DICKKOPF 3b的抗肿瘤性的制作方法
【专利说明】DICKKOPF3b的抗肿瘤性
[0001] 关于联邦资助的研宄或开发的声明
[0002] 美国政府对依照NIH对马萨诸塞医学院（UniversityofMassachusettsMedical School)的资助Nos.DK038772和DK060051的本发明拥有一定权利。
[0003] 优先权主张和相关专利申请
[0004] 本申请要求2012年3月26日提交的美国临时申请系列号61/615, 514的优先权 利益，所述临时申请的全部内容通过引用为所有目的整体并入本文。
技术领域
[0005] 总的来说，本发明涉及DKK3b的肿瘤抑制性和功能及其抗肿瘤应用和用途。更具 体来说，本发明涉及利用DKK3b的肿瘤抑制功能，例如通过DKK3b或相关药剂的定位给药 (site-specificdelivery)来治疗肿瘤和癌症的新疗法和方法。
[0006] 发明背景
[0007] 受抑制的Dickkopf-3(DKK3)表达是许多人类癌症的标志，并且表达水平与肿瘤 的毒性反相关（例如，在前列腺癌和卵巢癌中）。以前列腺癌为例，DKK3的过表达使前 列腺癌细胞的增殖中止，但是在前列腺癌的体内和离体模型两者中DKK3过表达的有益结 果，可能是在细胞中无意地启动ER应激反应以尝试对过表达的外源分泌性基因产物进 行加工所造成的人为现象（Abarzua等，2005CancerRes65(21) :9617_22;Abarzua等， 2008 BiochemBiophysResCommun375(4):614-8;Abarzua等，2007IntJMolMed 20(1) : 37-43)。
[0008] 也已报道，DKK3的肿瘤抑制活性是由它通过形成由~30kDa的细胞质DKK3基因产 物和|3TrCP构成的失活复合物而阻断0-连环蛋白向细胞核移位的能力造成的（Lee等， 2009 IntJCancer124 (2): 287-97)。由于长期ER应激不可能是内源DKK3基因产物影响 正常细胞增殖的机制，因此DKK3的非分泌性细胞内形式的确定和有利于生长停滞的两个 细胞内事件（JNK激活和连环蛋白失活）的发现，为明确在前列腺中介导DKK3肿瘤抑 制功能的分子事件提供了机会。
[0009] 由Dr.Leonard和同事进行的早期研宄发现，DKK3基因座编码第二转录本，其产生 细胞内膜结合的 29kDa蛋白（intracellularmembraneassociated29kDaprotein，以 前称为D2p29,现在重命名为DKK3b)(Leonard等，2000JBiolChem275 (33): 25194-201; Farwell等，1996JBiolChem271 (27): 16369-74;Safran等，1996JBiolChem 271 (27): 16363-8;Farwell等，1993JBiolChem268 (7): 5055-62)。
[0010] 随后的研宄揭示，该DKK3b基因产物源自于位于内含子2中的第二转录起始位点。 Dkk3b最初在星形细胞中被确定为以高亲和力结合甲状腺激素的高运载膜蛋白。DKK3基因 座的分析揭示，DKK3b由外显子3-8编码，并且带有TATA盒的功能转录起始位点位于内含 子2中（图1A)。启动子定位（promotermapping)研宄将启动子活性缩窄到外显子3上 游~250碱基。TATA盒的缺失阻断启动子功能。ChIP分析揭示出该启动子在体内是功能 的（图1B)。
[0011] 重要的是，在全长DKK3和截短DKK3bmRNA两者中，只有真正的Kozak起始位点位 于始于外显子3的Met处，并且全长DKK3amRNA通过Kozak序列依赖性条件的体外翻译产生 29kDa蛋白（Leonard等，2000JBiolChem275 (33): 25194-201)QDKK3 基因座转录本的实 时PCR分析揭示，DKK3a转录本（外显子2-8)占总DKK3mRNA的~55 %，而DKK3b转录本（外 显子3-8)占总DKK3mRNA的~45 %。在缺少外显子2的ADKK3小鼠中，全长DKK3a转录本 丢失，但DKK3bmRNA被保留（图lC)(Barrantes等，2006MolCellBiol26(6):2317-26)〇 与ADKK3小鼠脑的细胞膜结合的DKK3b的亲和标记产生了预期的免疫反应性DKK3b，而全 长的糖基化01?3未被合成（图30)$31￥611等，1989 181〇1〇16111264(34):20561-7)。这 些数据证实，DKK3基因座编码两种功能性转录本；一种编码分泌性糖蛋白被确定为DKK3a， 另一种编码29kDa的细胞内DKK3b蛋白。
[0012] 对于建立利用DKK3b的肿瘤抑制功能来治疗癌症的新疗法，例如能够阻滞各种癌 症例如卵巢癌和前列腺癌的生长的治疗方法和药物组合物，仍存在持续不断的需求。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明提供了利用DKK3b的肿瘤抑制功能来治疗癌症的新的治疗方法。确定到一 种源自于Dkk3基因座的内部转录起始位点并具有所有抗癌性质的新的肿瘤抑制物。与全 都针对由全长的分泌性糖基化DKK3基因产物的外源表达造成的人为ER应激反应的当前治 疗尝试不同，本发明有希望带来一种改变领域方向的独特方法。
