皂苷的提纯方法
【专利说明】皂苷的提纯方法 发明领域
[0001] 本公开涉及生物制品的提纯。本公开更具体涉及可用作佐剂的皂苷的提纯。
[0002] 发明背景 植物界中广泛存在的皂苷、留类糖苷或三萜糖苷具有广泛的医药和商业用途。一些植 物物种的皂苷已表明可用作可用于增强对特定抗原的免疫应答的佐剂。一些类型的植物皂 苷佐剂不仅增强对抗原的免疫应答，还优先诱发特定类型的细胞介导的免疫应答。
[0003] 用于提纯药理学可用的皂苷的现有程序在产品一致性、可重构性或均匀性方面未 达到最佳。此外，现有的皂苷提纯方法花费长达14天。
[0004] 考虑到含有皂苷的免疫原性组合物的潜在效用，需要更有效的皂苷提纯方法。
[0005] 发明概述 本公开涉及从包含溶剂的溶液中提纯皂苷的方法。该方法包括对进一步包含增溶组分 的溶剂中包含至少一种皂苷的溶液进行溶剂交换以降低该溶液中的增溶组分的量。在溶剂 交换后，脱除替换后的溶剂以产生干燥皂苷产物。在任选的后继步骤中，利用将干燥皂苷产 物数次暴露在干气体下，接着真空循环以脱除留在干燥皂苷产物内的任何溶剂分子。
[0006] 本发明还要求保护纯化的必Molina阜苷QS-21。通过这种方 法制成的QS-21皂苷产物比经现有方法制成的皂苷产物更均匀。本发明还涉及通过本文中 公开的方法制成的高度纯化的QS-21产物作为疫苗中的免疫佐剂的用途。
[0007] 附图简述 发明详述 引言 本公开涉及制备纯化皂苷，如QS-21的方法。本文中公开的程序通过溶剂交换和任选 随后使纯化皂苷产物至少一次暴露在干气体下、接着暴露在真空下以从该纯化皂苷产物中 进一步除去残留溶剂分子的步骤将必要的冻干周期数降至1。
[0008] 纯化皂苷在医学上、工业上和食品饮料产品中使用。一些皂苷，如从南美树木 Molina的树皮中提取的那些(皂树皂苷)，例如QS-21，具有作为免疫 佐剂的药理价值，因为它们在与抗原共同给药时在诱发强Thl和Th2型免疫应答的同时表 现出低毒性。另外，这样的皂苷已表明引发对一些蛋白质的中等细胞毒性T淋巴细胞应答。
[0009] 为了安全使用，必须将皂苷与其它源自植物的材料(在皂树皂苷的情况下，包括其 它更毒的皂苷）分离。尽管存在用于提纯皂苷的方法，但现有提纯方法花费多达14天。通 过现有方法制成的皂苷可能不均匀。
[0010] 通过本公开的方法的皂苷提纯与现有方法相比提供几个显著益处。具体而言，本 文中公开的方法的益处在于其与现有方法相比可以将大规模皂苷提纯法所需的时间减少 几乎一半。现有方法花费长达14天，而通过本方法的总提纯时间仅为6天。此外，与使用 通常包括多个冻干步骤(其耗时长达两倍）的现有程序获得的纯化皂苷产物相比，通过本文 中公开的方法提纯的皂苷不会保留更多的溶剂或水。最终产物中的水加剧纯化皂苷组合物 中的产物降解。此外，为了它们的安全药理学应用，通常必须从干燥皂苷产物中明显减少溶 剂组分，如有机分子。
[0011] 本文中公开的方法优于现有方法的另一优点在于，由于不需要二次冻干，其产生 比需要两个冻干步骤的现有方法更均匀的干燥皂苷产物。
[0012] 因此，本公开的一个方面涉及制备高度纯化的皂苷组合物的方法。本文中公开的 方法产生几乎至完全不含残留水或溶剂分子的高度均匀的纯化皂苷产物。本文中的公开提 供了如下提纯溶液中的至少一种皂苷的方法：提供在包括增溶组分的第一溶剂中的至少一 种皂苷；用交换溶剂替换至少一部分增溶组分，由此产生替换后的溶剂；脱除所述替换后 的溶剂，以产生包括至少一种皂苷的干燥皂苷产物；和任选使所述干燥皂苷产物与干气体 接触以使留在所述干燥皂苷产物中的任何溶剂分子分散到所述气体中，由此产生气体净化 的干燥皂苷产物。就皂苷的提纯而言，提纯包括提供包含至少一种皂苷的溶液和用交换溶 剂替换至少一部分增溶组分。任选地，在从溶液中提纯之前，可以通过各种化学或色谱法将 皂苷与其它溶液组分(例如植物材料、生物组织、不需要的化学品和分子以及其它碎肩）分 离。
