专利名称：鉴定肿瘤特异性新抗原的组合物和方法
技术领域：
本发明一般涉及肿瘤特异性新抗原的鉴定和这些新抗原生产癌症疫苗的用途。
背景技术：
肿瘤疫苗一般由肿瘤抗原和免疫刺激分子(例如细胞因子或TLR配体)组成，其一起工作以诱导识别且裂解肿瘤细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞(CTLs)。在这时，几乎所有疫苗都含有共享的肿瘤抗原或全肿瘤细胞制剂(Gilboa，1999)。共享的肿瘤抗原是跨越许多个体在及WM普遂廣沒表达效免疫jr/i.蛋沒质，并且通常作为合成肽或重组蛋白质递送给患者(Boon等人，2006)。相比之下，全#瘦激激彦/名/作为自体被照射细胞、细胞裂解产物、细胞融合物、热休克蛋白质制剂或总mRNA递送给患者(Parmiani等人,2007)。因为全肿瘤细胞从自体患者中分离，所以细胞表达患者特异性肿瘤抗原以及共享的肿瘤抗原。最后，存在第三类肿瘤抗原，由于鉴定其的技术困难，其已罕见地用于疫苗中(Sensi等人2006)。这个种类由為系辦#涛劳沒突变—组成，所述肿瘤特异性突变导致改变的氨基酸序列。此类突变的蛋白质具有下述潜力:(a)独特地标记肿瘤(相对于非肿瘤细胞)用于由免疫系统识别且破坏(Lennerz等人，2005) ; (b)避免中枢和有时外周T细胞耐受，并且因此由更有效的高亲合力T细胞受体识别(Gotter等人，2004)。因此，存在鉴定作为肿瘤疫苗有用的新表位的方法的需要。发明概述
本发明部分涉及鉴定能够引发肿瘤特异性T细胞应答的肽的方法。在一个方面，本发明提供了通过鉴定具有癌症的受试者的表达基因中的肿瘤特异性突变来鉴定新抗原的方法。在一些方面，当突变是点突变时，该方法进一步包括鉴定具有该突变的突变型肽。优选地，突变型肽以大于野生型肽的亲和力结合I类HLA蛋白质，并且具有小于500 nm的IC50 ;在其他方面，当突变是剪接位点、移码、连读或基因融合突变时，该方法进一步包括鉴定由该突变编码的突变型多肽。优选地，突变型多肽结合I类HLA蛋白质。任选地,该方法进一步包括选择激活抗肿瘤⑶8 T细胞的肽或多肽。突变型肽或多肽优选以大于野生型肽的亲和力结合I类HLA蛋白质，并且具有小于500 nm的IC50。优选地，该肽或多肽具有小于250 nm的IC50。更优选地，该肽或多肽具有小于100 nm的IC50。最优选地，该肽或多肽具有小于50 nm的IC50。突变型肽长度为约8-10个氨基酸。在另一个方面，长度为约8-50个氨基酸。例如，突变型肽长度大于10个氨基酸、长度大于15个氨基酸、长度大于20个氨基酸、长度大于30个氨基酸。优选地，突变型肽长度为约24-40个氨基酸。在进一步方面，本发明提供了通过施用根据本发明的方法鉴定的一种或多种肽或多肽和佐剂，在受试者中诱导肿瘤特异性免疫应答的方法。佐剂是例如基于TLR的佐剂或基于矿物油的佐剂。在一些方面，该肽或多肽和基于TLR的佐剂由基于矿物油的佐剂乳化。任选地，该方法进一步包括施用抗免疫抑制剂例如抗CTLA-4抗体、抗roi抗体、抗ro-Ll抗体、抗⑶25抗体或IDO的抑制剂。在另外一个方面，本发明提供了通过给受试者施用自体树突细胞或抗原呈递细胞(其已用根据本发明的方法鉴定的一种或多种肽或多肽脉冲)，在受试者中诱导肿瘤特异性免疫应答的方法。任选地，该方法进一步包括施用佐剂，例如基于TLR的佐剂或基于矿物油的佐剂。在一些方面，该肽或多肽和基于TLR的佐剂由基于矿物油的佐剂乳化。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用抗免疫抑制剂。抗免疫抑制剂包括例如抗CTLA-4抗体、抗PDl抗体、抗I3D-Ll抗体、抗⑶25抗体或IDO的抑制剂。在另一个方面，本发明提供了通过鉴定受试者的表达基因中的多个肿瘤特异性突变就癌症免疫接种或治疗受试者的方法，鉴定具有所鉴定的肿瘤特异性突变的突变型肽或多肽，选择一种或多种鉴定的突变型肽或多肽，其以大于野生型肽的亲和力结合I类HLA蛋白质，并且能够激活抗肿瘤CD8 T细胞，并且给受试者施用一种或多种选择的肽、多肽或用一种或多种鉴定的肽或多肽脉冲的自体树突细胞或抗原呈递细胞。突变型肽长度为约8-10个氨基酸。在另一个方面，长度为约8-50个氨基酸。例如，突变型肽长度大于10个氨基酸、长度大于15个氨基酸、长度大于20个氨基酸、长度大于30个氨基酸。优选地，突变型肽长度为约24-40个氨基酸。任选地，该方法进一步包括施用佐剂，例如基于TLR的佐剂或基于矿物油的佐剂。在一些方面，该肽或多肽和基于TLR的佐剂由基于矿物油的佐剂乳化。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用抗免疫抑制剂。抗免疫抑制剂包括例如抗CTLA-4抗体、抗roi抗体、抗ro-Ll抗体、抗⑶25抗体或IDO的抑制剂。权利要求22的方法，其中所述受试者已接受造血干细胞移植。受试者是人、犬、猫或马。癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头与颈癌、胰腺癌、脑癌、黑素瘤、淋巴瘤例如B细胞淋巴瘤或白血病，例如急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病或T细胞淋巴细胞白血病。本发明中还包括的是含有根据本发明的方法鉴定的肽或多肽和药学可接受的载体的药物组合物。例如，本发明提供了含有至少两种不同的SF3B1肽的组合物，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有
在氨基酸位置625处的亮氨酸；
在氨基酸位置626处的组氨酸；
在氨基酸位置700处的谷氨酸；
在氨基酸位置742处的天冬氨酸；或
在氨基酸位置903处的精氨酸，当依照野生型SF3B1编号时。本发明还提供了含有至少两种不同的MYD88肽的组合物，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有
在氨基酸位置232处的苏氨酸；在氨基酸位置258处的亮氨酸；或 在氨基酸位置265处的脯氨酸，当依照野生型MYD88编号时。
本发明进一步提供了含有至少两种不同的TP53肽的组合物，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有在氨基酸位置111处的精氨酸；在氨基酸位置215处的精氨酸；在氨基酸位置238处的丝氨酸；在氨基酸位置248处的谷氨酰胺；在氨基酸位置255处的苯丙氨酸；在氨基酸位置273处的半胱氨酸或在氨基酸位置281处的天冬酰胺，当依照野生型TP53编号时。本发明进一步提供了含有至少两种不同的ATM肽的组合物，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有
