述转基因动物以及来源于所述转基因动物体内的癌细胞的细胞，来筛选作为可用于调节各种各样癌的候选物的化合物。虽然不希望受任何特定理论所约束，但这样的分子可能既干扰反式作用因子例如转录因子的功能，又干扰顺式作用元件例如与各种各样癌有关的启动子和增强子的功能。照这样，它们可能是用于治疗这样癌症的强有力的候选物；所述癌症包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌、胃癌和结肠癌、以及任何其它产生MN的肿瘤。在一个实施方案中，本发明提供高通量地筛选调节肿瘤细胞内基因特异性表达的化合物的方法。在本发明的这一方面，从转基因动物体中取出来自癌组织的细胞，并在体外培养所述的细胞。利用报道基因的表达来监测肿瘤特异性基因的活性。在一个特定的实施方案中，绿色荧光蛋白(GFP)为报道基因。在另一个实施方案中，萤火虫荧光素酶是所述的报道基因。可以进一步测试用这种方法鉴定的化合物对正常动物中的非癌细胞的作用。在另一个实施方案中，可以用本发明的转基因动物模型来进行体内筛选，以研究候选药物对癌细胞上作用的作用机制。具体地说，可以分析所述药物对包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌的各种各样癌的作用。在另一个实施方案中，提供一种用于治疗癌症发生和/或发展的基因治疗方法。使用MN-CA9调节序列来驱动药物或毒素的肿瘤特异性表达；且将MN-CA9调节序列引入到各种各样的癌细胞中。该方法包括将可操作地与一种药物或毒素基因连接的MN-CA9调节序列引入到癌细胞中。本发明另外提供用于筛选调节MN-CA9调节序列的新的转录因子的方法。可以把用这种方法鉴定的这样的新转录因子用作治疗各种各样癌症的靶。4.附图简述图1从1到540碱基对的MN启动子序列。在该图内也指出了所述启动子序列内的限制性酶切位点。图2A-2CMN-CD(图2A)、MNSP-CD(图2B)及MN-Ela(图2C)重组腺病毒穿梭载体的构建。已使用这些载体来构建复制缺陷型(Ad-MN-CD和Ad-MNSP-CD)重组腺病毒载体及复制限制型(Ad-MN-Ela)重组腺病毒载体。图3MN启动子构成物在不同细胞系中的相对的荧光素酶活性。该图表明了单独的MN启动子构成物以及和SV-40启动子的SV40增强子区联合的MN启动子构成物在以下细胞系中的相对荧光素酶活性MN表达的肾细胞癌细胞系(SK-RCC31，SK-RCC-38)和MN非表达的肾细胞癌细胞系(SK-RCC-29，SK-RCC-42)、MN表达的宫颈癌细胞系(Hela)以及MN非表达的前列腺癌细胞系(LNCaP)。相对于具有MN启动子的pGL3质粒，每种MN非表达子显示了极小的荧光素酶活性；且将SV-40启动子的增强子区段添加到MN启动子上，荧光素酶活性仅有略微的增强。另外，MN表达细胞系在MN启动子的调节下，表达显著的基础荧光素酶活性；添加SV-40启动子的增强子区则显著增强(8至12倍)所述荧光素酶活性。图4肾细胞癌和宫颈癌细胞系中的MN启动子缺失分析。使用和图3中的相同细胞系，证实了MN启动子区对于MN表达细胞系的特异性。任何启动子片段的缺失与全长MN启动子在MN表达细胞系中所示特异性和活性的丢失有关。图5MN-荧光素酶构成物的示意图。最前面的线代表MN5’序列。数字为按bp计的距MN转录起始位点的距离。5.发明详述本发明提供指导在肿瘤内表达的启动子、增强子和其它调节元件，所述启动子、增强子和其它调节元件包括来自控制MN-CA9蛋白表达的5’调节区的核苷酸序列及其转录活性片段。特别提供其中MN-CA9调节区能够控制异源基因的表达、能够过量表达一种内源肿瘤基因或一种病理过程的抑制剂、或者能够使一种在癌症发生和/或发展中被认为是重要的特定基因的表达失效的表达载体、宿主细胞和转基因动物。这样的癌症的实例包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌。本发明也提供使用所述载体、细胞和动物来筛选作为癌症发生和/或发展之激动剂和拮抗剂的候选分子的方法。在一个替代的实施方案中，本发明提供调节与癌症发生和/或发展有关的化合物表达的组合物和方法，且提供筛选在癌症发生和/或发展期间调节表达的化合物的组合物和方法。也提供应用通过所述筛选测定而鉴定的分子与化合物进行治疗处理的方法。本发明另外提供治疗和/或改善癌症和其它疾病及紊乱的方法，所述癌症包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌。本发明部分基于下述发现使用可以供核苷酸序列的组织特异性表达之用的启动子，可以以细胞和组织特异性的方式，给予包含于载体(即病毒载体)内的编码毒剂和/或治疗剂编码序列的核苷酸序列。此外，因为本发明的载体利用这些启动子来控制毒性和/或治疗性编码序列的表达，所以本发明的载体不仅当通过直接应用给予时，而且当系统给予机体时，都是有效的治疗剂；因为仅仅将在被特异性靶向的细胞中即在表达MN-CA9的细胞内，表达所述毒剂和/或治疗剂编码序列。利用这种特性，来设计本发明的方法，从而有效地转移一种或更多种编码治疗剂的DNA分子到必需治疗剂的部位。所述方法涉及给予一种包含编码翻译产物(即治疗蛋白)或转录产物(即反义RNA或核酶)的DNA载体到哺乳动物宿主体内必需所述翻译产物的部位上。只要该载体感染必需治疗剂的细胞，所关注的编码序列即表达胸苷激酶便得以表达；因此放大了毒剂和/或治疗剂、蛋白或RNA的量。本发明也涉及包含载体的药用组合物，所述载体包含供治疗和/或改善癌症和其它疾病及紊乱之用的DNA；所述癌症包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌。本发明的组合物通常由包含载体的生物适合性材料组成，该载体包含编码所关注治疗蛋白即胸苷激酶、生长因子等等的DNA。生物适合性组合物是一种当给予哺乳动物宿主时不引起变态反应、有害反应或其它不适宜反应之形式的组合物。本发明克服了特别与当前治疗和/或癌症和其它疾病及紊乱的重组蛋白疗法有关的缺点，所述癌症包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌。首先，直接基因转移是一种有合理的策略；所述策略允许转染细胞(a)制造生理学量的、以组织和范围特异性方式修饰的治疗蛋白，以及(b)在适当的环境中，传递这种蛋白到合适的细胞表面信号受体上。预期这样分子的外源传递与有效给药和传递难题有关。其次，当可能时，用本发明的方法不需要反复给药；因为可以用各种各样的启动子，包括诱导型启动子，来控制所关注治疗蛋白的表达水平。另外，转染DNA的整合可涉及重组蛋白的长期表达。在下面5.1和5.2节中详细描述了所述MN-CA9调节区的核苷酸序列、以及其中由MN-CA9调节区控制异源基因的表达的表达载体、宿主细胞和转基因动物。在5.3节中，描述了使用这样的多核苷酸(即MN-CA9基因的调节区)和融合蛋白产物筛选与MN-CA9基因之调节区相互作用的化合物的方法。这节描述筛选与所述MN-CA9调节区结合或调节所述MN-CA9调节区之活性的小分子、化合物、重组蛋白、肽、核酸、抗体等等的体内和体外测定。5.4节描述了供将所鉴定的激动剂和拮抗剂用于药物传递或基因治疗的方法。最后，在5.5节中，描述了运用这样的激动剂和拮抗剂来调节与癌细胞相关的疾病的药用组合物。提供用于治疗各种各样癌症的方法和组合物，所述癌症包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌。5.1本发明的多核苷酸和核酸本发明包括包含MN-CA9基因的5’调节区及其转录活性片段的多核苷酸序列。尤其是，本发明涉及包含图1所示序列的、紧接地位于MN-CA9基因的转录起始位点之5’的多核苷酸。在不同的实施方案中，所述多核苷酸可以是5000、4000、3000、2000、1000bp的长度，优选大约500bp的长度，且更优选大约250bp的长度。本发明进一步提供MN-CA9调节区的探针、引物和片段。在一个实施方案中，提供由MN-CA9基因序列的至少8个核苷酸组成的纯化的核酸(即一个可杂交部分)；在其它的实施方案中，所述核酸由MN-CA9序列的至少20个(邻接的)核苷酸、25个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、500、1000、2000、3000、4000或5000个核苷酸组成。可以用对于本领域技术人员众所周知的方法来构建这些序列，它们或者呈分离的状态，或者被包含于表达载体中。这些方法包括例如，体外DNA重组技术、合成技术以及体内遗传重组。参见例如Sambrook等于1989年描述的技术(参见上文)、以及Ausabel等于1989年描述的技术(参见上文)，也参见在“OligonucleotideSynthesis”(《寡核苷酸合成》)(1984，GaitM.J.编辑，IRLPressOxford)中描述的技术；通过引用将其全部结合到本文中。在另一个实施方案中，所述核酸在长度方面小于20、25、35、200或500个核苷酸。核酸可以是单链的或双链的。本发明也包括与上述序列可杂交或互补的核酸。在特定的方面，提供包含与MN-CA9基因调节区的至少10、20、25、50、100、200、500个核苷酸或全部序列互补的序列的核酸。研究团体可以为了各种各样的目的使用由本发明提供的MN-CA9调节区的探针、引物及片段。可以将它们用作DNA印迹凝胶上的分子量标志；用作鉴定染色体或作相关基因位置之图谱的染色体标志或标记(当被标记时)；与患者体内的内源DNA序列比较以鉴定潜在的遗传病；用作杂交探针且因此发现新的、相关的DNA序列；用作衍生出用于基因指纹分析的PCR引物的信息源；以及在发现其它新的多核苷酸的方法中，用作“扣除”已知序列的探针。对于本领域技术人员，进行上面列举的应用的方法是众所周知的。公开这样的方法的参考文献包括而不限制于“MolecularCloningALaboratoryManual”，第二版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis编辑，1989；以及“MethodsinEnzymologyGuidetoMolecularCloningTechniques”，AcademicPress，Berger，S.L.和A.R.Kimmel编辑，1987。本发明的核苷酸序列也包括与图1所示核苷酸序列及/或其转录活性片段有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或更高核苷酸序列同一性、能够特异性地在包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌的癌内驱动表达的核苷酸序列。为了测定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分率，则为了最佳比较的目的而将所述序列进行比对(例如，为了和第二种氨基酸序列或核酸序列进行最佳比对，可以在第一种氨基酸序列或核酸序列中引入空位)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。如果在第一种序列中的一个位置被第二种序列中相应位置的、同样的氨基酸残基或核苷酸占据，那么，所述分子在该位置是相同的。在两种序列之间的同一性百分率是由所述序列所享有的相同位置数的函数(即％同一性＝相同重叠位置数/位置总数x100)。在一个实施方案中，所述两种序列有同样的长度。也可以用一种数学算法来完成两种序列之间的同一性百分率的确定。一种优选的、非限制的、用来比较两种序列之数学算法的例子是Karlin和Altschul的算法((1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264-2268)；在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877中改进了该算法。