白蛋白结合多肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及具有对白蛋白的结合亲和力的一类工程化的多肽。特别地，本发明涉 及对酶促裂解具有高度耐受性的白蛋白结合多肽（albuminbindingpolypeptide)。
[0002] 背景
[0003] 血清白蛋白
[0004] 血清白蛋白是哺乳动物血清中最丰富的蛋白质（40g/l;在人类中约0. 7mM)，并且 其功能之一是结合例如脂类和胆红素的分子（PetersT,AdvancesinProteinChemistry 37:161，1985)。血清白蛋白的半衰期与动物的大小直接地成比例，其中例如人血清白蛋白 (HSA)具有19天的半衰期且兔血清白蛋白具有约5天的半衰期（McCurdyTR等人，JLab ClinMed143:115, 2004)。人血清白蛋白广泛地分布在体内，特别是在肠和血液区室中，其 中其主要参与维持渗透性。在结构上，白蛋白是包括三个同源结构域以及总计584或585 个氨基酸的单链蛋白质?ugaiczykL等人，ProcNatlAcadSciUSA79:71,1982)。白 蛋白包含17个二硫键和单一反应性C34巯基，但是缺少N-连接的和0-连接的碳水化合物 部分（Peters, 1985，同上；NicholsonJP等人，BrJAnaesth85:599,2000)。糖基化的 缺少简化了白蛋白的重组表达。白蛋白的该特性与其三维结构是已知的（HeXM和Carter DC,Nature358:2091992)事实一起使得它成为在重组融合蛋白中使用的有吸引力的候选 物。这样的融合蛋白通常将治疗蛋白（其在蛋白本身的施用之后从身体快速地清除）和 血衆蛋白（其表现出天然的缓慢清除）组合在单个多肽链中（SheffieldWP，CurrDrug TargetsCardiovacsHaematolDisord1:1，2001)。这样的融合蛋白可提供需要较不频繁 的注射和在体内更高水平的治疗蛋白方面的临床益处。
[0005] 与HSA融合或缔合导致延长蛋白的体内半衰期
[0006] 血清白蛋白缺乏任何酶促或免疫学功能并因此，与生物活性的多肽偶联时不应展 示出非期望的副作用。此外HSA是参与许多天然的以及治疗的分子的内源运输和递送的天 然载体（SellersEM和Koch-WeserMD,"AlbuminStructure,FunctionandUses"，eds RosenoerVM等人，Pergamon,Oxford,第159页，1977)。已经报道了一些策略以将蛋白直 接共价偶联至血清白蛋白或共价偶联至允许在体内与血清白蛋白缔合的蛋白。后一种方法 的实例已被描述在例如W091/01743中。该文件尤其描述了源自链球菌（streptococcal) 蛋白G的白蛋白结合肽或蛋白用于延长其他蛋白半衰期的用途。该构想是使细菌衍生的白 蛋白结合肽/蛋白与在血液中已经显示了具有快速清除的治疗上感兴趣的肽/蛋白融合。 因此产生的融合蛋白在体内与血清白蛋白结合，以及受益于它的更长的半衰期，这延长了 融合的治疗上感兴趣的肽/蛋白的净半衰期。
[0007] 与HSA缔合导致降低的免疫原性
[0008] 除了对生物活性蛋白的体内半衰期的影响，有人提出生物活性蛋白与白蛋白结合 蛋白之间的融合体（fusion)与白蛋白的非共价缔合起到降低生物活性蛋白的免疫反应的 作用。因此，W02005/097202中，描述了使用这一原理以降低或消除对生物活性蛋白的免疫 反应。
[0009] 细菌受体蛋白的白蛋白结合结构域
[0010] 链球菌蛋白G是一种存在于某些链球菌（str印tococci)菌株表面的双功能受 体并且能够与IgG和血清白蛋白二者结合（Bj6rck等人，MolImmunol24:1113,1987)。 这种结构是一些结构上和功能上不同的结构域（Guss等人，EMBOJ5:1567, 1986)，更确 切地说三种Ig-结合基序和三种血清白蛋白结合结构域（Olsson等人，EurJBiochem 168:319,1987)的高度重复。三种血清白蛋白结合结构域之一的结构已经确定，显示了三 螺旋束结构域（three-helixbundledomain)(Kraulis等人，FEBSLett378:190,1996)。 这一基序命名为ABD(albuminbindingdomain，白蛋白结合结构域）并且在大小上是46个 氨基酸残基。在文献中，该基序随后也被称为G148-GA3。