在氨基酸位置1252处的苯丙氨酸；在氨基酸位置2038处的精氨酸；在氨基酸位置2522处的组氨酸；或在氨基酸位置2954处的半胱氨酸，当依照野生型ATM编号时。组合物包含至少两种不同的Abl肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有在氨基酸位置244处的缬氨酸；
在氨基酸位置248处的缬氨酸；
在氨基酸位置250处的谷氨酸；在氨基酸位置250处的丙氨酸；在氨基酸位置252处的组氨酸；在氨基酸位置252处的精氨酸；在氨基酸位置253处的苯丙氨酸；在氨基酸位置253处的组氨酸；在氨基酸位置255处的赖氨酸；在氨基酸位置255处的缬氨酸；在氨基酸位置276处的甘氨酸；在氨基酸位置315处的异亮氨酸；在氨基酸位置315处的天冬酰胺；在氨基酸位置317处的亮氨酸；在氨基酸位置343处的苏氨酸；在氨基酸位置351处的苏氨酸；在氨基酸位置355处的甘氨酸；在氨基酸位置359处的缬氨酸；在氨基酸位置359处的丙氨酸；在氨基酸位置379处的异亮氨酸；在氨基酸位置382处的亮氨酸；在氨基酸位置387处的甲硫氨酸；在氨基酸位置396处的脯氨酸；在氨基酸位置396处的精氨酸；在氨基酸位置417处的酪氨酸；或在氨基酸位置486处的丝氨酸，当依照野生型ABL编号时。在本发明中进一步包括的是含有至少两种不同的FBXW7肽的组合物，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有在氨基酸位置280处的亮氨酸；在氨基酸位置465处的组氨酸；在氨基酸位置505处的半胱氨酸；或在氨基酸位置597处的谷氨酸，当依照野生型FBXW7编号时。在进一步方面，本发明提供了含有至少两种不同的MAPKl肽的组合物，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有在氨基酸位置162处的天冬酰胺；在氨基酸位置291处的甘氨酸；或
在氨基酸位置316处的苯丙氨酸，当依照野生型MAPKl编号时。本发明还提供了含有至少两种不同的GNBl肽的组合物，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有在氨基酸位置180处的苏氨酸，当依照野生型GNBl编号时。还由本发明提供的是用长度等于或小于50个氨基酸的Bcr-abl肽的组合物治疗具有伊马替尼抗性肿瘤的受试者或HLA-A3阳性受试者的方法，所述Bcr-abl肽含有在氨基酸位置255处的赖氨酸，当依照野生型bcr-abl编号时。由本发明进一步提供的是治疗具有伊马替尼抗性肿瘤的受试者的方法，其包括给受试者施用含有bcr-abl突变的一种或多种肽，其中所述肽等于或小于50个氨基酸，并且以小于500 nm的IC50结合I类HLA蛋白质。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有由本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管与本文描述那些相似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践中，但下文描述了合适的方法和材料。所有出版物、专利申请、专利和本文提及的其他参考文献特别整体引入作为参考。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。此外，本文描述的材料、方法和实施例仅是举例说明性的且不预期是限制性的。本发明的其他特点和优点通过下述详述和权利要求将是显而易见的且由其包含。附图简述
图1显示了使用3类抗原用于肿瘤疫苗的特异性和自身免疫毒性的平衡。全肿瘤细胞可能是对于肿瘤疫苗最少特异性的抗原制剂，因为在肿瘤细胞中表达的全套蛋白质抗原包括也存在于机体的其他细胞中的数千种蛋白质。过表达的肿瘤抗原是略微更特异性的，因为它们已就与机体的其他细胞相比较在肿瘤中高得多和更多选择性表达进行选择。然而，就这些抗原的表达测试在机体中的每一种细胞是不可能，并且存在其他细胞表达其的基本危险。最后，突变的蛋白质生成仅存在于肿瘤细胞中且提供最大水平的特异性的新表位。图2是用于个人化新抗原疫苗接种策略的方案，其可以应用于任何癌症的治疗。我们还突出显示了在两种独特情况下应用这种策略的可能性。在第一种情况下，患者在造血干细胞移植(HSCT)(例如对于CLL、CML和其他白血病完成的)后的早期接种疫苗。HSCT后的早期是独特的治疗背景，因为免疫系统由于用HSCT重构而是感受态的，从而克服肿瘤或治疗诱导的宿主免疫缺陷。此外，在淋巴细胞减少的环境中稳态细胞因子的丰度，例如在早期HSCT后的背景中，可以促成T细胞的快速扩增。在第二种情况下，患者在疾病过程早期接种疫苗，当免疫能力在疾病的早期中可以变得更完整时，在通过暴露于化学疗法(例如用于实体或造血系统肿瘤)的损伤前。因为免疫系统在这两种特异性情况下可能是最活性的，所以我们建议这些是用于应用肿瘤疫苗接种策略的理想情况。图3显示了以3步描述的用于鉴定肿瘤新表位的策略:(I)使用测序技术，检测存在于肿瘤中但不存在于单个患者的种系DNA中的基因突变；(2)使用预测算法，预测突变的肽是否具有结合个人HLA等位基因的潜力；这些预测的肽可以任选对于结合合适的HLA蛋白质在实验上测试。此外，这些基因还必须在肿瘤细胞中表达。(3)离体生成T细胞且测试它们是否能够识别表达突变蛋白质的细胞；可替代地，质谱法可以用于检测从肿瘤细胞表面HLA蛋白质中洗脱的肽。对于慢性淋巴细胞白血病，我们迄今为止的研究证实存在平均23个蛋白质改变突变/患者，46种预测的结合突变型肽和15-25种验证的结合突变型肽。在这些中，我们预期 7-12种肽在肿瘤细胞中表达且加工(尽管这跨越肿瘤和患者可以不同)。图4显示了五类突变生成潜在的肿瘤新表位。新的肿瘤特异性表位可以由于错义、剪接位点、移码或连读点突变(红色星号)而出现，或由两种基因的融合(或在相同基因内)而出现。特别地，剪接位点、移码、连读突变和基因融合可以各自生成新的氨基酸段(以品红色)，其通常是不翻译的，但目前由于突变而表达且翻译。错义突变导致具有单个氨基酸变化的肽。图5显示了在CLL患者中的突变频率/种类。我们将下一代测序应用于7个CLL肿瘤系列的研究揭示CLL细胞具有许多突变，其提供可能的突变肽的丰富来源。我们观察到在CLL中的非沉默基因改变的总数目范围为17-155/个体，其中大多数是体细胞改变的点突变(错义)。4个患者的肿瘤还具有剪接位点突变；对于3个患者,通过RNA测序鉴定新基因融合。