[0013] 增溶组分可包括下列至少一种：水、有机分子、醇、酸或碱。或者，增溶组分可以是 使所述至少一种皂苷完全或部分分散到溶剂中的任何分子。在一些实施方案中，增溶组分 可包括有机分子。例如，增溶组分可包括乙腈。
[0014] 任选地，在第一溶剂中的皂苷可通过柱色谱法部分提纯。例如，在第一溶剂中的皂 苷可以以HPLC柱洗脱物或苯基色谱柱洗脱物的形式提供。例如，在第一溶剂中的皂苷可以 以C8HPLC柱洗脱物的形式提供。通常，用于皂苷提纯的C8HPLC柱洗脱物包括至少大约 22%乙腈vol/vol。因此，在溶剂中的皂苷可包括至少大约22%。例如，在第一溶剂中的皂苷 可包括至少大约50%乙腈。在第一溶剂中的皂苷也可以包括大约30%至65%体积/体积乙 腈。例如，大约40%至62%体积/体积乙腈是合适的范围。例如，在溶剂中的皂苷可包括大 约58%至62%体积/体积乙腈。在上文规定的乙腈浓度中包括术语"大约"以表明给定的 值是近似值并可变动+或-5%。
[0015] 在获得皂苷在溶剂中的溶液后，可以进行溶剂替换。可以通过用交换溶剂 交换相同或不同体积的第一溶剂来进行至少一部分增溶组分的替换。可以通过渗滤 (diafiltration)、超滤或渗析的任一种实现溶剂替换。通常，替换后的溶剂会含有至少15% vol/vol乙腈但不多于22%vol/vol乙腈。
[0016] 任选地，可以在包括半透容器（containmentvessel)的系统中进行至少一部分增 溶组分的替换，所述半透容器是选择性可透的以在将至少一种皂苷和第一溶剂引入该半透 容器时至少一种溶剂组分会穿过该容器的可透部分并留住至少一种皂苷。例如，所用半透 容器可包括单个半透膜并可通过将包含所述至少一种皂苷和第一溶剂的半透容器浸在交 换溶剂中并使被该膜隔开的溶剂通过扩散达到平衡来实现溶剂替换。
[0017] 或者，该半透容器可包括被至少一个半透结构包围的允许在溶剂中包括所述至少 一种皂苷的溶液透过的通道。在这一实施方案中，可以借助流体静压在相对于容器外部的 正压下使所述至少一种皂苷和第一溶剂流过该容器的通道以迫使该溶液的至少一种组分 穿过该容器的半透部分到达外部(例如该半透结构的未与该通道接触的任何部分）且该溶 液的至少一种分子经过该通道的整个长度。在这一实施方案中，通过将交换溶剂添加到该 容器的内部(例如通道）中，可以用交换溶剂替换至少一部分增溶组分。
[0018] 在另一实施方案中，该半透容器可包括不透性容器，该不透性容器包括被半透膜 隔开的第一隔室和第二隔室。在这一实施方案中，可以将所述至少一种皂苷和第一溶剂置 于该容器的第一隔室中，然后使其相对于第二隔室呈正压以迫使该溶液的至少一种组分穿 过该容器的半透部分并通过将交换溶剂添加到该容器的第一隔室中而用交换溶剂替换至 少一部分增溶组分。
[0019] 在溶剂替换后，可以从皂苷产物中脱除替换后的溶剂以产生干燥皂苷产物。可以 通过下列方法中的任何一种或多种进行替换后的溶剂的脱除：冻干、热暴露或旋转蒸发。在 一个具体实施方案中，利用冻干脱除替换后的溶剂。在实施例部分中提供示例性的冻干程 序。但是，可以通过本领域中已知的基本任何方法进行冻干。任选地，可以在Gore牌一次 性LY0GUARD?托盘中进行冻干。任选地，可以进行多于一个脱除步骤，例如如果需要样品的 进一步干燥。
[0020] 任选地，在溶剂脱除后，可通过使干燥皂苷产物与干气体接触来从干燥皂苷产物 中进一步除去任何残留溶剂分子，以产生气体净化的干燥皂苷产物。任选地，可以在真空中 使干燥皂苷产物与干气体接触。在一些实施方案中，干燥皂苷产物与干气体的接触在高于 700ybar的压力下进行。例如，可以在800ybar的压力下使干燥阜苷产物与干气体接 触。任选地，干燥皂苷产物可以与干气体保持接触至少1分钟。例如，干燥皂苷产物可以与 干气体保持接触5分钟或更久。
[0021] 任选地，在干燥皂苷产物与干气体接触后，脱除干气体。例如，可以通过真空压力 实现这种脱除。在一些实施方案中，通过小于100ybar的真空压力脱除干气体。例如，可 以通过50ybar的真空压力脱除干气体。任选地，可以施加真空压力多于1分钟。例如， 可以施加真空压力30分钟。<