将这样一种算法结合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序中((1990)J.Mol.Biol.215403-410)。用所述NBLAST程序、分值＝100、字长＝12，可进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的一种核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序、分值＝50、字长＝3，进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的一种蛋白分子同源的氨基酸序列。至于为了比较目的而得到引入空位的序列比对，可以如Altschul等(1997)NucleicAcidsRes.253389-3402中描述，利用GappedBLAST。另一方面，可以用PSI-Blast来进行一种测定分子之间距离关系的迭代搜索(出处同上)。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以用各自程序(例如NBLAST和NBLAST)的缺省参数(参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。另一种优选的、非限制性的、用来比较序列之数学算法的例子是Myers和Miller的算法((1988)CABIOS411-17)。将这样一种算法结合到ALIGN程序(2.0版本)中，所述ALIGN程序为GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可以用一张PAM120加权残基表(PAM120weightresiduetable)、空位长度罚分(gaplengthpenalty)为12以及空位罚分(gappenalty)为4。在另外一个实施方案中，使用NA_MULTIPLE_ALIGNMENT1.0程序，用为5的GapWeight和为1的GapLengthWeight，可达到序列比对。使用类似于上面描述的那些技术的技术，允许或不允许有空位，可确定两种序列之间的同一性百分率。在计算同一性百分率方面，一般仅计算准确的匹配。本发明也包括(a)包含上述MN-CA9调节序列和/或其互补物(即反义物)中的任一种的DNA载体；(b)包含与一种异源基因例如一种报道基因可操作地连接的上述MN-CA9调节元件序列之任一种的DNA表达载体；以及(c)遗传工程化的宿主细胞；所述细胞包含与一种异源基因可操作地连接的上述MN-CA9调节元件序列之任一种，致使所述MN-CA9调节元件指导该异源基因在所述宿主细胞中表达。在本发明的范围内，同样包括这调节区的各种各样转录活性片段。按照本发明的、图1所示序列的“转录活性”或“转录功能”片段，是指包含作为在重组宿主细胞中重组多肽或重组多核苷酸表达的调节区有功能的所述多核苷酸片段的多核苷酸。对本发明来说，如果所述的调节多核苷酸含有包含转录信息的核苷酸序列，且这样的序列与编码所需多肽或所需多核苷酸的核苷酸序列可操作地连接；则该核酸或多核苷酸作为重组多肽或重组多核苷酸表达之调节区是“转录活性的”。尤其是，本发明MN-CA9调节区的转录活性片段包括那些当可操作地连接在MN-CA9调节序列上且转染到一种MN-CA9-表达细胞系中时具有足够长度而启动报道基因之转录的片段。一般将该调节区紧接地置于编码序列的5’，且与该编码序列可操作地连接。当用于本文时，术语“可操作地连接”指的是紧接报道基因的5’(上游)放置调节序列，以致转录起始所需反式作用因子例如转录因子、聚合酶亚基以及辅助蛋白能够在这个区域装配，从而使得能够起始该报道基因依赖于RNA聚合酶的转录。在一个实施方案中，所选择的多核苷酸序列可以另外包含其它的核苷酸序列；所述其它的核苷酸序列或者来自MN-CA9基因，或者来自一种异源基因。在另一个实施方案中，可以将一种启动子或其片段的多个拷贝相互连接。例如，可以以头-尾、头-头或尾-尾的取向，将启动子序列或其片段连接到该启动子的另一个拷贝上、或其另一个片段上。在另一个实施方案中，可以将肿瘤特异性增强子可操作地连接到MN-CA9调节序列或其片段上，并将其用来增强含有所述MN-CA9调节序列的构成物的转录。在本发明的范围内，也包括大体上不影响核苷酸序列之转录活性的这种核苷酸序列的修饰。这样的修饰包括插入、缺失和取代。另外，本发明包括在严格条件下与图1所示序列之互补物选择性地杂交、且能够激活编码序列表达的任何核苷酸序列。示范性的中等严格的杂交条件如下于65℃，在由6XSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、1mMEDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA以及500μg/ml变性鲑精DNA组成的缓冲液中，进行载有DNA之滤膜的预杂交达8小时至过夜。在65℃，于含有100μg/ml变性鲑精DNA以及5-20X106cpm之32P标记的探针的预杂交混合物中，使滤膜杂交达48小时。在37℃，于含有2XSSC、0.01％PVP、0.01％Ficoll以及0.01％BSA的溶液中，进行滤膜的洗涤达1小时。此后于50℃在0.1XSSC中洗涤达45分钟，然后进行放射自显影。另一方面，示范性的高度严格的条件如下例如，于65℃，在0.5MNaHPO4、7％的十二烷基硫酸钠(SDS)、1mMEDTA中，与结合滤膜的DNA杂交；且在68℃用0.1xSSC/0.1％SDS洗涤(AusubelF.M.等编辑，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，Vol.I，GreenPublishingAssociates，Inc.，以及JohnWiley&sons，Inc.，NewYork，第2.10.3页)。可以使用的其它的高度严格条件是本
技术领域：
众所周知的。通常，对于长度在14与70个核苷酸之间的探针，用公式Tm(℃)＝81.5+16.6(log[单价阳离子(摩尔浓度(molar))])+0.41(％G+C)-(500/N)，来计算解链温度(Tm)；在公式中，N为该探针的长度。如果在含有甲酰胺的溶液中进行杂交，则用公式Tm(℃)＝81.5+16.6(log[单价阳离子(摩尔浓度)])+0.41(％G+C)-(0.61％甲酰胺)-(500/N)，来计算解链温度(Tm)；在公式中，N为该探针的长度。通常在Tm以下大约20-25℃(对于DNA-DNA杂合体)或在Tm以下大约10-15℃(对于RNA-DNA杂合体)，进行杂交。所述MN-CA9调节区或其转录功能片段最好是来源于一种哺乳动物有机体。依靠核酸杂交的筛选步骤使得从其它生物中分离任何基因序列成为可能。可以标记本文公开的分离的多核苷酸序列或其片段，并可以将其用来筛选由得自所关注有机体的合适细胞或组织(例如癌组织)的mRNA构建成的cDNA文库)。如果该cDNA文库来源于一种与所述标记序列所来源之有机体类型不同的有机体，则所用的杂交条件应该具有较低的严格性。本领域技术人员熟知低严格条件，且低严格条件将根据该文库和标记序列所来源的特定生物而变化。至于有关这样条件的指导，参见例如，Sambrook等，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress，N.Y.，；以及Ausabel等，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenPublishingAssociatesandWileyInterscience，N.Y.，通过引用，将它们中的每一篇全部结合到本文中。另外，通过运用两种根据本文公开的MN-CA9调节区核苷酸序列而设计的引物库，进行聚合酶链式反应(PCR)扩增；可以从例如牛核酸或其它非人类核酸中分离出其它哺乳动物的MN-CA9调节区的同源物。用于所述反应的模板可以是通过mRNA反转录而得到的cDNA，所述mRNA即由例如牛或其它非人类的细胞系、或者已知表达MN-CA9基因的组织制备的mRNA。至于有关这样条件的指导，参见例如，Innis等(编辑)，1995，PCRStrategies，AcademicPressInc.，SanDiego；以及Erlich(编辑)，1992，PCRTechnology，OxfordUniversityPress，NewYork；通过引用，将它们中的每一篇全部结合到本文中。通过使用常规技术例如外切核酸酶III消化或合适的限制性内切酶消化，构建5’和/或3’的嵌套缺失物；可以进一步地确定在MN-CA9基因的5’非编码区内的启动子序列。可以将所产生的缺失片段插入到所述启动子报道基因载体中，以确定是否该缺失已降低了或消除了启动子的活性；例如如Coles等所述(Hum.Mol.Genet.，7791-800，1998)。这样，可以确定启动子的边界。如果希望，可以运用定点诱变或接头分区诱变来单独或组合地消除启动子内潜在的转录因子结合位点，从而鉴定该启动子内的潜在的各个调节位点。通过将突变体插入到启动子报道基因载体中的克隆位点上，可确定这些突变在转录水平上的效应。这些测定的类型是本领域技术人员众所周知的(WO97/17359，US5,374,544，EP582796，US5,698,389，US5,643,746，US5,502,176以及US5,266,488)。运用本
技术领域：
众所周知的操作法，靠重组DNA技术，可产生所述MN-CA9调节区及其转录功能片段以及用来鉴定MN-CA9调节区及其片段的、本文描述的片段和探针。可以用本领域技术人员众所周知的方法，或者以分离的形式，或者以包含于表达载体中的形式，来构建这些序列。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术以及体内遗传重组。参见例如Sambrook等于1989年描述的技术(参见上文)、以及Ausabel等于1989年描述的技术(参见上文)，也参见在“OligonucleotideSynthesis”(1984，GaitM.J.编辑，IRLPressOxford)中描述的技术；通过引用将其全部结合到本文中。用各种各样的、本领域技术人员众所周知的化学方法和酶法，可导致该调节序列的改变。例如，可以缺失掉由限制性位点定限定的序列区域。可以用寡核苷酸指导的诱变，以一种限定方式来改变序列，和/或在该序列内的特定区域中引入限制性位点。另外，运用DNA核酸酶例如Bal31、ExoIII或S1核酸酶，可产生缺失突变体。通过将所述DNA与核酸酶保温达增长的时间，可导致调节序列中的逐渐更大的缺失(参见例如Ausubel等，1989，参见上文)。在合适的宿主细胞中，评价改变了的序列指导异源编码序列进行表达的能力。保持其指导结合到重组表达载体中的编码序列表达能力以供进一步使用的任何经改变的调节序列，都在本发明范围内。5.2肿瘤特异性启动子活性的分析所述MN-CA9基因调节区显示了选择性的组织和细胞类型特异性，即它诱导基因在宫颈癌细胞、肾细胞癌细胞以及胃癌细胞和结肠癌细胞中表达。因此，可以使用本发明该调节区及其转录活性片段来诱导肿瘤细胞中异源基因的表达。本发明涉及使用MN-CA9基因调节区以达到靶基因的组织特异性表达。通过监测不同类型细胞和组织中与所述MN-CA9启动子可操作地连接的可检测多核苷酸的表达水平，可进一步地评价所述MN-CA9调节区的活性及特异性。正如在下文中所讨论的，所述可检测多核苷酸或者可以是一种与预先确定的寡核苷酸探针特异性杂交的多核苷酸，或者可以是一种编码可检测蛋白的多核苷酸。5.2.1MN-CA9启动子驱动的报道基因构成物按照本发明的调节多核苷酸可以便利地成为一种可用来在所需宿主细胞或宿主有机体中表达一种编码序列或报道基因的重组表达载体的一部分。可以用本发明的MN-CA9调节区及其转录活性片段来指导异源编码序列的表达。根据本发明，所述MN-CA9调节区的转录活性片段包括那些具有足够长度从而启动与所述片段可操作地连接的报道分子编码序列转录的所述调节区的片段。可以利用本领域技术人员众所周知的各种各样的报道基因序列，所述报道基因序列包括但不限于编码荧光蛋白例如绿色荧光蛋白(GFP)、酶(例如CAT、β-半乳糖苷酶、荧光素酶)或抗原标记的基因。为了方便起见，对于本发明的筛选测定，优选通过比色测定或荧光测定而分析的酶报道分子和发光报道分子。在一个实施方案中，例如可以使用一种生物发光蛋白、化学发光蛋白或荧光蛋白作为本发明发光报道分子。不需要底物或辅因子的发光报道分子的类型包括但不限于维多利亚水母(Victoriaaequoria)的野生型绿色荧光蛋白(GFP)(Chalfie等，1994，Science263802-805)，以及修饰的各种绿色荧光蛋白(Heim等，1995，Nature373663-4；PCT公开说明书WO96/23810)。这种类型报道基因的转录与翻译导致试验细胞中荧光蛋白的积累，例如，根据本