图6显示了针对患者的6个HLA (MHC I类)等位基因中的每一个来自肽结合(对于具有特异性错义突变的肽)的自动化预测(图3中的策略的步骤2A)的数据。品红色=强结合剂；绿色=中等结合剂。图7显示了用于证实突变基因的RNA表达(图3中的策略的步骤2B)的方法。A.对于CLL患者7，我们发现具有预测的HLA结合肽的超过一半的突变基因在RNA水平上表达。B.我们还已使用RNA焦磷酸测序，以检测具有在DNA中发现的特异性突变的表达的RNAs0 C.我们可以使用断裂点区(描述的是对于患者2发现的融合)的PCR-TOPO克隆，验证通过DNA测序可见的新基因融合。图8显示了用于HLA肽结合的实验验证(图3中的策略的步骤2C)的方法和数据。A.关于与特异性HLA等位基因的肽结合的实验验证的方案。B.在患者I和2中鉴定的候选突变肽的概括。加阴影的室指示分析在进行中。C.关于对于患者2由基因改变(错义突变或基因融合)生成的肽预测与实验验证的结合亲和力比较的数据。IC5(l〈120nM的预测截断(在左侧的垂直实线)导致所有肽显示与I类HLA的实验结合。图9显示了突变与种系(即，也称为亲本、野生型或正常)肽比较与HLA等位基因的预测差异结合。患者2的25种预测的HLA结合突变肽中的12种具有比亲本肽>2倍大的结合(截断=红色虚线)。这进一步增加突变肽的特异性。突变肽由于两个原因是特异性的:首先，识别突变肽的许多T细胞受体不可能检测野生型亲本肽；其次，一些突变肽可以以比亲本肽更高的亲和力结合HLA。因为第一种性质不能计算预测，所以我们集中于预测第二种性质，且仅选择那些肽用于包括在疫苗中，所述肽相对于野生型肽关于突变显示与HLA的更高结合。图10显示了针对候选的个人CLL新表位的T细胞反应性(图3中的策略的步骤3)。我们观察到在治疗后从患者I中分离的T细胞可以检测特异性突变的TLK2肽(肽#7)(使用Elispot测定)。图11显示了 BCR-ABL突变生成预期为结合HLA-A和HLA-B等位基因的许多肽。通过应用 NetMHC 预测算法(Nielsen 等人 PLoS One.2007，2(8): e796)，我们预测由 BCR-ABL突变生成的肽具有结合8种常见HLA-A和-B等位基因的潜力。最常见的BCR-ABL突变以递减频率排序(从左到右)，且描述了多种I类MHC结合肽的预测IC50。总之，我们预测了 84种肽以良好亲和力结合跨越广泛范围的HLA等位基因，所述良好亲和力定义为小于1000的IC50。在所有预测的肽中，84种中的24种(29%)预测为具有IC50〈50的歲结合剂。42种肽(50%)是中等结合剂，定义为在50和500之间的IC50。18种肽(21%)是定义为IC50在500和1000之间的弱结合剂。图12显示了具有E255K突变的BCR-ABL肽结合HLA蛋白质，且与存在于CML患者中的特异性、多功能T细胞结合。A.E255K-B (和亲本肽)与HLA A3和超型成员的实验衍生的结合得分。B.在HSCT后由HLAA3+ E255K+患者扩增的⑶8+ T细胞中，我们检测到针对E255K-B (MUT)肽的IFNy分泌和表达E255K小基因(MG)的表达A3+的APCs。这个应答在I类封闭抗体(w6/32)的存在下是取消的。C.1FNy分泌细胞对于突变肽也是四聚体+，并且是(D)多功能的，分泌IP10、TNFa和GM-CSF (基于Luminex测定)。图13显示了患者衍生的T细胞克隆可以识别肿瘤特异性表位且杀死呈现这些表位的细胞。A.与CML66 (肽66-72C)的CD8+ T细胞表位的反应性受HLA B-4403限制。B.CML66 mRNA可以有效核转染到⑶40L扩增的B细胞内。C.CML66特异性⑶8+ T细胞对于通过RNA核转染或通过肽脉冲表达CML66的⑶40L B细胞而不是对照靶是细胞毒性的。图14显示了在CLL中显著突变的基因。A.在64个CLL样品中9种最显著突变的基因。N -跨越64个测序的样品在碱基对中覆盖的总领域。通过比较察看观察到的突变丛(constellation)的概率与跨越数据集计算的本底突变率来计算P和q值。红色条-先前未知在CLL中是突变的基因；灰色条-其中在CLL中的突变先前已报道的基因。B.在64个CLLs中(在CLLs样品中的位置和突变显示在基因上)发现的在J7￥、SF3BU TP53、MYD88、FBXW7、DDX3X、MAPKl和007中的突变类型(错义、剪接位点、无义)和定位，与文献或COSMIC数据库中先前报道的突变相比较(线显示在基因下的突变位置)。图15显示了 SF3B1在CLL样品中表达(曲线图中的第7个柱)且具有比许多对照细胞更高的表达，包括:PBMC，M:单核细胞、CC:癌细胞系(包括K562、Jurkat, M9、MCF_7、Hela, Ovcar、RPM1、OTM、MCF-CAR、KM12BM 和 MM1S)。图16显示了 SF3B1突变生成预期为结合患者特异性HLA等位基因的肽。例如，包括常见SF3B1 K700E突变的一种肽预测为强烈结合HLA。发明详述
开发治愈和肿瘤特异性免疫疗法的关键障碍之一是高度限制的肿瘤抗原的鉴定和选择，以避免自身免疫。由于在恶性细胞内的遗传改变出现的肿瘤新抗原代表最肿瘤特异性种类的抗原。由于鉴定其的技术困难，新抗原已罕见地用于疫苗中。我们鉴定肿瘤特异性新表位的方法涉及三个步骤。(I)使用肿瘤的全基因组或全外显子组(即，仅捕获的外显子)或RNA测序与来自每个患者的匹配种系样品比较鉴定DNA突变；(2)应用验证的肽-MHC结合预测算法，以生成可以结合患者HLA等位基因且基于肿瘤中存在的非沉默突变的一组候选T细胞表位；和(3)任选证实针对突变肽的抗原特`异性T细胞或证实候选肽结合肿瘤表面上的HLA蛋白质。相应地，本发明涉及用于鉴定和/或检测抗原的T细胞表位的方法。具体地，本发明提供了鉴定和/或检测肿瘤特异性新抗原的方法，所述肿瘤特异性新抗原用于诱导受试者中的肿瘤特异性免疫应答。特别地，本发明提供了通过鉴定受试者的基因组中的多个肿瘤特异性突变来免疫接种或治疗受试者的方法。选择具有鉴定的突变且结合I类HLA蛋白质的突变型肽和多肽。