[0011] 除了来自链球菌的蛋白G以外的其他细菌白蛋白结合蛋白也被鉴定，其包含与 蛋白G的白蛋白结合三螺旋结构域相似的结构域。这样的蛋白的实例是PAB、PPL、MAG和 ZAG蛋白。Johansson和他的同事们实施和报道了这样的白蛋白结合蛋白的结构和功能 的研宄（Johansson等人，JMolBiol266:859-865, 1997;Johansson等人，JBiolChem 277:8114-8120, 2002)，他们引入了名称"GA模块（GAmodule)(蛋白G相关的白蛋白结 合模块）"用于负责白蛋白结合的三螺旋蛋白结构域。此外，Rozak等人已经报道了GA 模块的人工变体的创建，该人工变体被选择和研宄了不同物种特异性和稳定性（Rozak等 人，Biochemistry45:3263-3271，2006;He等人，ProteinScience16:1490-1494,2007)。 在本公开内容中，将遵循在Johansson等人和Rozak等人文章中建立的关于来自不同细菌 物种的GA模块的术语。
[0012] 最近，开发了具有各种优化特征的G148-GA3结构域的变体。这样的变体例如公开 在PCT公布TO2009/016043 和TO2012/004384 中。
[0013] 梭菌蛋白酶
[0014] 梭菌蛋白酶，也称为胞内蛋白酶Arg-C，是可以从溶组织梭菌（Clostridium histolyticum)分离的双链蛋白酶。梭菌蛋白酶显示了具有蛋白水解和酰胺酶/醋酶活性 (Mitchell,等人（1968)，JBiolChem243:4683-4692)。梭菌蛋白酶活性据报道在pH范 围7. 6-7. 9内是最佳的。
[0015] 梭菌蛋白酶优先地在精氨酸残基的羧基基团裂解（Labrou等 人（2004)，EurJBiochem271(5):983-92;Keil(1992)，"Specificityof proteolysis",Springer-Verlag,第335页），但是也已经报道了赖氨酰基键的裂解。梭菌 蛋白酶已经显示出接受包含Lys而不是Arg的底物，但是相比于与含有Arg的底物的反应， 反应速率低。例如，已经报道了梭菌蛋白酶在Arg-Arg、Arg-Ala和Lys-Tyr位点裂解胰高 血糖素。这三种键的水解作用的相对初始速率是1、1/7和1/300(Labouesses(1960)，Bull SocChimBiol42:1293-304)。
[0016] 梭菌蛋白酶裂解经常在生物化学和生物技术应用中使用。梭菌蛋白酶裂解的应用 包括肽图谱、序列分析、细胞分离、酰胺键的水解/缩合，以及肽合成。
[0017] 梭菌蛋白酶例如可被使用以裂解用于蛋白纯化和/或检测的标签（例如His6、 c-Myc、Flag和GST标签）。此外，梭菌蛋白酶裂解可在从前体多肽制备酰胺化治疗多肽的 过程中使用，藉以提高治疗多肽在向动物或人类受试对象施用后对内源蛋白酶的蛋白水解 降解作用的耐受性。
[0018] 如从本背景描述的不同节明显的是，对白蛋白具有高度亲和力以及展示对尤其是 梭菌蛋白酶的酶促裂解的高度耐受性的多肽分子的提供在各种生物医学的、生物技术的和 其他应用的开发中是关键因素，并且因此本领域中存在对这样的多肽分子的需求。
[0019] 发明的公开内容
[0020] 本发明的第一方面，通过提供包括白蛋白结合基序（BM)的白蛋白多肽，满足对具 有相对高的白蛋白亲和力和对梭菌蛋白酶裂解的高耐受性的新的多肽的需求，所述基序由 以下氨基酸序列组成：
[0021] GVSDFYKKLIXaKAKTVEGVEALKXbXcI
[0022] 其中，彼此独立地，
[0023] Xa选自D和E;
[0024] Xb选自D和E;以及
[0025] Xc选自A和E。
[0026] 在根据本发明这方面的多肽的一个实施方案中，乂3是D。
[0027] 在根据本发明这方面的多肽的一个实施方案中，Xb是D。
[0028] 在根据本发明这方面的多肽的一个实施方案中，X。是A。
[0029] 考虑到所有以上组合，清楚的是白蛋白结合基序BM的序列选自由SEQIDNO: 1-8 组成的组。在根据本发明这方面的多肽的一个实施方案中，BM的序列是SEQIDNO: 1。
[0030] 为了提供包括白蛋白结合结构域（ABD)或其变体的白蛋白结合多肽，该肽对梭菌 蛋白酶裂解是高度耐受性的，发明人研宄了PEP07843(SEQIDN0:27)的各种变体。发明人 显示了，相比于其他变体，PEP07843对应于如本文定义的BM中位置8的位置处的精氨酸残 基（R)被赖氨酸残基（K)取代，出乎意料地展示了关于蛋白酶稳定性的优越性，在所述其他 变体中这个位置的精氨酸残基已经被与赖氨酸不同的氨基酸取代，所述氨基酸之前没有被 描述为梭菌蛋白酶裂解位点（见实施例3和图3)。
[0031] 因此，鉴于之前的研宄显示梭菌蛋白酶在Lys残基的羧基基团处裂解肽，以上讨 论的Arg-至-Lys的取代突变稳定和改善了白蛋白结合多肽对梭菌蛋白酶裂解的耐受性的 发现是令人意外的和预料不到的。
[0032] 在根据本发明这方面的一个实施方案中，提供了白蛋白结合多肽，其中白蛋白结 合基序形成三螺旋束蛋白结构域的部分。例如，BM