技术领域：
众所周知的方法，用一台荧光计或流式细胞仪，可以测量所述荧光蛋白的积累(参见例如，Lackowicz，1983，PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy，PlenumPress，NewYork)。可以使用的另一类型的报道基因是需要辅因子而发光的酶，所述酶包括但不限于Renilla荧光素酶。荧光素酶的其它来源也是本
技术领域：
众所周知的，包括但不限于哈氏弧菌(Vibrioharveyi)的细菌荧光素酶(luxAB基因的产物)(Karp，1989，Biochim.Biophys.Acta100784-90；Stewart等，1992，J.Gen.Microbiol，1381289-1300)、以及来自萤火虫Photinuspyralis的荧光素酶(DeWet等，1987，Mol.Cell.Biol.7725-737)；可以根据光的产生而测定它们(Miyamoto等，1987，J.Bacteriol.169247-253；Loessner等，1996，Environ.Microbiol.621133-1140；以及Schultz&Yarus，1990，J.Bacteriol.172595-602)。可以用比色分析法进行分析的报道基因包括但不限于β-半乳糖苷酶(Nolan等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852603-07)、β-葡糖醛酸糖苷酶(Roberts等，1989，Curr.Genet.15177-180)、荧光素酶(Miyamoto等，1987，J.Bacteriol.169247-253)或β-内酰胺酶。在一个实施方案中，所述报道基因序列包含一段编码LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的核苷酸序列。该酶非常稳定且具有宽广的特异性，以致于允许使用不同的组织化学底物、生色底物或荧光底物；例如，但不限于5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷(X-gal)、乳糖2，3，5-三苯基-2H-四唑鎓(乳糖-四唑鎓)以及荧光素吡喃型半乳糖苷酶(参见Nolan等，1988，参见上文)。在另一个实施方案中，可使用大肠杆菌(E.coli)β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)的产物(Roberts等，1989，Curr.Genet.15177-180)作为报道基因。可以用不同的组织化学底物和荧光底物例如X-葡糖苷酸(Xgluc)和4-甲基伞形基葡糖苷酸，来测定GUS的活性。除了例如上面描述的、提供方便比色反应的那些报道基因序列外，可以常规地使用其它报道基因序列，例如可选择报道基因序列。例如，可利用氯霉素乙酰转移酶(CAT)的编码序列，从而导致氯霉素抗性细胞生长物的依赖MN-CA9调节区的表达。对于本领域技术人员，CAT的用途和可选择报道基因的优点是众所周知的(Eikmanns等，1991，Gene10293-98)。同样可利用其它的可选择报道基因序列，且它们包括但不限于编码赋予zeocin抗性(Hegedus等，1998，Gene207241-249)或卡那霉素抗性(Friedrich和Soriano，1991，Genes.Dev.51513-1523)之多肽的基因序列。也可以用其它基因，例如毒性基因产物、潜在毒性基因产物、以及抗增殖或抑制细胞之基因的产物。这样的基因产物的实例包括靶向肝癌细胞的甲胎蛋白(Kuriyama，S.等，CellStructFunct，16503，1991)、用于胃癌的癌胚抗原(CEA)启动子(Tanaka，T.等，CancerRes，561341，1996)、用于杀伤黑素瘤细胞的酪氨酸酶启动子(Vile，R.G.等，CancerRes，546228，1994)、用于脑以靶向神经胶质细胞的骨形态发生蛋白(Shimizu，K.NipponRinsho，523053，1994，)、以及用于杀伤骨肉瘤和前列腺癌的骨钙蛋白启动子(Ko，S.C.等，CancerRes，564614，1996；Gardner，T.A.等，GeneTherapyandMolecularBiology，241，1998)。在另一个实施方案中，可检测报道基因多核苷酸或者可以是一种与预先确定的寡核苷酸探针特异性杂交的多核苷酸，或者可以是一种编码可检测蛋白的多核苷酸；所述可检测蛋白包括MN-CA9多肽或其片段或其变异体。对于本领域技术人员，这类测定是众所周知的(US5,502,176以及US5,266,488)。按照标准的重组DNA技术，可构建MN-CA9驱动的报道基因构成物(参见例如，MethodsinEnzymology，1987，154卷，AcademicPress；Sambrook等，1989，MolecularCloning-ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarborPress，NewYork；以及Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience，NewYork，通过引用，将它们中的每一篇全部结合到本文中)。对于本领域技术人员，分析启动子活性的方法是众所周知的(参见例如Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY，1989)。可以使用的一种常用方法的实例涉及一种携带报道基因和来自MN-CA9基因组序列之基因组序列的重组载体。简单地说，如果将报道基因置于一种生物活性多核苷酸片段的控制下，则检测到该报道基因(例如绿色荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰转移酶)的表达。可以将位于该基因第一个外显子上游的基因组序列克隆到任何合适的启动子报道基因载体中。例如，为了在哺乳动物宿主细胞中表达，可将市场上可以买到的许多载体工程化，以插入本发明的MN-CA9调节区。这样的载体的非限制性实例为pSEAPBasic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Enhancer、或pEGFP-1启动子报道基因载体(pEGFP-1PromoterReportervectors)(Clontech，PaloAlto，CA)、或者pGL2-或pGL3-基本(basic)无启动子荧光素酶报道基因载体(Promega，Madison，WI)。这些启动子报道基因载体中的每一种，包含位于报道基因上游的多克隆位点；所述报道基因即编码一种可快速分析之蛋白例如分泌型碱性磷酸酶、绿色荧光蛋白、荧光素酶或β-半乳糖苷酶的报道基因。以两种取向将MN-CA9基因的调节序列插入到报道基因上游的克隆位点，并将其引人到合适的宿主细胞中。分析报道基因之蛋白的水平，并将其与用在该克隆位点没有插入片段的载体获得的水平相比较。与对照载体相比，含有该插入片段之载体而出现升高的表达水平，则表明在该插入片段中存在启动子。包含MN-CA9基因调节区的表达载体可另外含有一种编码可选择标记的基因。可使用多种选择系统，所述选择系统包括但不限于单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因(Wigler等，1977，Cell11223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA482026)以及腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Lowy等，1980，Cell22817)；可以分别在tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中使用它们。同样，可以将抗代谢物抗性用作选择dhfr基因、gpt基因、neo基因以及hygro基因的基础；dhfr基因赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA773567；O’Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA781527)，gpt基因赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072)，neo基因赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)，hygro基因赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，Gene30147)。另外的可选择基因包括trpB、hisD、ODC；trpB允许细胞利用吲哚代替色氨酸，hisD允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸(Hartman和Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA858047)，ODC(鸟氨酸脱羧酶)赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂-2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸即DFMO(McConlogueL.，1987，在CurrentCommunicationsinMolecularBiology中，ColdSpringHarborLaboratory编辑)和谷氨酰胺合成酶(Bebbington等，1992，Biotech10169)抗性。5.2.2.转录活性调节片段的特征鉴定可分析包含MN-CA9基因调节区或其片段的融合构成物的转录活性。作为启动子分析中的第一步，必须按照标准方法(Sambrook等，1989，MolecularCloningALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，ColdSpringHarborPress)，运用引物延伸分析和/或RNA酶保护分析，来确定在研究之中的肿瘤特异性基因的转录起始点(+1位)。通常认为+1位上游的DNA序列是负责基因调节的启动子区。但是下游序列，包括内含子中的序列，也可以参与基因调节。开始测试启动子活性，可以将-3kb至+3kb的区域(这里+1为转录起始点)克隆到报道基因编码区的上游。也可以制备两种或更多种另外的报道基因构成物，所述构成物包含该调节区的5’和/或3’之截短形式，以帮助鉴定对肿瘤特异性表达负责的区域。基于用途来进行报道基因类型的选择。在一个优选的实施方案中，使用一种GFP报道基因构成物。在肿瘤特异性基因启动子的研究中，作为报道分子的绿色荧光蛋白(GFP)的应用是特别有用的。运用GFP作为报道分子的一个主要优点在于这样的事实，即在刚分离的肿瘤中不需要底物能检测出GFP。在本发明的另一个实施方案中，使用一种荧光素酶报道基因构成物。至于在转基因小鼠方面的启动子分析，已经过优化以供在哺乳动物细胞中表达的GFP是优选的。无启动子克隆载体pEGFP1(Clontech，PaloAlto，CA)编码一种经过优化以便在哺乳动物细胞中有更亮的荧光和更高表达的野生型GFP的红移变异体(Cormack等，1996，Gene17333；Haas等，1996，Curr.Biol.6315)。此外，由于这种增强的GFP(EGFP)的最大激发峰在488nm，因而可运用通常使用的滤光装置，例如以450-500nm照明的异硫氰酸荧光素(FITC)光学器件，来观察GFP荧光。对于用转基因小鼠的启动子分析，pEGFP1证明作为报道基因载体是有用的(Okabe等，1997，FEBSLett.407313)。在一个替代实施方案中，使用包含其中在荧光素酶报道基因上游具有一个MN-CA9调节区的转基因的转基因小鼠。可以使用本