任选地，这些肽和多肽以大于野生型肽的亲和力结合I类HLA蛋白质，和/或能够激活抗肿瘤CD8 T细胞。将这些肽施用于受试者。可替代地，施用已用该肽脉冲的自体抗原呈递细胞。在肿瘤的免疫控制中突变抗原或新抗原的重要性已在基本(seminal)研究中得到理解，所述基本研究显示:(a)小鼠和人通常发动针对突变抗原的T细胞应答(Parmiani等人，2007 ；Sensi和Anichini，2006) ; (b)小鼠可以通过用肿瘤中存在的单一突变肽免疫接种保护不受肿瘤(Mandelboim等人，1995) ; (c)自发或疫苗介导的长期黑素瘤幸存者发动针对突变抗原的强记忆细胞毒性T细胞(CTL)应答(Huang等人，2004 ；Lennerz等人，2005 ；Zhou等人，2005a) ; (d)最后，当用存在于自体肿瘤细胞中的患者特异性的突变免疫球蛋白蛋白质免疫接种时，滤泡型淋巴瘤患者显示分子缓解。(Baskar等人,2004)。此外,在这些患者中的CTL应答直接针对突变而不是共享的免疫球蛋白蛋白质区。另外，此类突变肽具有下述潜力:(a)独特地标记肿瘤用于由免疫系统识别且破坏，从而减少关于自身免疫的危险jP(b)避免中枢和外周T细胞耐受，允许抗原由更有效的高亲合力T细胞受体识别。(图1)。在任何特定基因中的同一突变很少跨越肿瘤发现(且甚至对于最常见的驱动突变以低频率)。因此，本发明的方法将包括鉴定患者特异性肿瘤突变。使用高度平行的测序技术、HLA肽结合预测工具和生物化学测定，本发明的方法将允许:(1)综合鉴定表达且结合患者的肿瘤中存在的HLA蛋白质的突变肽；(2)监控癌症患者针对这些鉴定的新表位的天然免疫应答；(3)测定在患者HLA蛋白质的背景中识别这些肽的细胞毒性T细胞是否可以离体选择性裂解自体肿瘤细胞。这个策略解决涉及癌症患者的免疫系统如何与肿瘤新表位相互作用的几个基本问题。这些包括:肿瘤新表位的哪个和何种部分由T细胞检测，多少T细胞前体能够响应新表位，新表位特异性记忆和效应T细胞在循环和肿瘤中有多频繁，T细胞对于这些表位具有多少亲合力，新表位特异性T细胞是有功能的吗？这些问题的答案提供关于在人疫苗中使用肿瘤新表位的理由和策略。人的免疫系统可以分类成两个功能子系统，即先天性和获得性免疫系统。先天性免疫系统是针对感染的第一线防御，并且大多数潜在病原体在它们可以引起例如显著感染之前快速中和。获得性免疫系统与侵入生物的称为抗原的分子结构反应。存在两类获得性免疫反应，即体液免疫反应和细胞介导的免疫反应。在体液免疫反应中，由B细胞分泌到体液内的抗体结合病原体衍生的抗原，导致通过多种机制的病原体消除，例如补体介导的裂解。在细胞介导的免疫反应中，激活能够破坏其他细胞的T细胞。如果例如与疾病有关的蛋白质存在于细胞中，那么它们在细胞内蛋白酶解断裂为肽。特异性细胞蛋白质随后将其自身附着至以这种方式形成的抗原或肽，并且将其转运至细胞的表面，在其中它们呈递给机体的分子防御机制，特别是T细胞。细胞毒性T细胞识别这些抗原且杀死具有该抗原的细胞。转运且在细胞表面上呈递肽的分子称为主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质。MHC蛋白质分类成I类和II类MHC蛋白质。两个MHC种类的蛋白质结构非常相似；然而，它们在其功能中相当大地不同。MHC I类的蛋白质存在于机体的几乎所有细胞包括大多数肿瘤细胞的表面上。MHC I类的蛋白质装载有抗原，所述抗原通常源于内源性蛋白质或细胞内存在的病原体，并且随后呈递给细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)。II类的MHC蛋白质仅存在于树突细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞和其他抗原呈递细胞上。它们主要将由体外抗原来源即细胞外加工的肽呈递给T辅助(Th)细胞。由I类MHC蛋白质结合的大多数肽源于在健康宿主生物自身中产生的细胞质蛋白质，且通常不刺激免疫反应。相应地，识别此类自身肽呈递的I类MHC分子的细胞毒性T淋巴细胞在胸腺中缺失，或在其从胸腺中释放后，被缺失或灭活，即耐受。MHC分子仅在它们将肽呈递给非耐受的细胞毒性T淋巴细胞时，才能刺激免疫反应。细胞毒性T淋巴细胞在其表面上具有T细胞受体(TCR)和CD8分子。T细胞受体能够识别且结合由MHC I类分子复合的肽。每个细胞毒性T淋巴细胞表达独特的T细胞受体，其能够结合特异性MHC/肽复合物。肽通过在内质网内的竞争亲和力结合将其自身附着至MHC I类分子，在它们呈递在细胞表面上之前。此处，个别肽的亲和力直接连接至其氨基酸序列和在氨基酸序列内的限定位置中特异性结合基序的存在。如果此类肽的序列是已知的，那么例如使用例如肽疫苗可以操纵免疫系统针对患病细胞。使用计算机算法，可以预测潜在的T细胞表位，即肽序列，其由以肽呈递的复合物形式的I类或II类MHC分子结合，且随后以这种形式，由T淋巴细胞的T细胞受体识别。目前，特别使用两种程序，即 SYFPEITHI (Rammensee 等人,Immunogenetics, 50 (1999),213-219)和 HLA_BIND (Parker 等人，J.1mmunol., 152 (1994)，163-175)。潜在地可以结合I类MHC分子的以这种方式测定的肽序列随后已在体外检查其实际结合能力。本发明的技术目的是提供用于鉴定且筛选肿瘤细胞中存在的潜在T细胞表位的改良方法，所述方法允许就其结合特异性MHC分子的能力同时和快速检查大量肽序列。在本发明中，它基于其的技术目的通过提供用于鉴定和/或检测突变抗原的方法实现，所述突变抗原存在于肿瘤中但不存在于正常组织中。该方法使用癌症患者基因组的整个编码部分的大量平行基因组测序，以鉴定肿瘤中的特异性突变基因。为了缩小突变型肽至具有比野生型肽更强烈地结合HLA的潜力并且因此赋予肿瘤特异性的那些，充分建立的算法将用于预测结合每个患者的6个独特的I类HLA等位基因中的任何的肽，并且将计算对于具有肿瘤特异性突变残基的所有9或10聚体肽与具有种系残基的那些比较的预测IC50。一般地，具有预测的IC50〈50nM的肽一般视为中等至高亲和力结合肽，且将选择用于以经验为主地使用HLA结合的生物化学测定测试其亲和力。最后，将测定人免疫系统是否可以发动针对这些突变的肿瘤抗原的有效免疫应答且因此有效杀死肿瘤而不是正常细胞。定义