[0015] -方面，本发明总的来说涉及确定到的人类DKK3b蛋白。
[0016] 另一方面，本发明总的来说涉及被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白的重组病毒。
[0017] 另一方面，本发明总的来说涉及包含编码DKK3b蛋白的多核苷酸序列的分离的核 酸分子。
[0018] 另一方面，本发明总的来说涉及包含编码DKK3b蛋白的多核苷酸的重组转入基 因。
[0019] 另一方面，本发明总的来说涉及分离的重组人类DKK3b蛋白。
[0020] 另一方面，本发明总的来说涉及用分离的重组人类DKK3b蛋白转化的宿主细胞。
[0021] 另一方面，本发明总的来说涉及包含被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白的重组病 毒和可药用载体的药物组合物。
[0022] 另一方面，本发明总的来说涉及一种在需要的对象中治疗癌症或抑制肿瘤进展的 方法，所述方法包括向所述对象给药包含被遗传修饰以表达人类DKK3b蛋白的重组病毒和 可药用载体的药物组合物。
[0023] 另一方面，本发明总的来说涉及包含人类DKK3b蛋白和可药用载体的药物组合 物。
[0024] 另一方面，本发明总的来说涉及一种在需要的对象中治疗癌症或抑制癌症进展的 方法，所述方法包括向所述对象给药包含DKK3b蛋白的药物组合物。
[0025] 另一方面，本发明总的来说涉及一种在需要的对象中诱导肿瘤抑制效应的方法， 所述方法包括向所述对象给药包含DKK3b蛋白的药物组合物。
[0026] 可能按照本公开的发明治疗性治疗的癌症可以是任何类型的癌症，包括癌、淋巴 瘤、母细胞瘤、肉瘤、脂肪肉瘤、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、神经鞘瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、 白血病、淋巴恶性肿瘤、鳞状细胞癌、上皮鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺 的腺癌、肺的鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、 卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、 唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴莖癌、睾丸癌、食管癌、胆道 肿瘤和头颈癌。
[0027] 发明详述
[0028] 本发明涉及利用DKK3b的肿瘤抑制功能来治疗癌症的新疗法。更具体来说，确定 一种源自于Dkk3基因座的内部转录起始位点的新的肿瘤抑制物，并且该基因产物具有该 基因的所有抗癌性。与全都针对由全长的分泌性糖基化DKK3基因产物的外源表达造成的 人为ER应激反应的当前治疗尝试不同，本发明有望带来一种改变领域方向的独特方法。
[0029] 通过Wnt通路信号传导分子连环蛋白的未经检验的信号传导在癌症中是常见 的，并且Dickkopf相关蛋白3(DKK3)是最有希望控制连环蛋白水平的肿瘤抑制分子之 一。肿瘤的恶性与DKK3水平反相关，并且在几乎所有癌细胞中过表达阻滞细胞增殖。尽管 DKK3不阻断通过Wnt的受体激活，但广泛推测分泌的DKK3糖蛋白的抗癌作用是由Wnt受体 复合物的抑制造成的。然而，最近的报道挑战了DKK3作用的这种传统观点。酵母双杂交分 析揭示DKK3与泛素连接酶、0-转导重复相容蛋白（0-transducinrepeatscontaining protein，f3TrCP)相互作用，并且随后的免疫共沉淀研宄将DKK3确定为与（f3TrCP)和 连环蛋白的阻止连环蛋白的核移位的细胞内复合物的一部分，该细胞内复合物阻 止连环蛋白的核移位。也已显示，DKK3激活N-端Jun激酶（JNK)应激通路，引起癌细 胞丧失损失（cellloss)。这些发现说明了通过DKK3进行的细胞内信号传导的重要作用。 最近，我们发现Dkk3基因座编码两种基因产物，一种不影响Wnt信号传导的分泌的糖蛋白 (DKK3a)，以及一种抑制Wnt信号传导的新的细胞内蛋白DKK3b。我们提出，细胞内DKK3b负 责这胞内DKK3a对该肿瘤抑制物的已发表的抗癌效应，并通过阻断连环蛋白的核转位 (nuclearimport)和增加细胞死亡这两种阻滞细胞生长和繁殖的基础细胞事件起作用。
[0030] DKK3b作用的分子机制
[0031] 存在下列共识：l)Dkk3表达水平与肿瘤恶性反相关，并且2)DKK3过表达阻滞 癌细胞增殖（Lodygin等，2005CancerRes65 (10) : 4218-4227;Veeck等，2008Breast CancerRes10(5):R82;Veeck等，2012BiochimBiophysActa1825(1): 18-28;Yue等， 2008Carcinogenesis29(1): 84-92;Edamura等，2007Cancer