技术领域：
已知方法制备推定的启动子片段(通常来自含有8-10kb含所述启动子区的基因组DNA的亲代噬菌体克隆)以供克隆用。在一个实施方案中，例如，将启动子片段克隆到一种荧光素酶报道基因载体的多克隆位点中。在一个实施方案中，用限制性内切核酸酶切取所述调节区片段，以便插入到该报道基因载体中。然而，这种方法的可行性依赖于该调节片段中合适限制性内切核酸酶位点的可用性。在一个优选的实施方案中，运用具有合适的限制性内切核酸酶切割位点的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应(PCR；Saiki等，1988，Science239487)扩增所需要的启动子片段。在邻接待扩增调节片段的正向引物和反向引物的5’末端，包括限制性切割所必需的序列。在PCR扩增后，通过限制性消化该PCR产物而产生合适的末端。然后，按照标准的克隆步骤(Sambrook等，1989，参见上文)，将由任一种方法产生的启动子片段连接到所述报道基因载体的多克隆位点。有人建议在产生转基因动物之前，应该验证构成物中PCR产生的启动子片段的DNA序列。所产生的报道基因构成物将包含位于该报道基因可读框上游的推定的启动子片段，所述报道基因例如GFP或荧光素酶的cDNA。在一个优选的实施方案中，使用下面的方案。用合适的限制性内切核酸酶消化50-100pg的所述报道基因构成物，以释放出转基因片段。用一块含有0.5μg/ml溴化乙锭的1％(w/v)的琼脂糖凝胶及TAE缓冲液(1x0.04MTris-乙酸盐，0.001MEDTA，pH8.0)，以5-6V/cm来电泳分离该限制性内切核酸酶切割的产物。用一台紫外线透射仪，根据大小来确定该转基因带；最好用长波紫外灯，以减少在DNA上形成缺口；且仔细地切下含有所需带的凝胶切片。将该凝胶切片和1ml0.5xTAE缓冲液加到一个已于pH8.0的1mMEDTA中煮沸达10分钟(Sambrook等，1989，参见上文)的透析袋中，并夹紧透析袋的末端。将包含该凝胶切片的透析袋浸入一个装有0.5xTAE缓冲液的水平凝胶电泳盒中，并以5-6V/cm将其电泳达45分钟。在停止该电泳之前，使所述电泳盒中的电流反转达1分钟，以释放可能附着于该透析管之管壁上的DNA。用一个新的微量离心管收集含有从该透析袋电洗脱出的DNA的TAE缓冲液。可以在所述紫外线透射仪上观测该凝胶切片，以确定该DNA的电洗脱是完全的。靠通过ElutipD柱来进一步纯化经电洗脱的DNA样品。用1-2ml高盐缓冲液(1.0MNaCl，20mMTris.Cl，1.0mMEDTA，pH7.5)来预洗涤该柱的填充物质，继之以用5ml低盐缓冲液(0.2MNaCl，20mMTris.Cl，1.0mMEDTA，pH7.5)洗涤一次。用一支5ml注射器，将溶液加到该ElutipD柱上，避免反流。缓慢加载含有经电洗脱的DNA的溶液。用2-3ml的低盐缓冲液洗涤该柱，并用0.4ml高盐缓冲液洗脱所述的DNA。添加2倍体积的95％的冷乙醇，以沉淀DNA。用一台微量离心机，以14,000xg离心10分钟，来收集该DNA。小心地除去乙醇、不要扰动DNA沉淀。用70％(v/v)的乙醇洗涤该沉淀至少两次，并将其干燥。所述的洗涤步骤与干燥步骤是重要的，因为残余的盐和乙醇对发育中的胚胎是致命的。将该DNA重新悬浮于注射缓冲液(用Milli-Q优质水制备的10mMTM，0.1mMEDTA，pH7.5)中。通过用一台分光光度计测量在A260(对50μg/ml的DNA，A260＝1)下的光密度，来确定纯化的转基因DNA片段的浓度。用这种方法制备的DNA适合于显微注射到小鼠的受精卵中。5.2.3用转基因小鼠的肿瘤特异性启动子的分析尤其可使用MN-CA9调节区来指导报道分子编码序列、同源基因或异源基因在转基因动物中的表达。可以用任何物种的动物来产生转基因动物，所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猪、微型猪(micro-pigs)、山羊、绵羊、以及非人类的灵长目动物例如狒狒、猴和黑猩猩。在用于本文时，术语“转基因的”是指表达来自不同物种的MN-CA9基因序列的动物(例如表达MN-CA9序列的小鼠)以及已基因工程化从而过量表达内源(即同一物种)MN-CA9序列的动物或已基因工程化而敲除特定序列的动物。在一个实施方案中，本发明提供在所有细胞中携带一种在所述MN-CA9调节区或其转录活性片段控制下的转基因的转基因动物，所述转基因例如一种报道基因、治疗剂和/或毒剂编码序列；而且提供在某些细胞中而不是所有细胞中携带该转基因的动物，即镶嵌动物。所述的转基因可以以单个转基因的形式，或者可以以多联体的形式例如头-头串联体或头尾串联体整合。例如按照Lasko等所述方法(1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896232-6236)，也可以选择性地将所述转基因引入到一种特定的细胞类型中，并在该特定细胞类型中使其活化。如果希望该转基因被整合到相应内源基因的染色体位点中，则优选基因寻靶。简单地说，如果准备使用一种这样的技术，则设计包含与所述内源基因同源的某些核苷酸序列的载体，以便通过和染色体序列的同源重组而整合到所述内源基因的核苷酸序列中，且破坏该内源基因之核苷酸序列的功能。可以用本领域中已知的任何技术，将在MN-CA9调节区控制下的转基因引入到动物中，从而产生转基因动物的建立者系。这样的技术包括但不限于前核显微注射(Hoppe和Wagner，1989，第4,873,191号美国专利)；将来自被诱导至静息的培养的胚胎细胞、胎儿细胞或成体细胞之核，核转移到去核卵母细胞中(Campbell等，1996，Nature38064-66；Wilmut等，Nature385810-813)；将反转录病毒基因转移到种系中(VanderPutten等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA826148-6152)；胚胎干细胞中的基因寻靶(Thompson等，1989，Cell65313-321)；胚胎的电穿孔(Lo，1983，Mol.Cell.Biol.311803-1814)；以及精子介导的基因转移(Lavitrano等，1989，Cell57717-723；参见Gordon，1989，TransgenicAnimals，Intl.Rev.Cytol.115171-229)。例如，为了显微注射受精卵，则从所述报道基因构成物中切割出一段包含该调节区、报道基因以及聚腺苷酸化信号的线性DNA片段(转基因)。用本
技术领域：
已知的方法，可通过凝胶而纯化所述的转基因；例如用电洗脱的方法。在凝胶片段的电洗脱之后，靠通过ElutipD柱(Schleicher&Schuell，Dassel，德国)而进一步除去微量的任何杂质。在一个优选的实施方案中，按照标准方法(Hogan，1986，ManipulatingtheMouseEmbryo，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)，将纯化的转基因片段显微注射到得自B6CBA雌鼠的受精卵的雄性前核中。在几个胚胎阶段，短暂地分析小鼠；或者，通过建立允许更详细分析整个发育过程中以及成年动物中转基因表达的建立者系，来短暂地研究小鼠。按照Vemet等的方法(MethodsEnzymol.1993；225434-451)，用纯化自胎盘(瞬时)或尾剪取部分(建立者)的基因组DNA，通过PCR，来分析转基因的存在。最好在包含1X反应缓冲液中的1μg基因组DNA的100μl体积中，进行所述的PCR反应，所述1X反应缓冲液中还补充有0.2mMdNTPs、2mMMgCl2、各600μM的引物以及2.5单位的Taq聚合酶(Promega，Madison，WI)。30次PCR循环中的每次包括在94℃变性1分钟、在54℃退火1分钟以及在72℃延伸1分钟。然后，使建立者小鼠与C57B1配偶交配，从而产生小鼠的转基因F1系。5.3筛选测定干扰肿瘤发生和/或癌症发展的化合物，可在不同癌症中提供靶向缺陷的治疗。可用这样的化合物来干扰各种各样癌症的开始或发展。也可以用激发或抑制启动子活性的化合物来改善癌症的症状。可以将含有与报道基因可操作地连接的MN-CA9调节区或其片段的基因工程化的细胞、细胞系、癌细胞和/或转基因动物，用作筛选调节MN-CA9转录活性之药物的系统。另外，包含MN-CA9的转基因小鼠可提供在体内和体外的实验模型，以研究出通过使药物定向而引起疾病发展的停滞、来治疗包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌的各种各样癌症的新方法。本发明包括设计用以鉴定调节所述MN-CA9调节区活性之化合物的筛选测定。本发明不仅包括体外和基于细胞的分析，而且包括转基因动物中的体内分析。正如在下文描述的，待测试的化合物可包括但不限于寡核苷酸、肽、蛋白、小的有机化合物或无机化合物、抗体等等。化合物的实例可包括但不限于肽，例如可溶性肽，包括但不限于Ig尾融合蛋白和随机肽文库的成员；(参见例如，Lam等，1991，Nature35482-84；Houghten等，1991，Nature35484-86)；以及由D-构型和/或L-构型氨基酸构成的组合化学衍生分子文库；磷酸肽(包括但不限于随机或部分简并的定向磷酸肽文库的成员；参见例如Songyang等，1993，Cell72767-778)；抗体(包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗独特型抗体、嵌合抗体或单链抗体，以及FAb、F(ab’)2和FAb表达文库的片段，以及其结合表位的片段)及小的有机分子或无机分子。这样的化合物还可包括已知改善不同癌症症状的化合物，尤其是药物或者药类或药系列的成员。这样的化合包括但不限于抗抑郁药系列，例如锂盐、卡马西平、丙戊酸、麦角酰二乙胺(LSD)、对氯苯丙氨酸、例如FLA63的对丙基多巴乙酰胺二硫代氨基甲酸盐(p-propyldopacetamidedithiocarbamate)衍生物；抗焦虑药，例如地西泮；单胺氧化酶(MAO)的抑制剂，例如异丙烟肼、氯吉兰、苯乙肼和异卡波肼；生物必需胺摄取阻滞剂，例如像地昔帕明、米帕明和阿米替林之类的三环抗抑郁药；5-羟色胺重摄取的抑制剂，例如氟西汀；抗精神病药，例如酚噻嗪衍生物(例如氯丙嗪(盐酸氯丙嗪)和三氟丙嗪)、丁酰苯(例如氟哌啶醇(Haldol))、噻吨衍生物(例如氯丙硫蒽)以及二苯并二氮类(例如氯氮平)；苯并二氮类；多巴胺能激动剂和拮抗剂，例如L-DOPA、可卡因、苯丙胺、α-甲基酪氨酸、利血平、丁苯喹嗪、benzotropine、帕吉林；去甲肾上腺素能激动剂和拮抗剂，例如可乐定、酚苄明、酚妥拉明、环庚三烯酚酮；硝基血管舒张药(例如硝酸甘油、硝普盐以及NO合酶)；以及生长因子(例如VEGF、FGF、血管形成素(angiopoetins)和endostatin)。在一个优选的实施方案中，可以用含有与异源基因可操作地连接的MN-CA9调节区的基因工程细胞、细胞系或生殖细胞和/或体细胞的原代培养物，来开发分析系统，以筛选能抑制序列特异性的DNA-蛋白相互作用的化合物。这样的方法包括使一种化合物与表达在MN-CA9调节区或其活性转录片段控制下的基因的细胞接触，测定该基因表达水平或基因产物活性水平，并将一水平与在没有该化合物的情况下所述细胞产生的基因表达水平或基因产物活性水平相比较，因此如果在存在该化合物的情况下得到的所述水平不同于没有该化合物的情况下获得的水平，则鉴定出了能够调节MN-CA9调节区的表达的化合物。基因表达水平的改变可按照本领域技术人员已知的许多方法来测定，例如通过测定报道基因的活性，分析细胞裂解物中的mRNA转录物，例如通过用RNA印迹分析或其它本