“T细胞表位”应理解为意指这样的肽序列，其可以由以肽呈递的MHC分子或MHC复合物形式的I或II类MHC分子结合，并且随后以这种形式分别由细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞识别且结合。“受体”应理解为意指能够结合配体的生物学分子或分子分组。受体可以作用于传输细胞、细胞形成或生物中的信息。受体包含至少一个受体单位且优选两个受体单位，其中每个受体单位可以由蛋白质分子特别是糖蛋白分子组成。受体具有补充配体那种的结构且可以将配体复合为结合配偶体。信息特别通过在细胞表面上的配体复合后受体的构象变化传输。根据本发明，受体应理解为特别意指能够与配体形成受体/配体复合物的MHC I和II类蛋白质，特别是合适长度的肽或肽片段。“配体”应理解为意指具有补充受体那种的结构且能够与这种受体形成复合物的分子。根据本发明，配体应理解为特别意指在其氨基酸序列中具有合适长度和合适结合基序的肽或肽片段，从而使得肽或肽片段能够与MHC I类或MHC II类的蛋白质形成复合物。“受体/配体复合物”也应理解为意指“受体/肽复合物”或“受体/肽片段复合物”，特别是呈递I类或II类MHC分子的肽或肽片段。“主要组织相容性复合物(MHC)的蛋白质或分子”、“MHC分子”、“MHC蛋白质”或“HLA蛋白质”应理解为特别意指这样的蛋白质，其能够结合起因于蛋白质抗原的蛋白酶解切割且代表潜在的T细胞表位的肽，将其转运至细胞表面且将其在那里呈递给特异性细胞，特别是细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞。基因组中的主要组织相容性复合物包含遗传区，其在细胞表面上表达的基因产物对于结合且呈递内源和/或外源抗原且从而对于调节免疫过程是重要的。主要组织相容性复合物分类成编码不同蛋白质的两组基因，即MHCI类分子和MHC II类分子。两个MHC种类的分子对于不同抗原来源是专门的。MHC I类分子呈递内源合成的抗原，例如病毒蛋白质和肿瘤抗原。MHC II类分子呈递源于外部来源的蛋白质抗原，例如细菌产物。两个MHC种类的细胞生物学和表达模式适合于这些不同作用。I类MHC分子由重链和轻链组成，并且能够结合约8 - 11个氨基酸，但通常9或10个氨基酸的肽，如果这种肽具有合适的结合基序，并且将其呈递给细胞毒性T淋巴细胞。由I类MHC分子结合的肽源于内源蛋白质抗原。I类MHC分子的重链优选是HLA-A、HLA-B或HLA-C单体，并且轻链是β -2-微球蛋白。II类MHC分子由α链和β组成且能够结合约15 - 24个氨基酸的肽，如果这种肽具有合适的结合基序，且将其呈递给T辅助细胞。由II类MHC分子结合的肽通常源于细胞外的外源蛋白质抗原。α链和β链特别是HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP单体。“疫苗”应理解为意指用于生成用于疾病预防和/或治疗的免疫性的组合物。相应地，疫苗是包含抗原的药物，且预期通过疫苗接种在人或动物中用于生成特异性防御和保护物质。“分离的”意指多核苷酸或多肽或其片段、变体或衍生物，其已基本上去除与之天然结合的其他生物学材料，或基本上不含例如衍生自重组宿主细胞的其他生物学材料，所述重组宿主细胞已遗传改造为表达本发明的多肽。“新抗原”意指起于表达蛋白质的肿瘤特异性突变的一类肿瘤抗原。“纯化的”意指多核苷酸或多肽或其片段、变体或衍生物，其基本上不含与之天然结合的其他生物学材料，或不含例如衍生自重组宿主细胞的其他生物学材料，所述重组宿主细胞已遗传改造为表达本发明的多肽。即，例如本发明的纯化多肽是至少约70-100%纯的多肽，即多肽存在于组合物中，其中多肽构成按总组合物的重量计约70-100%。在一些实施方案中，本发明的纯化多肽是按重量计约75%-99%纯、按重量计约80%-99%纯、按重量计约90%-99%纯、或按重量计约95% - 99%纯。
_7] 肿瘤特异性突变的鉴定
本发明基于特定突变(例如存在于癌细胞中的变体或等位基因)的鉴定。特别地，这些突变存在于具有癌症的受试者的癌细胞的基因组中但不存在于来自受试者的正常组织中。肿瘤中的遗传突变会视为对于肿瘤的免疫学靶向有用，如果它们导致在肿瘤中专一的蛋白质的氨基酸序列中的变化。有用的突变包括:(I)导致蛋白质中的不同氨基酸的非同义突变；(2)其中终止密码子被修饰或缺失的连读突变，导致在C末端具有新肿瘤特异性序列的更长蛋白质的翻译；(3)导致成熟mRNA中包括内含子和因此独特的肿瘤特异性蛋白质序列的剪接位点突变；(4)引起在2个蛋白质的连接处(即基因融合)具有肿瘤特异性序列嵌合蛋白质的染色体重排；(5)导致具有新的肿瘤特异性蛋白质序列的新开放读码框的移码突变或缺失。起于肿瘤细胞中的例如剪接位点、移码、连读或基因融合突变的具有突变的肽或突变多肽可以通过在肿瘤与正常细胞中比较测序DNA、RNA或蛋白质进行鉴定。还在本发明的范围内的是包括先前鉴定的肿瘤特异性突变的肽。已知肿瘤突变可以在 http://www.sanger.ac.uk/cosmic 处找至丨J。多种方法可用于检测个体的DNA或RNA中特定突变或等位基因的存在。在这个领域中的进展已提供准确、容易和价廉的大规模SNP基因分型。最近以来，例如，已描述了几个新技术，包括动态等位基因特异性杂交(DASH)、微板阵列对角线凝胶电泳(MADGE)、焦磷酸测序、寡核苷酸特异性连接、TaqMan系统以及多种DNA“芯片”技术,例如Affymetrix SNP芯片。这些方法要求一般通过PCR扩增靶遗传区。基于通过侵袭切割随后为质谱法或固定挂锁探针和滚环扩增的小信号分子生成的另外其他新开发方法，可能最后消除关于PCR的需要。本领域已知的用于检测特异性单核苷酸多态性的几种方法在下文概括。本发明的方法应理解为包括所有可获得的方法。基于PCR的检测方法可以包括多个标记同时的多路扩增。例如，本领域众所周知的是选择PCR引物以生成PCR产物，其在大小中不重叠且可以同时分析。可替代地，可以用引物扩增不同标记，所述引物差异标记且从而可以各自差异检测。当然，基于杂交的检测方法允许样品中的多个PCR产物的差异检测。其他技术是本领域已知的，以允许多个标记的多路分析。几种方法已得到开发，以促进基因组DNA或细胞RNA中的单核苷酸多态性的分析。在一个实施方案中，单碱基多态性可以通过使用专门的外切核酸酶抗性核苷酸进行，如例如Mundy，C.R.(美国专利号4，656，127)中公开的。根据该方法，与多态位点3’紧邻的等位基因序列互补的引物允许与得自特定动物或人的靶分子杂交。如果在靶分子上的多态位点含有与存在的特定外切核酸酶抗性核苷酸衍生物互补的核苷酸，那么那种衍生物将掺入杂交引物的末端上。