技术领域：
已知的方法，来分析由所述细胞表达的基因产物。在另一个实施方案中，可使用显微解剖和透照。这些技术提供一种用于在包含MN-CA9调节区驱动的报道基因之转基因动物中监测所推定药物对肿瘤细胞的作用的一种快速测定。在这个实施方案中，用各种各样方法中的任一种，将一种试验药物传递给转基因动物。引入一种试验药物的方法可包括口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内给药以及通过划破(划穿皮肤上层而，例如用一种叉状针)或其它任一的标准给药途径。通过显微解剖和透照所述的肿瘤细胞，可分析这样的试验化合物对肿瘤细胞的作用。如果在存在所述化合物的情况下，所观测或测定的报道基因的表达水平不同于当该化合物不存在时所得到的水平，则鉴定出了能够调节MN-CA9调节区之表达的化合物。在本发明不同的实施方案中，可以用于筛选肿瘤相关疾病之调节物的化合物包括可能具有结合MN-CA9调节区能力并因此可能是药物的候选物的天然存在和/或合成的(例如小分子文库或肽文库)肽、小分子；细胞结合分子或者可溶分子、有机分子、非蛋白分子以及重组分子。另一方面，所述蛋白和化合物包括在体内与MN-CA9调节区序列相互作用的细胞内源组分。可以在细胞裂解物或组织匀浆中筛选与MN-CA9调节区或其片段结合的蛋白或其它化合物。这样的内源组分可为药物干预和治疗干预提供新的靶。在一个实施方案中，可筛选文库。可以用本
技术领域：
已知的许多文库，例如肽文库、化学合成文库、重组体文库(例如噬菌体展示文库)、以及基于体外翻译的文库。在本发明的一个实施方案中，可以用肽文库来筛选与MN-CA9连接的报道基因表达的激动剂或拮抗剂。可以用多样性的文库例如随机或组合肽文库或非肽文库，来筛选特异性地调节MN-CA9调节区活性的分子。可使用连接到一种固相支持物上的、包括所有可能之氨基酸组合的随机肽文库，来鉴别能够激活或抑制调节区之活性的肽(Lam，K.S.等，1991，Nature35482-84)。筛选肽文库在发现通过与启动子区相互作用而激发或抑制MN-CA9之表达的药物方面，可能具有治疗价值。在下述文献中，描述了化学合成文库的实例Fodor等，1991，Science251767-773；Houghten等，1991，Nature35484-86；Lam等，1991，Nature35482-84；Medynski，1994，BioTechnology12709-710；Gallop等，1994，J.MedicinalChemistry37(9)1233-1251；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010922-10926；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111422-11426；Houghten等，1992，Biotechniques13412；Jayawickreme等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA911614-1618；Salmon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011708-11712；PCT公布号WO93/20242；以及Brenner和Lerner，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895381-5383。在下述文献中，描述了噬菌体展示文库的实例Scott和Smith，1990，Science249386-390；Devlin等，1990，Science249404-406；Christian等，J.Mol.Biol.227711-718；Lenstra，1992，J.Immunol.Meth.152149-157；Kay等，1993，Gene12859-65；以及于1994年8月18日公布的PCT公布号WO94/18318。作为非肽文库的实例，一种苯并二氮杂文库(参见例如Bunin等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA914708-4712)适合于使用。也可以使用类肽(peptiod)文库(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA899367-9371)。Ostresh等描述了另一个可使用的文库的实例(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111138-11142)，在所述文库中，全甲基化了肽中的酰胺官能团，从而产生一种化学转变组合文库(chemicallytransformedcombinatoriallibrary)。在下面，描述了一种这样的体外筛选测定的具体实施方案。运用所述MN-CA9调节区-报道基因载体来产生转基因小鼠，由所述转基因小鼠建立MN-CA9调节区-报道基因载体生殖细胞的原代培养物。用适合于所述细胞系的培养基，在96孔板上，每孔接种总体积100μl中的大约10000个细胞。将MN-CA9基因表达的候选抑制剂添加到所述细胞上。通过测定由MN-CA9调节区驱动的报道基因的反应，可确定MN-CA9基因活化之抑制剂的效应。这种测定能够容易地以高通量筛选方式建立，以供在96孔板中评价降低(或增加)报道基因活性、但无细胞毒性的化合物文库。在温育6小时后，向所述细胞添加100μl的DMEM培养基+2.5％胎牛血清(FBS)至1.25％的血清终浓度；将其温育达总计24小时(另加18小时)。在24小时之时，用PBS洗涤所述板，且将其吸干并于-80℃冷冻。第二天，融化所述板，并分析所述板上报道基因活性的存在。在一个体内筛选测定的优选实施例中，可以将来源于转基因小鼠的肿瘤细胞移殖到具有正常表型或其它所需表型的小鼠中(Brinster等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111298-302；Ogawa等，1997，Int.J.Dev.Biol.41111-12)。然后，可将这样的小鼠用来试验所述化合物和其它各种因子对肿瘤相关疾病的效应。除了上面列举的化合物和因子外，可以用这样的小鼠来分析用其它方法可能难以研究的因素或条件；例如饮食效应、内部pH、温度等等。一旦鉴别出了抑制或增强MN-CA9调节区活性的化合物，就可以在一项基于动物的测定中测试，以确定该化合物是否显示出作为改善包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌的各种各样癌症症状之药物的能力。首先可根据小规模(即在试管中)测定来优化本发明的测定，然后将其按比例扩大到高通量测定。运用纯化的组分或细胞裂解物，可以在体外即在试管中进行本发明的筛选测定。也可以用培养物中完整的细胞以及用动物模型进行本发明的筛选测定。按照本发明，将用培养的细胞以及动物模型来进一步体内分析在体外显示出调节MN-CA9调节区活性的、如同本文所描述的试验化合物，以确定是否该试验化合物在体内具有类似的作用，且确定所述试验化合物对各种各样癌症的效应。5.4用于MN-CA9调节区核苷酸的治疗应用的组合物和方法可以用MN-CA9多核苷酸或其转录活性片段，来治疗可以通过以肿瘤特异性方式改变MN-CA9或与MN-CA9调节区连接之异源基因的水平或表达得以改善的疾病、病症或紊乱。本文描述了用于这种治疗性治疗的方法。在基因治疗方案中，可使用所述MN-CA9调节区来达到组织特异性表达。在这样的细胞是肿瘤细胞的情况下，可以以特异性靶向包含MN-CA9表达所需反式作用因子之肿瘤细胞的癌基因治疗形式，应用MN-CA9调节区对细胞毒性产物的诱导。这样，所述MN-CA9调节区可作为一种针对各种各样表达MN-CA9蛋白之癌的基因治疗方法的给药途径。这些癌症的实例包括但不限于肾细胞癌、胃癌、结肠癌以及宫颈癌。另外，运用目前描述的表达构成物，可以将反义核酸、反基因(antigene)适体(Aptameric)寡核苷酸传递到细胞中。也可以在细胞中表达核酶或单链RNA，从而抑制一种所关注靶基因的表达。这些反义核酸或核酶分子的靶基因应该是编码细胞维持所必需的基因产物的那些基因。为了各种各样的目的，例如，为了减量调节MN-CA9基因表达，或者，另一方面，为了实现异源基因的肿瘤特异性、阶段特异性表达；可使用本发明的MN-CA9调节区及其转录活性片段。在一个实施方案中，例如，可以靶向内源MN-CA9调节区，以特异性减量调节MN-CA9基因的表达。例如，可以设计互补于所述调节区的寡核苷酸，并将其传递到细胞中。这样的寡核苷酸可以退火到该调节序列上而阻止转录激活。另一方面，可以将该调节序列或其部分以饱和浓度传递到细胞中，从而竞争结合转录因子。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy12488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy387-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32573-596；Mulligan，1993，Science260926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62191-217；May，1993，TIBTECH11155-215。在Ausubel等(编辑)CurrentProtocolsinMolecularBiology1993，JohnWiley&Sons，NY中以及在Kriegler，1990，GeneTransferandExpression(ALaboratoryManual，StocktonPress，NY中，描述了本领域通常已知的可使用的重组DNA技术的方法。在另一个实施方案中，提供一种用于改善各种各样癌症的基因治疗方法。使用MN-CA9调节区序列来驱动药物或毒素的肿瘤特异性表达，并将所述序列引入到肿瘤中。该方法包括将与一种药物或毒素基因可操作相连的MN-CA9调节区序列引入到肿瘤中。在再一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗癌症或其它增生性疾病的基因治疗方法。用MN-CA9调节区来指导一种或更多种蛋白特异性地在患者肿瘤细胞中表达。这样的蛋白例如可以是肿瘤抑制基因、胸苷激酶(与无环鸟苷联用)、参与细胞杀伤的毒素或蛋白例如参与细胞程序死亡途径的蛋白。在一个实施方案中，本发明提供一种可用于毒性基因治疗的、包含MN-CA9启动子的治疗药。这种方法包括一种真核传递载体和一种毒性基因。在一个优选实施方案中，该载体为腺病毒(Ad)，且该基因为胸苷激酶(TK)。因此，该治疗物用式Ad-MN-CA9-TK表示，但实际上，在本文中包含的所述新概念是作为异源编码序列的癌特异性表达的驱动力的MN-CA9启动子。可以将编码所关注的翻译或转录产物的DNA，基因重组到确保大规模复制所述DNA以供制备本发明载体的各种各样的载体系统中。可设计这些载体，使其包含对于指导由癌细胞吸收的DNA序列转录和/或翻译必需的元件。可使用的载体包括但不限于衍生于重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的那些载体。例如，可使用诸如pBR322、pUC19/18、pUC118、119以及M13mp系列载体之类的质粒载体。噬菌体载体可包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R以及EMBL系列的噬菌体载体。可使用的粘粒载体包括但不限于pJB8、pCV103、pCV107、pCV108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16以及卡隆粒9系列的载体。也可以使用便于RNA体外转录的载体，例如SP6载体，以产生大量的、可被插入到病毒载体中的RNA。另一方面，可以将有复制能力或无复制能力的重组病毒载体工程化，所述病毒载体包括但不限于衍生于病毒例如疱疹病毒、反转录病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺伴随病毒或牛乳头瘤病毒的那些载体。虽然可使用整合型载体；但对于非疾病相关修复和再生而言，优选不遗传所述基因产物到子细胞达许多代的非整合型系统。这样，该基因产物在修复过程期间表达，而在后代中因为该基因被稀释，因而表达的基因产物量减少。当病毒介导的基因传递导致正常细胞被感染时，驱动治疗基因表达的组织特异性启动子的应用会另外减弱治疗基因对邻近正常细胞的毒性作用。这会是特别重要的，在此或许能利用系统给药而传递一种治疗载体遍及全身、却将转基因的表达维持在有限及特定数目的细胞类型。此外，由于例如TGF-β的许多骨生长因子具有多效性作用，因而如果在所有细胞中表达该生长因子，则可能会显示出许多有害的副作用。在某些情况下，所述启动子元件可以是组成型启动子或诱导型启动子；且可以在合适的条件下使用它们，以指导所关注基因的高水平表达或可调型表达。组成型启动子控制下的基因表达则不需要存在特定的底物来诱导基因表达，且基因表达将发生于细胞生长的所有条件下。比较起来，由诱导型启动子控制的基因表达则对诱导剂的存在或不存在有反应。例如，如果用一种诱导型的治疗性转基因稳定地转染细胞，则在该个体的生存期内有可能控制转基因的表达。对于所插入的蛋白编码序列的充分翻译，同样需要特定的起始信号。这些信号包括起始密码子ATG以及邻近的序列。在将包含起始密码子及邻近序列的整个编码序列插入到合适的表达载体中的情况下，可以不需要另外的翻译控制信号。但是，在仅插入编码序列的一部分的情况下，则必须提供包括起始密码子ATG的外源性翻译控制信号。此外，该起始密码子必须符合所述蛋白编码序列的可读框，从而确保整个插入片段的翻译。这些外源性翻译控制信号和起始密码子可具有各种各样的起源；所述起源既包括天然的起源，又包括合成的起源。通过包含转录衰减序列、增强子元件等等，可提高表达的效率及增强对表达的控制。在本发明的另一个实施方案中，提供一种用于治疗癌症和其它增生性疾病的方法，所述方法包括传递一种治疗剂到肿瘤中。所述治疗剂包括一种含有MN-CA9启动子驱动的毒性胸苷激酶(Tk)的重组腺病毒载体(Ad)。本发明另外的一个方面，提供一种借助于添加合适的前体药物来调节Tk表达的方法；所述前体药物包括但不限于无环鸟苷(AcV)。在存在一种合适的前体药物的情况下，可以将含所述MN-CA9启动子驱动的毒性基因治疗的治疗剂给予癌；所述癌包括但不限于宫颈癌、肾细胞癌以及胃癌和结肠癌。在再一个实施方案中，所述MN-CA9调节区可编码各种各样的、具有免疫调节功能的基因和/或其它基因；所述具有免疫调节功能的基因例如编码细胞因子如白细胞介素，包括白细胞介素1至15在内，尤其是例如IL2、IL12；γ-干扰素；肿瘤坏死因子；GMCSF；所述其它基因例如为在WO88/00971(CSIRO，AustralianNationalUniversityRamshaw等)和WO94/16716(VirogeneticsCorp；Paoletti等)的说明书中所提到的那些基因。本发明的MN-CA9调节区也可编码下面的基因干扰素α、干扰素β或干扰素γ的基因；肿瘤坏死因子的基因；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的基因、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的基因、巨噬细胞集落刺激因子(N-CSF)的基因，例如嗜中性白细胞激活蛋白NAP、巨噬细胞趋化及激活因子MCAF、RANTES、巨噬细胞炎性肽MIP-1a与MIP-1b的趋化因子的基因、补体组分及其受体的基因，例如87.1、87.2、ICAM-1.2或3的辅助分子的基因，或者细胞因子受体的基因。在插入编码不止一种免疫调节蛋白的核苷酸序列的情况下，它们可包括不止一种细胞因子，或者可以是细胞因子与辅助分子的组合。5.4.1反义核酸调节法、核酶调节法以及三股螺旋调节法在另一个实施方案中，通过用众所周知反义核酸法、基因“敲除”法、核酶法和/或三股螺旋法来降低MN-CA9调节区的表达水平，从而降低MN-CA9调节区活性的水平，可改善与肿瘤细胞有关的病症、紊乱或疾病的症状。在可能显示出调节MN-CA9调节区的活性、表达或合成之能力、包括改善不同癌症及相关疾病的症状之能力的化合物中，有反义分子、核酶分子和三股螺旋分子。可以设计这样的分子，来减少或抑制未受损的或变异的(如果合适)MN-CA9调节区的活性。对于本领域技术人员而言，生产和使用这样分子的技术是众所周知的。反义RNA和DNA分子通过杂交到靶mRNA上并且阻止蛋白质翻译而直接阻断mRNA翻译。反义方法牵涉到设计与靶基因之mRNA互补的寡核苷酸。所述反义寡核苷酸将结合到互补的靶基因之mRNA转录物上，从而阻止翻译。虽然优选完全的互补，但并不需要完全互补。正如在本文中提到的，一种“互补”于RNA一部分的序列意指具有足够的互补性而能够与该RNA杂交形成稳定双链体的序列；因此，在双链反义核酸的情况下，可测试双链体DNA的一条链，或可以分析三链体形成。杂交的能力将既取决于互补的程度，又取决于反义核酸的长度。通常，杂交核酸越长，它可容纳的与一种RNA的碱基错配则越多，且仍可形成稳定的双链体(或三链体，视情况而定)。通过用标准方法确定杂交复合体的解链温度，本领域技术人员能确定容许错配的程度。在一个实施方案中，能够在一种反义方法中运用互补于所关注基因之非编码区的寡核苷酸，来抑制内源mRNA的翻译。反义核酸应该至少长六个核苷酸，最好是长度范围从6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在具体的方面，所述寡核苷酸为至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。无论选择何种靶序列，优选首先进行体外研究，以定量测定反义寡核苷酸抑制靶基因表达的能力。优选这些研究使用鉴别寡核苷酸的基因反义抑制和非特异性生物学效应的对照。同样优选的是，这些研究将靶RNA或蛋白的水平与内部对照RNA或蛋白的水平相比较。另外，设想将用反义寡核苷酸获得的结果与用对照寡核苷酸获得的结果相比较。优选的是对照寡核苷酸与所述试验寡核苷酸具有大致相同的长度，且对照寡核苷酸的核苷酸序列与反义序列的差异仅仅是防止特异性地杂交到所述靶序列上所必需的差异。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA或其嵌合混合物或其衍生物或其修饰形式，可以是单链或者双链。可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链上修饰所述的寡核苷酸，从而例如改善所述分子的稳定性、杂交等等。该寡核苷酸可包括其它的附加基团，例如肽(例如，用于在体内靶向宿主细胞受体)，或有助于穿过细胞膜(参见例如，Letsinger等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A866553-6556；Lemaitre等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A84648-652；1988年12月15日公开的WO88/09810号PCT公开说明书)或者穿越血脑屏障(参见例如1988年4月25日公开的WO89/10134号PCT公开说明书)转运的因子，或杂交触发切割因子(参见例如，Krol等，1988，BioTechniques6958-976)，或嵌入剂(参见例如，Zon等，1988，Pharm.Res.5539-549)。为此，可以将寡核苷酸缀合到另一种分子上，所述另一种分子例如肽、杂交触发交联剂、转运因子、杂交触发切割剂等等。所述反义寡核苷酸可包括至少一个经修饰的碱基部分，所述碱基部分选自5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)w、以及2，6-二氨基嘌呤。所述反义寡核苷酸也可以包括至少一种选自以下的经修饰的糖部分包括但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。在又一个实施方案中，所述反义寡核苷酸包括至少一种经修饰的、选自以下的磷酸主链硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯(phosphordiamidate)、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯、以及formacetal或其类似物。再又一个实施方案中，所述反义寡核苷酸为一种α-端基异构寡核苷酸。α-端基异构寡核苷酸与互补的RNA形成特殊的双链杂合体，在所述双链杂合体中，与通常的β-单位相反，链相互平行地伸展(Gautier等，1987，Nucl.AcidsRes.156625-6641)。该寡核苷酸是一种2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucl.AcidsRes.156131-6148)，或是一种嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBSLett.215327-330)。可以用本
技术领域：
已知的标准方法，例如通过用一台DNA自动合成仪(例如市售的，来自Biosearch、AppliedBiosystems)，来合成本发明的寡核苷酸。作为实例，可以用Stein等的方法(1988，Nucl.AcidsRes.163209)，来合成硫代磷酸寡核苷酸；通过用可控孔隙的玻璃聚合体支持物，可制备甲基膦酸寡核苷酸(Sarin等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A857448-7451)；等等。虽然能够用互补于靶基因编码区序列的反义核苷酸，但最优选互补于转录的非翻译区的那些反义核苷酸。应该将反义分子传递到体内表达所述靶基因的细胞之中。已发展了许多用于传递反义DNA或RNA至细胞的方法，例如，可以将反义分子直接注射到组织部位里，或者，可系统地给予设计用于靶向所需细胞的经修饰的反义分子(例如，与特异性结合靶细胞表面上表达的受体或抗原之肽或抗体相连接的反义分子)。一种达到足以抑制内源mRNA翻译的反义分子胞内浓度的优选方法利用一种重组DNA构成物；在所述构成物中，反义寡核苷酸被置于强启动子polIII或polII的控制之下。用这样的构成物来转染患者体内的靶细胞，将导致足够量的、将与内源靶基因转录物形成互补碱基对因此阻止靶基因之mRNA翻译的单链RNA的转录。例如，可引入一种载体，以致于例如该载体被细胞吸收，并且指导反义RNA的转录。只要这样的载体能被转录而产生所需的反义RNA，则它可以以附加体保持，或成为染色体整合的。用本领域标准的重组DNA技术方法，可构建这样的载体。载体可以是用于在哺乳动物细胞中复制与表达的质粒、病毒载体或本