此类掺入致使引物对外切核酸酶有抗性，并且从而允许其检测。因为样品的外切核酸酶抗性衍生物的身份是已知的，所以引物已变得对外切核酸酶抗性的发现揭示存在于靶分子的多态位点中的核苷酸与反应中使用的核苷酸衍生物的那种互补。这种方法具有它不要求测定大量外部序列数据的优点。在本发明的另一个实施方案中，基于溶液的方法用于测定多态位点的核苷酸的身份。Cohen, D.等人(法国专利2，650，840 ;PCT申请号W091/02087)。如在美国专利号4，656，127的Mundy方法中，采用与多态位点3’紧邻的等位基因序列互补的引物。该方法使用标记的双脱氧核苷酸衍生物测定那个位点的核苷酸的身份，如果与多态位点的核苷酸互补，那么所述核苷酸将变得掺入引物的末端上。称为遗传位点分析(Genetic Bit Analysis)或GBA 的可替代方法由Goelet,P.等人(PCT申请号92/15712)描述。Goelet，P.等人的方法使用标记的终止子和与多态位点3’的序列互补的引物的混合物。掺入的标记的终止子因此通过待评估的靶分子的多态位点中存在的核苷酸测定且与之互补。与Cohen等人(法国专利2，650，840 ；PCT申请号W091/02087)的方法形成对比，Goelet, P.等人的方法优选是非均相测定，其中引物或靶分子固定至固相。近来，用于测定DNA中的多态位点的几个引物引导的核苷酸掺入程序已得到描述(Komher，J.S.等人，Nucl.Acids.Res.17:7779-7784 (1989) ；Sokolov, B.P.，Nuc1.Acids Res.18:3671 (1990)；Syvanen,A.-C.,等人，Genomics 8:684-692 (1990)；Kuppu swamy, Μ.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.(U.S.A.) 88:1143- 1147 (1991);Prezant,T.R.等人，Hum.Mutat.1:159-164 (1992);Ugozzoli，L.等人，GATA 9:107-112(1992) ；Nyren,P.等人，Anal.Biochem.208:171-175 (1993))。这些方法不同于 GBA ，因为它们都依赖于标记的脱氧核苷酸的掺入，以区分在多态位点上的碱基。在此类形式中，因为信号与掺入的脱氧核苷酸数目成比例，所以在相同核苷酸运行中出现的多态性可以导致与运行长度成比例的信号(Syvanen, A.-C.，等人，Amer.J.Hum.Genet.52:46-59(1993))。许多主观努力目前在进行中，以平行获得直接来自数百万个别DNA或RNA分子的序列信息。实时单分子边合成边测序技术取决于荧光核苷酸的检测，因为它们掺入与待测序的模板互补的DNA的新生链。在一种方法中，长度30-50个碱基的寡核苷酸在5’末端共价锚定至玻璃盖玻片。这些锚定的链执行两种功能。首先，如果模板配置与表面结合的寡核苷酸互补的捕获尾部，那么它们充当关于靶模板链的捕获位点。它们还充当用于模板指导的引物延伸的引物，其形成序列阅读的基础。捕获引物充当用于序列测定的固定位置位点，使用染料-接头的合成、检测和化学切割的多个循环，以去除染料。每个循环由加入聚合酶/标记的核苷酸混合物、清洗、成像和染料切割组成。在可替代方法中，聚合酶用荧光供体分子修饰且固定在载玻片上，而每个核苷酸用附着至Y磷酸盐的受体荧光部分颜色编码。当核苷酸变得掺入从新链内时，该系统检测在荧光标记的聚合酶和荧光修饰的核苷酸之间的相互作用。还存在其他边合成边测序技术。优选地，任何合适的边合成边测序平台可以用于鉴定突变。如上所述，四个主要的边合成边测序平台是目前可获得的:来自Roche/454 Life Sciences的GenomeSequencers、来自 Illumina/Solexa 的 IG Analyzer、来自 Applied BioSystems 的 SOLiD 系统、和来自Helicos Biosciences的Heliscope系统。边合成边测序平台也已由PacificBioSciences和VisiGen Biotechnologies描述。这些平台各自可以用于本发明的方法中。在一些实施方案中，待测序的多个核酸分子与载体(例如固体载体)结合。为了将核酸固定在载体上，捕获序列/通用引发位点可以加入模板的3’末端和/或5’末端上。核酸可以通过使捕获序列与共价附着至载体的互补序列杂交与载体结合。捕获序列(也称为通用捕获序列)是与附着至载体的序列互补的核酸序列，其可以双重充当通用引物。作为捕获序列的可替代物，偶联对的成员(如例如美国专利申请号2006/0252077中所述的例如抗体/抗原、受体/配体、或抗生物素蛋白-生物素对)可以连接至在表面上待捕获的每个片段，所述表面由那个偶联对的各自第二个成员包被。在捕获后，序列可以例如通过单分子检测/测序进行分析，例如如实施例和美国专利号7，283，337中所述的，包括模板依赖性边合成边测序。在边合成边测序中，在聚合酶的存在下使表面结合的分子暴露于多个标记的三磷酸核苷酸。模板的序列通过掺入成长链的3’末端内的标记核苷酸的次序进行测定。这可以实时完成或可以以分步重复的方式完成。对于实时分析，可以掺入对于每个核苷酸的不同光学标记，并且多个激光器可以用于刺激掺入的核苷酸。任何细胞类型或组织可以用于获得用于在本文描述的诊断中使用的核酸样品。在优选实施方案中，DNA或RNA样品得自肿瘤或通过已知技术(例如静脉穿刺)获得的体液例如血液或唾液。可替代地，核酸测试可以对干样品(例如毛发或皮肤)执行。可替代地，蛋白质质谱法可以用于鉴定或验证与肿瘤细胞上的MHC蛋白质结合的突变肽的存在。肽可以从肿瘤细胞或由肿瘤免疫沉淀的HLA分子中酸洗脱，且随后使用质谱法鉴定。新杭原狀