技术领域：
已知的其它载体。用本
技术领域：
已知在哺乳动物细胞中且最好在人细胞中起作用的任何启动子，可以进行编码反义RNA序列的表达。这样的启动子可以是诱导型或组成型的。这样的启动子包括但不限于SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature290304-310)、劳斯肉瘤病毒的包含于3’长末端重复序列中的启动子(Yamamoto等，1980，Cell22787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A781441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等，1982，Nature29639-42)等等。可以用任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体，来制备能被直接引入到所述组织部位中的重组DNA构成物。另一方面，可以用选择性感染所需组织的病毒载体，在这种情况下，可以由别的途径来完成给予(例如经静脉内给予、口服给予或诸如此类的系统给予)。也可以用设计用以催化切割靶基因之mRNA转录物的核酶分子，来阻止靶基因之mRNA的翻译，且因此阻止靶基因产物的表达(参见例如，1990年10月4日公开的PCT国际公布说明书WO90/11364；Sarver等，1990，Science2471222-1225)。核酶是能够催化特异性切割RNA的酶性RNA分子。(有关综述，参见Rossi，1994，CurrentBiology4469-471)。核酶作用的机制涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交和随后的内切核酸切割事件。核酶分子的组成必须包括一段或更多段互补于靶基因之mRNA的序列，且必须包括众所周知的负责切割mRNA的催化序列。对于这一序列，参见例如5,093,246号美国专利；通过引用，将其全部结合到本文中。虽然可以用在特异性识别位点切割mRNA序列的核酶，来破坏靶基因的mRNA；但优选使用锤头状核酶。锤头状核酶在与靶mRNA形成互补碱基对的侧翼区所限定的位置上切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有下面的两个碱基的序列5’-UG-3’。锤头状核酶的结构及产生是本
技术领域：
众所周知的，且在下述文献中有更全面的描述Myers，1995，MolecularBiologyandBiotechnologyAComprehensiveDeskReference，VCHPublishers，NewYork，(尤其参见第833页的图4)，以及Haseloff和Gerlash，1998，Nature，334585-591；通过引用，将所述文献全部结合到本文中。最好将核酶工程化，以便使切割识别位点位于靶基因之mRNA的5’末端附近；即提高效率且将细胞内无功能mRNA转录物的积累减至最小量。本发明的核酶也包括RNA内切核酸酶(在下文称为“Cech型核酶”)，例如天然存在于嗜热四膜虫(Tetrahymenathermophila)中的且已被ThomasCech及合作者多方面描述的一种RNA(称为IVS或L-19IVSRNA)内切核酸酶(Zaug等，1984，Science，224574-578；Zaug和Cech，1986，Science，231470-475；Zaug等，1986，Nature，324429-433；已公布的UniversityPatentsInc.的WO88/04300号国际专利申请；Been和Cech，1986，Cell，47207-216)。Cech型核酶具有一个八个碱基对的活性位点，所述活性位点与靶RNA序列杂交，在所述杂交后发生靶RNA的切割。本发明包括那些靶向存在于靶基因中的八个碱基对活性位点之序列的Cech型核酶。与在反义方法中一样，所述核酶可由经修饰的寡核苷酸组成(例如为了改善稳定性、寻靶等等)，且应该将其传递到体内表达靶基因的细胞之中。一种优选的传递方法涉及使用一种在组成型强启动子polIII或polII控制下“编码”核酶的DNA构成物，以致转染的细胞将产生足够量的核酶来破坏内源靶基因信息而抑制翻译。因为核酶不同于反义分子，是催化性的，所以由于其效率而需要较低的细胞内浓度。也可以通过用定向同源重组，来使靶基因或其启动子失活、或“剔除”靶基因或其启动子，从而减少内源靶基因的表达(例如参见Smithies等，1985，Nature317230-234；Thomas和Capecchi，1987，Cell51503-512；Thompson等，1989，Cell5313-321；通过引用，将它们中的每篇全部结合到本文中)。例如，可以用一种带有或没有一种选择标记和/或一种负选择标记的、邻接与内源靶基因(或者靶基因的编码区、或者靶基因的调节区)同源的DNA的变异型无功能靶基因(或一种完全不相关的DNA序列)，来转染在体内表达靶基因的细胞。通过定向同源重组插入DNA构成物，导致所述靶基因失活。这样的方法特别适合于农业领域；在所述农业领域中，修饰ES(胚胎干)细胞可以被用来产生具有无活性靶基因的动物后代(例如参见Thomas和Capecchi，1987以及Thompson，1989，参见上文)。但是，如果用合适的病毒载体，来直接给予所述重组DNA构成物，或使重组的DNA构成物靶向体内所要求的位点；则可以使这种方法适合于人类使用。另一方面，可通过把互补于靶基因调节区的脱氧核糖核酸序列(即靶基因的启动子和/或增强子)作为靶，来形成在体内靶细胞中阻止靶基因转录的三链螺旋结构，而减少内源靶基因的表达。(通常参见Helene，1991，AnticancerDrugDes.，6(6)569-584；Helene等，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.，66027-36；以及Maher，1992，Bioassays14(12)807-815)。待用于形成三链螺旋以抑制转录的核酸分子应该是单链的且应该由脱氧核糖核酸组成。必须设计这些寡核苷酸的碱基组成，以促进借助于碱基配对法则的三链螺旋的形成；这通常需要存在于双链体之一条链上的相当大的嘌呤或嘧啶序列段。核苷酸序列可以是基于嘧啶的序列，这将产生横过所得到的三链螺旋之三条相联链的TAT和CGC+三联体。富含嘧啶的分子提供与双链体中平行于该嘧啶链的一条单链上之富含嘌呤区的碱基互补性。另外，可以选择富含嘌呤例如含有一段G残基的核酸分子。这些分子将和富含GC对的DNA双链体形成三链螺旋，在该三链螺旋中，大部分嘌呤残基位于靶双链体的一条链上，产生横过三链螺旋中的三条链的GGC三联体。另一方面，通过产生一种所谓的“之字形(switchback)”核酸分子，可增加可以作为靶以供三链螺旋形成的潜在序列。以一种交替的5’-3’、3’-5’的方式，来合成之字形分子；这样以使它们首先与双链体的一条链进行碱基配对，然后与另一条链进行碱基配对；从而省去了对双链体之一条链上存在相当大的嘌呤或嘧啶序列段的需要。在利用本文描述的反义分子、核酶分子和/或三链螺旋分子来抑制变异基因表达的情况下，可能是所述技术可如此有效地减少或抑制由正常靶基因之等位基因产生的mRNA的转录(三链螺旋)和或翻译(反义分子、核酶)，以致存在的正常靶基因产物的浓度可能低于正常表型所必需浓度的可能性可能上升。因此，在这样的情况下，为了确保维持靶基因活性的大体上正常的水平，可通过基因治疗的方法，将编码和表达显示正常靶基因活性之靶基因多肽的核酸分子引入到细胞中；所述基因治疗的方法例如在下面5.4.2节中描述的不包含对正在使用反义分子、核酶或三链螺旋处理的任何一种敏感之序列的那些方法。另一方面，在靶基因编码一种胞外蛋白的情况下，为了维持必要的靶基因活性水平，共给予正常的靶基因蛋白也许是优选的。用正如上面讨论的、本
技术领域：
已知的、用于DNA和RNA分子合成的任何方法，可制备本发明的反义RNA和反义DNA、核酶以及三链螺旋分子。这些方法包括本领域众所周知的化学合成寡脱氧核糖核苷酸和寡核糖核苷酸的技术，诸如例如固相亚磷酰胺化学合成法之类的技术。另一方面，通过在体外和体内转录编码反义RNA分子的DNA序列，可产生RNA分子。可以将这样的DNA序列插入到各种各样的、含有合适RNA聚合酶启动子例如T7或SP6聚合酶启动子的载体中。另一方面，可以将组成型或诱导型地合成反义RNA的反义cDNA构成物稳定引入到细胞系中；所述的组成型或诱导型取决于所用的启动子。5.4.2基因替代治疗可使用在上面5.1节中描述的本发明的核酸序列来转移重组核酸序列到细胞之中，且在受体细胞中表达所述的序列。可以使用这样的技术，例如将其用于标记细胞、或用来治疗各种各样的癌症和相关疾病。这种治疗可以是以基因替代治疗的形式。具体地讲，可以用载体将指导显示正常基因功能之基因产物生产的正常基因或所述基因一部分的一个或更多个拷贝引入到患者体内的合适细胞中；所述载体除了例如脂质体的将DNA引入到细胞中的其它粒子之外，包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体以及反转录病毒载体。将基因引入到哺乳动物细胞中以供表达的方法是本领域众所周知的。通常，对于这样的基因治疗方法，则直接将核酸体内给予到一种表达MN-CA9调节区的靶细胞或转基因小鼠中；其中所述MN-CA9调节区可操作地连接于一种异源编码序列。用本
技术领域：
已知的任一方法，可完成这一步；例如，通过将其构建为合适的核酸表达载体之一部分，且将其给予，以致它成为细胞内的；例如通过用一种缺陷型或减毒型反转录病毒载体或其它病毒载体感染(参见4,980,286号美国专利)；通过直接注射裸露的DNA；通过用微粒轰击(例如，一种基因枪；Biolistic，Dupont)；通过用脂质、细胞表面受体或转染剂包被；通过包封于脂质体、微粒或微囊中；通过以连接到一种已知进入细胞核的肽上的方式给予所述核酸；或者通过以连接到一种易受受体介导的胞吞作用之配体上的方式，给予所述的核酸(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.2624429-4432)，这可被用来靶向特异性表达所述受体的细胞类型。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合体，在所述复合体中，所述配体包含一种病毒基因融合肽以破坏内体，从而允许该核酸避免溶酶体的降解。在再一个实施方案中，通过靶向特异性受体，可使所述核酸在体内定向，供细胞特异性吸收及表达(参见例如，1992年4月16日公布的PCT公开说明书WO92/06180，1992年12月23日公布的PCT公开说明书WO92/22635，1992年11月26日公布的PCT公开说明书WO92/20316，1993年7月22日公布的PCT公开说明书WO93/14188，1993年10月14日公布的PCT公开说明书WO93/20221)。另一方面，可以将所述核酸引入细胞内，并通过同源重组使其在宿主细胞DNA内插入，而用于表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868932-8935；Zijlstra等，1989，Nature342435-438)。因为可以在脑中表达本发明的核酸，所以这样的基因替代治疗技术理应能够传递基因序列到患者体内的这些细胞类型。因此，在一个实施方案中，可以用本领域技术人员众所周知的技术(参见例如1988年4月25日公开的WO89/10134号PCT公开说明书)，使基因序列能够容易地穿过血脑屏障且传递所述序列至脑中的细胞。关于能够穿过血脑屏障的传递，病毒载体是优选的，所述病毒载体例如诸如上面描述的那些病毒载体之类的。在另一个实施方案中，用于传递的技术涉及直接给予，例如，通过立体定向(stereotactic)传递这样的基因序列到所述细胞中将表达所述基因序列的位点。可以用来增加基因表达和/或基因产物活性总体水平的另外方法包括运用上面描述的定向同源重组法，通过插入一种异源DNA调节元件，以使所插入的调节元件可操作地与所讨论的内源基因相连接，从而来改变细胞或微生物中内源基因的表达特性。因此，可用定向同源重组来激活“转录沉默的”(即不正常表达的或以非常低的水平正常表达的)内源基因的转录、或增强正常表达的内源基因的表达；所述“转录沉默的”。此外，通过按足以改善各种各样癌症及相关疾病之症状的位置和数量引入合适的表达靶基因的细胞(优选自身细胞)到患者体内，可增加靶基因表达和/或基因产物活性的总水平。这样的细胞或者可以是重组的，或者可以是非重组的。如果待给予的细胞是非自体细胞，则可以用众所周知的防止宿主针对所引入细胞之免疫应答产生的技术，将其给予。例如，可以以包封形式引入所述细胞，所述封装的形式虽然与紧靠的细胞内环境交换组分，但不允许所引入的细胞被宿主的免疫系统识别。另外，用本领域技术人员众所周知的标准技术，可给予能够调节MN-CA9调节区之活性的化合物，例如借助于诸如上面描述的那些技术之类的技术鉴别的那些化合物。在待给予的化合物将涉及与脑细胞的相互作用的情况下，所述给予技术应该包括众所周知的便于穿过血脑屏障的技术。5.5药用制剂和给药方法可以以治疗有效剂量，将所确定的改变MN-CA9调节区活性或基因产物活性的化合物给予患者，以治疗或改善各种各样癌症及相关疾病的症状。治疗有效剂量是指足以导致改善这样一种疾病的症状的所述化合物之量。5.5.1有效剂量可以按标准的药学方法，用细胞培养物或实验动物来测定这样的化合物的毒性和疗效；例如，测定LD50(致死达群体的50％的剂量)和ED50(在群体的50％中有治疗效应的剂量)。毒性作用和治疗作用之间的剂量比率为治疗指数，且可以将其以比率LD50/ED50来表示。优选显示出大治疗指数的化合物。虽然可使用呈现毒副作用的化合物，但为了将对非感染细胞的潜在损害减至最小，且因此减少副作用，则应该小心设计把这样的化合物靶向受影响组织之位点的传递系统。在制订出人用的剂量范围方面，可以使用得自细胞培养物测定及动物研究的数据。这样的化合物的剂量最好保持在包括几乎没毒性或无毒性的ED50的循环浓度范围内。该剂量可以随所用的剂量形式和所利用的给药途径而在这范围内变化。对用于本发明方法的任何化合物，可根据细胞培养物测定而初步估计治疗有效剂量。可以用动物模型制订出一种剂量，以达到包括用细胞培养物确定的IC50(即达到症状之半最大抑制的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。可使用这样的信息，更准确地确定人用的有用剂量。例如用高效液相层析，可测量血浆中的水平。5.5.2制剂与使用可以用一种或更多种生理上可接受的载体或赋形剂，以常规方式配制按照本发明使用的药用组合物。因此，可配制所述化合物及其生理上可接受的盐及溶剂化物，用于通过吸入或吹入法(或者通过口、或者通过鼻)或口服、口腔含化、非肠道、或直肠给药来给予。对于口服给予，所述药用组合物可采取例如按常规方法用药学可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预胶凝玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)、崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)、或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。片剂可以按本
技术领域：
众所周知的方法来包衣。用于口服给予的液体制剂可采取例如溶液、糖浆或混悬剂的形式，或者可以将它们作为一种使用前用水或其它合适溶媒来配制的干制品提供。可以按常规方法用药学上可接受的添加剂来制备这样的液体制剂，所述添加剂例如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水溶媒(例如杏仁油、油状酯、乙醇或分级植物油)、以及防腐剂(例如，甲基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。当合适时，所述的制剂也可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂以及甜味剂。可以适当地配制用于口服给予的制剂，从而产生所述活性化合物的控释。至于口腔含化给予，组合物可采取按常规方式配制的片剂或锭剂的形式。至于通过吸入给予，通过使用一种合适的抛射剂，以来自加压包装或雾化器的气雾剂喷雾呈现形式，方便地传递按照本发明而使用的化合物；所述抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在加压气雾剂的情况下，可通过提供一种阀来送递计量的量，从而确定剂量单位。可以配制供吸入器或吹入器用的、例如明胶的胶囊和药筒，所述胶囊和药筒包含所述化合物与例如乳糖或淀粉的一种合适粉末基质的粉剂混合物。可以配制通过注射而非肠道给予的化合物，所述通过注射例如通过大剂量注射或连续输注。可以以单位剂量的形式，例如在安瓿中或在多剂的容器中，添加一种防腐剂，提供用于注射的制剂。所述组合物可采用像油状溶媒或含水溶媒中的混悬剂、溶液或乳剂这样的形式，且所述组合物可包含例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂(formulatoryagents)。另一方面，该活性成分可以呈粉剂状态，供使用前与一种例如无热原无菌水的合适溶媒配制。也可以将所述的化合物配制成直肠组合物，例如如包含常规栓剂基质例如可可脂或其它甘油酯的栓剂或保留灌肠剂。在某些实施方案中，将本发明的药用组合物局部给予需要治疗的区域可能是所希望的。这可以通过例如(但不限于)以下的方法来实现通过在外科手术期间的局部输注、例如在外科手术后连同伤口敷料一起的局部应用，通过注射，借助于导管，用栓剂，或者借助于移植物，所述移植物为多孔材料、非多孔材料或凝胶材料，包括例如sialastic膜的膜或纤维材料。在一个实施方案中，给予可以是通过在恶性肿瘤或肿瘤组织或肿瘤发生前组织之位点的直接注射。对于局部应用，可以将所述化合物与一种载体混合，以便基于所需活性而传递有效的剂量。除了先前描述的制剂外，也可以将所述化合物配制成一种缓释型制剂。可通过移植(例如皮下或肌内移植)或通过肌内注射而给予这种长效制剂。因此，例如，可以用合适的聚合材料或疏水材料(例如作为在一种可接受油中的乳剂)或离子交换树脂，来配制所述化合物；或者可配制作为微溶衍生物例如作为一种微溶盐的所述化合物。如果需要，则可以在可包含一份或更多份含有活性成分之单位剂量形式的包装或分配装置中提供所述组合物。该包装可例如包括金属箔或塑料箔，例如泡罩片。所述包装或分配装置可附有给药说明。6.引用的参考文献在这里描述和要求保护的本发明不应该被限制于本文公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案用来作为本发明几个方面的说明。任何等同的实施方案都将落在本发明的范围内。实际上，对于本领域技术熟练人员而言，根据先前的描述，除了本文显示与描述的以下的本发明各种各样的修改将成为显而易见的。这样的修改属于所附权利要求书的范围。通过引用，将本说明书中提到所有出版物、专利及专利申请结合到本文中，从而达到与具体而单独地表明通过引用结合每个单独的出版物、专利或专利申请相同的程度。权利要求1.一种分离的多核苷酸或其转录活性片段，该寡核苷酸包括图1所示的核苷酸序列。2.一种分离的多核苷酸或其互补物，所述多核苷酸在高度严格条件下与权利要求1的任何一种分离的多核苷酸杂交。3.一种重组载体，所述载体包含权利要求2的分离的多核苷酸。4.一种表达载体，所述载体包含权利要求2的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸与一种控制在宿主细胞内所述核酸表达的调节核酸可操作相连。5.一种基因工程细胞，所述细胞包含权利要求2的分离的多核苷酸。6.一种非人类的转基因动物，所述动物已被基因工程化，从而包含一种包括权利要求2之分离的多核苷酸的转基因。7.一种治疗剂，所述治疗剂包含一种MN-CA9启动子、一种传递载体以及一种毒性、治疗和/或异源编码序列。8.权利要求7的治疗剂，所述治疗剂还包括一种前体药物。9.权利要求8的治疗剂，其中所述的前体药物选自无环鸟苷(“ACV”)和更昔洛韦(“GCV”)。10.权利要求7的治疗剂，其中所述的传递载体包括一种病毒载体。11.权利要求10的治疗剂，其中所述的病毒载体是腺病毒。12.权利要求7的治疗剂，其中所述的传递载体包括一种脂质体。13.权利要求7的治疗剂，其中所述的毒性编码序列选自胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶。14.权利要求7的治疗剂，其中所述的治疗编码序列选自生长因子、细胞因子、治疗蛋白、激素和激素的肽片段、细胞因子的抑制剂、肽生长与分化因子、白细胞介素、趋化因子、干扰素、集落刺激因子以及血管生成因子。15.权利要求7的治疗剂，其中所述的异源编码序列是一种报道基因。16.权利要求15的治疗剂，其中所述的报道基因是一种荧光素酶。17.一种鉴定能够调节肿瘤特异性基因表达的试验化合物的方法，所述方法包括(a)使化合物与在MN-CA9调节区或其转录活性片段控制下表达一种报道基因的细胞接触；以及(b)测量该报道基因在存在和不存在所述试验化合物情况下的表达水平，因此如果在存在所述试验化合物的情况下所获得的水平不同于当所述试验化合物不存在时所获得的水平，那么则鉴定出调节肿瘤特异性基因表达的化合物。18.权利要求17的方法，其中所述报道基因的表达产生一种荧光信号。19.一种药用组合物，所述组合物包括按权利要求17鉴定出的试验化合物。20.一种用于药物传递的方法，该方法包括将一种载体引入到受治疗者的肿瘤中，所述载体包含一种可操作地连接异源基因的MN-CA9调节区序列或其转录活性片段。21.一种治疗和/或改善癌症或其它增生性疾病的方法，所述方法包括向受治疗者的所述癌症或其它增生性疾病的细胞中，引入一种包含MN-CA9调节区序列或其转录活性片段、一种传递载体以及基因产物能够杀伤所述细胞的一种毒性、治疗和/或异源编码序列的载体。22.权利要求21的方法，其中所述的癌症或其它增生性疾病选自宫颈癌、肾细胞癌、结肠癌以及胃癌。23.权利要求21的方法，该方法还包括引入一种前体药物。24.权利要求23的方法，其中所述的前体药物选自ACV和GCV。25.权利要求21的方法，其中所述的引入包括经直接应用的给予、或者通过静脉内给予、动脉内给予、肿瘤内给予、灌注以及口服给予的系统性应用。全文摘要本发明涉及指导在肿瘤细胞内表达的启动子、增强子和其它调节元件，包括来自控制肾细胞癌相关蛋白MN－CA9表达的5’调节区的核苷酸序列及其转录活性片段。特别提供表达其中MN－CA9调节区能够控制异源基因表达、能够过量表达内源基因或病理过程的抑制剂、或者能够使在癌症发生和/或发展中被认为是重要的特定基因的表达失效的载体、宿主细胞和转基因动物。本发明也涉及使用所述载体、细胞和动物来筛选作为癌症发生和/或发展之激动剂和拮抗剂的候选分子的方法。本发明另外涉及调节肿瘤细胞内化合物表达的组合物和方法，且涉及筛选调节肿瘤细胞内表达之化合物的组合物与方法。也提供应用通过筛选测定而鉴定的分子与化合物进行治疗性治疗的方法。文档编号A61P35/00GK1447920SQ01813165公开日2003年10月8日申请日期2001年5月24日优先权日2000年5月25日发明者T·A·加纳,C·考,S·－C·柯,F·杨,L·W·K·钟申请人:弗吉尼亚大学专利基金会