本发明进一步包括包含通过本发明的方法鉴定的肿瘤特异性突变的分离肽，包含已知肿瘤特异性突变的肽，和通过本发明的方法鉴定的突变型多肽或其片段。这些肽和多肽在本文中称为“新抗原肽”或“新抗原多肽”。术语“肽”在本说明书中与“突变型肽”和“新抗原肽”可互换使用，以指定一般通过在相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，一般为L-氨基酸。类似地，术语“多肽”在本说明书中与“突变型多肽”和“新抗原多肽”可互换使用，以指定一般通过在相邻氨基酸的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的一系列残基，一般为L-氨基酸。多肽或肽可以是多个长度，以其天然(不带电)形式或以其为盐的形式，且不含修饰例如糖基化、侧链氧化、或磷酸化或含有这些修饰，实施该修饰不破坏如本文描述的多肽的生物学活性的条件。在特定实施方案中，至少一个新抗原肽分子的大小可以包含但不限于约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19、约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39、约40、约41、约42、约43、约44、约45、约46、约47、约48、约49、约50、约60、约70、约80、约90、约100、约110、约120个或更多氨基分子残基，和其中衍生的任何范围。在具体实施方案中，新抗原肽分子等于或小于50个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的特定新抗原肽和多肽是:对于MHC I类，长度13个残基或更少，且通常由约8 -约11个残基组成，特别是9或10个残基；对于MHC II类，15-24个残基。更长的肽可以以几种方法设计。在一种情况下，当HLA结合肽是预测或已知的时，更长的肽可以由下述组成:(I)具有针对每个相应基因产物的N和C末端的2-5个氨基酸的延长的个别结合肽；(2)对于各自具有延长序列的一些或所有结合肽的串联(concatenatation)。在另一种情况下，当测序揭示肿瘤中存在的长(>10个残基)新表位序列(例如由于导致新肽序列的移码、连读或内含子包含)时，更长的肽将由下述组成:(3)新肿瘤特异性氨基酸的整个段-从而回避关于与HLA蛋白质结合的肽的计算预测或体外测试的需要。在两种情况下，更长肽的使用允许通过患者细胞的内源加工，且可以导致更有效的抗原呈递和T细胞应答的诱导。新抗原肽和多肽结合HLA蛋白质。在一些方面，新抗原肽和多肽以大于野生型肽的亲和力结合HLA蛋白质。新抗原肽或多肽具有至少小于5000 nM、至少小于500 nM、至少小于250 nM、至少小于200 nM、至少小于150 nM、至少小于100 nM、至少小于50 nM或更少的 IC50。当施用于受试者时，新抗原肽和多肽不诱导自身免疫应答和/或引起免疫耐受。本发明还提供了包含至少两种或更多种新抗原肽的组合物。在一些实施方案中，组合物含有至少两种不同的肽。优选地，至少两种不同的肽衍生自相同多肽。不同多肽意指该肽通过长度、氨基酸序列或两者改变。肽衍生自已知含有肿瘤特异性突变或已通过本发明的方法发现含有肿瘤特异性突变的任何多肽。新抗原肽可以由其衍生的合适多肽可以例如在COSMIC数据库(http://www.sanger.ac.uk/cosmic)关于人癌症中的体细胞突变的COSMIC curates综合信息发现。肽含有肿瘤特异性突变。在一些方面，肿瘤特异性突变是关于特定癌症类型的驱动突变。在一些方面，肽衍生自SF3B1多肽、MYD88多肽，TP53多肽、ATM多肽、Abl多肽、FBXW7多肽、DDX3X多肽、GNBl多肽的MAPKl多肽。SF3B1肽意指该肽含有SF3B1多肽的部分。优选地，SF3B1肽包括在氨基酸位置625处的亮氨酸；在氨基酸位置626处的组氨酸；在氨基酸位置700处的谷氨酸；在氨基酸位置742处的天冬氨酸；或在氨基酸位置903处的精氨酸，当依照野生型SF3B1编号时。野生型SF3B1显示于表A (SEQ ID NO:1)。
权利要求
1.一种鉴定新抗原的方法，其包括: a.鉴定具有癌症的受试者的表达基因中的肿瘤特异性突变； b.其中当步骤(a)中鉴定的所述突变是点突变时: 1.鉴定具有步骤(a)中鉴定的所述突变的突变型肽， 其中所述突变型肽以大于野生型肽的亲和力结合I类HLA蛋白质；并且具有小于500nm 的 IC50 ； c.其中当步骤(a)中鉴定的所述突变是剪接位点、移码、连读或基因融合突变时: 1.鉴定由步骤(a)中鉴定的所述突变编码的突变型多肽，其中所述突变型多肽结合I类HLA蛋白质。
2.权利要求1的方法，其中所述突变型肽长度为约8-10个氨基酸。
3.权利要求1的方法，其中所述突变型肽长度大于10个氨基酸。
4.权利要求3的方法，其中所述突变型肽长度大于15个氨基酸。
5.权利要求4的方法，其中所述突变型肽长度大于20个氨基酸。
6.权利要求5的方法，其中所述突变型肽长度大于30个氨基酸。
7.权利要求1的方法，其中所述突变型肽长度为约8- 50个氨基酸。
8.权利要求1的方法，其中所述突变型肽长度为约24-40个氨基酸。
9.权利要求1的方法,其中肿瘤特异性突变通过核酸测序进行鉴定。
10.权利要求1的方法，其进一步包括选择步骤(b)中鉴定的肽或步骤(c)的多肽，其激活抗肿瘤⑶8 T细胞。
11.一种在受试者中诱导肿瘤特异性免疫应答的方法，其包括施用根据权利要求1鉴定的一种或多种肽或多肽和佐剂。
12.权利要求11的方法，其中所述佐剂是基于TLR的佐剂。
13.权利要求11的方法，其中所述肽或多肽由基于矿物油的佐剂乳化。
14.权利要求11的方法，其中所述肽或多肽和基于TLR的佐剂由基于矿物油的佐剂乳化。
15.权利要求11的方法，其进一步包括施用抗免疫抑制剂。
16.权利要求15的方法，其中所述抗免疫抑制剂是抗CTLA-4抗体、抗PDl抗体、抗PD-Ll抗体、抗⑶25抗体或IDO的抑制剂。
17.一种在受试者中诱导肿瘤特异性免疫应答的方法，其包括给所述受试者施用自体树突细胞或抗原呈递细胞，其已用根据权利要求1鉴定的一种或多种肽或多肽脉冲。
18.权利要求17的方法，其进一步包括施用佐剂。
19.权利要求18的方法，其`中所述佐剂是基于TLR的佐剂。
20.权利要求17的方法，其进一步包括施用抗免疫抑制剂。
21.权利要求20的方法，其中所述抗免疫抑制剂是抗CTLA-4抗体、抗PDl抗体、抗PD-Ll抗体、抗⑶25抗体或IDO的抑制剂。
22.—种就癌症免疫接种或治疗受试者的方法,其包括: a.鉴定所述受试者的表达基因中的多个肿瘤特异性突变，其中当鉴定的所述突变是:` 1.点突变时，进一步鉴定具有所述点突变的突变型肽；和/或i 1.剪接位点、移码、连读或基因融合突变时，进一步鉴定由所述突变编码的突变型多肽； b.选择步骤(a)中鉴定的一种或多种突变型肽或多肽，其结合I类HLA蛋白质； c.选择步骤(b)中鉴定的一种或多种突变型肽或多肽，其能够激活抗肿瘤CD8T细胞；和 d.给所述受试者施用所述一种或多种肽或多肽、用步骤(C)中选择的一种或多种肽或多肽脉冲的自体树突细胞或抗原呈递细胞。
23.权利要求22的方法，其进一步包括给所述受试者施用佐剂。
24.权利要求23的方法，其中所述佐剂是基于TLR的佐剂。
25.权利要求22的方法，其进一步包括施用抗免疫抑制剂。
26.权利要求25的方法，其中所述抗免疫抑制剂是抗CTLA-4抗体、抗PDl抗体、抗PD-Ll抗体、抗⑶25抗体或IDO的抑制剂。
27.权利要求22的方法，其中所述突变型肽长度为约8-10个氨基酸。
28.权利要求22的方法，其中所述突变型肽长度为约8- 50个氨基酸。
29.权利要求22的方法，其中所述突变型肽长度为约24-40个氨基酸。
30.权利要求22的方法，其中所述受试者已接受造血干细胞移植。
31.权利要求22的方法，其中所述受试者是人、犬、猫或马。
32.权利要求22的方法，其中所述癌症是乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头与颈癌、胰腺癌、脑癌、黑素瘤、淋巴瘤或白血病。
33.权利要求32的方法，其中所述淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。
34.权利要求32的方法，其中所述白血病是急性髓性白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病或T细胞淋巴细胞白血病。
35.一种药物组合物，其包含根据权利要求1鉴定的肽和药学可接受的载体。
36.一种组合物，其包含至少两种不同的: a.SF3B1肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有 i.在氨基酸位置625处的亮氨酸； i1.在氨基酸位置626处的组氨酸； ii1.在氨基酸位置700处的谷氨酸； iv.在氨基酸位置742处的天冬氨酸；或 V.在氨基酸位置903处的精氨酸，当依照野生型SF3B1编号时； b.MYD88肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有 i.在氨基酸位置232处的苏氨酸； i1.在氨基酸位置258处的亮氨酸；或 ii1.在氨基酸位置265处的脯氨酸，当依照野生型MYD88编号时； c.TP53肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有 i.在氨基酸位置111处的精氨酸； i1.在氨基酸位置215处的精氨酸； ii1.在氨基酸位置238处的丝氨酸； iv.在氨基酸位置248处的谷氨酰胺；V.在氨基酸位置255处的苯丙氨酸； v1.在氨基酸位置273处的半胱氨酸或 vi1.在氨基酸位置281处的天冬酰胺，当依照野生型TP53编号时；d.ATM肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有.1.在氨基酸位置1252处的苯丙氨酸； i1.在氨基酸位置2038处的精氨酸； ii1.在氨基酸位置2522处的组氨酸；或 iv.在氨基酸位置2954处的半胱氨酸，当依照野生型ATM编号时；e.abl肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有· . 1.在氨基酸位置244处的缬氨酸； i1.在氨基酸位置248处的缬氨酸； ii1.在氨基酸位置250处的谷氨酸； iv.在氨基酸位置250处的丙氨酸； V.在氨基酸位置252处的组氨酸； v1.在氨基酸位置252处的精氨酸； vi1.在氨基酸位置253处的苯丙氨酸； vii1.在氨基酸位置253处的组氨酸； ix.在氨基酸位置255处的赖氨酸； X.在氨基酸位置255处的缬氨酸； x1.在氨基酸位置276处的甘氨酸； xi1.在氨基酸位置315处的异亮氨酸； xii1.在氨基酸位置315处的天冬酰胺； xiv.在氨基酸位置317处的亮氨酸； XV.在氨基酸位置343处的苏氨酸； xv1.在氨基酸位置351处的苏氨酸； xvi1.在氨基酸位置355处的甘氨酸； xvi i1.在氨基酸位置359处的缬氨酸； xix.在氨基酸位置359处的丙氨酸； XX.在氨基酸位置379处的异亮氨酸； xx1.在氨基酸位置382处的亮氨酸； xxi1.在氨基酸位置387处的甲硫氨酸； xxii1.在氨基酸位置396处的脯氨酸； xxiv.在氨基酸位置396处的精氨酸； XXV.在氨基酸位置417处的酪氨酸；或 xxv1.在氨基酸位置486处的丝氨酸，当依照野生型abl编号时；f.FBXW7肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有 .1.在氨基酸位置280处的亮氨酸； i1.在氨基酸位置465处的组氨酸； ii1.在氨基酸位置505处的半胱氨酸；或iv.在氨基酸位置597处的谷氨酸，当依照野生型FBXW7编号时； g.MAPKl肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有i.在氨基酸位置162处的天冬酰胺； i1.在氨基酸位置291处的甘氨酸；或 ii1.在氨基酸位置316处的苯丙氨酸，当依照野生型MAPKl编号时；或 h.GNBl肽，其中每种肽长度等于或小于50个氨基酸且含有在氨基酸位置180处的苏氨酸，当依照野生型GNBl编号时。
37.权利要求36的组合物，其进一步包含佐剂。
38.一种治疗具有伊马替尼抗性肿瘤的受试者的方法，其包括给HLA-A3阳性受试者施用长度等于或小于50个氨基酸的Bcr-abl肽的组合物，所述Bcr-abl肽含有在氨基酸位置255处的赖氨酸，当依 照野生型bcr-abl编号时。
39.一种治疗具有伊马替尼抗性肿瘤的受试者的方法，其包括给所述受试者施用含有bcr-abl突变的一种或多种肽，其中所述肽等于或小于50个氨基酸，且以小于500 nm的IC50结合I类HLA蛋白质。
全文摘要
本发明涉及免疫治疗肽及其在免疫疗法特别是癌症的免疫疗法中的用途。具体地，本发明提供了鉴定肿瘤特异性新抗原的方法，其单独或与其他肿瘤相关肽组合充当疫苗组合物的药物成分，所述疫苗组合物刺激抗肿瘤应答。
文档编号G01N33/53GK103180730SQ201180034398
公开日2013年6月26日 申请日期2011年5月16日 优先权日2010年5月14日
发明者N.哈科亨, C.吴 申请人:综合医院公司, 达纳－法伯癌症研究所公司