专利名称：一种玉米心叶特异性启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程技术领域，涉及植物启动子的克隆及其应用，具体涉及一种玉米心叶特异性启动子的克隆及其功能分析。
背景技术：
玉米不仅是粮、饲兼用的主要作物，而且还是重要的工业原料。随着工业化的普及和加快，耕地面积的减少、环境的恶化和食物短缺的矛盾日益尖锐，而常规育种技术无法满足人类对玉米新品种高产优质、抗病抗逆的需求。十多年来，已经利用转基因技术培育出一批抗虫、抗病、抗除草剂、抗盐、抗旱、优质的玉米新品种。玉米螟(即玉米钻心虫)是玉米的主要害虫之一，对玉米危害极大，可导致玉米减产10%以上。而由于玉米对玉米螟的内源抗性受多基因控制，常规育种方法不仅周期长，且抗性与高产负相关，抗瞑育种难度较大，20年间各国均未取得明显进展。进入20世纪90年代，通过转基因方法将来源于苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因导入玉米以获得抗虫品种取得突破性进展，转Bt基因玉米抗虫效果明显，平均增产 5-10%。然而转基因植物的安全性一直是人们关注的焦点，其中外源基因的表达有可能改变植物自身的代谢，从而带来目前不为人所知的潜在风险。为了更安全、高效防治玉米螟，将外源基因表达对植物和环境的影响降到更低，在转基因载体中使用心叶特异表达基因的启动子代替组成型CaMV35S启动子驱动Bt毒蛋白的表达，不仅可以控制在幼嫩心叶中为害的第一代玉米螟初孵幼虫，而且可以将外源基因表达带来的潜在风险降到最低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种玉米心叶特异性启动子，该启动子可驱动基因在玉米心叶中特异高表达。本发明的技术方案如下一种玉米心叶特异性启动子，来源于玉米(Zea mays ssp. Mays L.)，具有如下a) 或b)的核苷酸序列a)序列表中SEQ ID No 1所示的核苷酸序列；b)在严格条件下与序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。所述严格条件为在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。序列表中的SEQ ID No :1 长 1976bp。含有本发明启动子的表达载体、转基因细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。^^Bjfflil^Bii^Tt^fiPCR(real-time fluoresent quantitative polymerasechain reaction, FQ-PCR)技术进行分析，发现ZmPEPl基因在玉米幼嫩的心叶中特异性高表达，克隆该基因的启动子，命名为WSl-ZmPro，其序列如SEQ ID No:l所示。
本发明的启动子具有心叶组织特异性，可应用于转基因植物育种领域，通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到植物(例如玉米)中，驱动下游基因在植物心叶中特异性高表达，达到育种目的，例如驱动Bt毒蛋白的基因在玉米心叶中特异性高表达， 从而获得安全、高效抗玉米螟的转基因玉米。
图1显示了 ZmPEPl基因在玉米各组织中的相对表达量。
具体实施例方式下面通过实施例，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。本实施例通过实时荧光定量PCR(FQ-PCR)验证了 ZmPEPl基因在玉米幼嫩心叶中的特异高表达，从而克隆出其启动子，该启动子长1976bp，序列见序列表中SEQ ID No :1。一、材料玉米(Zea mays ssp. Mays L.)，在温室中生长4周，每天光照16小时，黑暗 8小时。 二、总RNA的提取及cDNA合成1、玉米各组织总RNA的提取取4周龄玉米的根、茎以及心叶，分别在液氮中将2g新鲜洁净的玉米组织研磨为粉末，转移到Iml Trizol溶液(invitrogen公司)中，混勻，加入200 μ 1氯仿，充分混勻， 室温下静置2分钟，4°C、12000g离心15分钟，吸出上清，转移到新的印pendorf管中，加入 500 μ 1异丙醇，混勻，4°C、12000g离心10分钟，弃上清，加入1000 μ 1 75%乙醇洗涤一次， 弃上清，所得RNA沉淀溶于50 μ 1 DEPC-ddH20中。2、cDNA 合成将30. 5 μ 1总RNA溶液在70°C变性5_10分钟后置于冰上，迅速加入下列试剂 12 μ 1 5 X 逆转录缓冲液，10 μ 1 dNTPs (2. 5mmol/L)，6 μ 1 DTT (0. lmol/L)，1 μ 1 0. Immo 1/ L Oligo (dT) 15,0. 5 μ 1 RNase 抑制剂(Taara 公司)，1 μ 1 MMLV 逆转录酶(invitrogen 公司，200ιι/μ 1)，然后在42°C保温1小时。三、实时荧光定量PCR检测各候选基因的组织表达特异性由于ZmGAPDH在玉米各组织表达量一致，所以检测玉米各基因的相对表达量一般使用ZmGAPDH作为内参基因，采用如下引物对其cDNA进行扩增正向引物序列Pl:5' -CCTGCTTCTCATGGATGGTT-3‘ (SEQ ID No 2)；反向引物序列P2 5 ‘ -TGGTAGCAGGAAGGGAAACA-3 ‘ (SEQ ID No 3)。采用如下引物扩增ZmPEPl基因的cDNA 正向引物序列P3:5' -ATGCAGAACACTGGCTAGG-3‘ (SEQ ID No 4)；反向引物序列P4:5' -TTTCCACTTGGACTTGACAAC-3‘ (SEQ ID No 5)。反应体系如下10μ1 2XReal-time PCR Master Mix(Toyobo 公司)，0· 1 μ 1cDNA, 2 μ 1 正向引物(lymol/L)禾口 2μ 1 反向弓|物(lymol/L),5. 1 μ 1 ddH20。反应条件为94°C30s, 54°C 60s, 72°C 20s, 45 个循环。ZmGAPDH和 ZmPEPl 的读板温度分别为84°C和85°C。检测结果见图1，由图可知，相比于ZmGAPDH基因的表达量，ZmPEPl 基因在玉米心叶中高表达，在根和茎中几乎不表达。四、ZmPEP 1启动子的克隆1.玉米叶片总DNA的提取用CTAB法提取植物叶片的总DNA。在液氮中磨碎2g样品，加入:3ml 2 X CTAB (2% w/v),并添加 1. 4mol/LNaCl、0. 2 % (ν/ν)巯基乙醇、20mmol/LEDTA 和 10mmol/L Tris-HCl (pH8. 0)，60°C保温45min，在加入等体积酚/氯仿，12000rpm室温离心lOmin。将上清液转入新印pendorf管中，再加入氯仿己戊醇(体积比对1)抽提，上清液加入两倍体积乙醇置室温沉淀20min后，12000rpm、4°C离心15min，去除上清液。沉淀分别用70% 乙醇洗涤一次，DNA沉淀干燥后溶于100 μ 1 ddH20中。2. ZmPEPl启动子的克隆以叶片的总DNA为模板，扩增ZmPEPl的启动子，所使用的引物如下正向引物序列P5:5' -GAAAAAACATTGTGAAAGGAG-3‘ (SEQ ID No 6)；反向引物序列P6:5' -ACCTGTGGTTAGGAACTC-3‘ (SEQ IDNo 7)。反应体系如下2μ1 总 DNA，5y 1 10X 缓冲液，3 μ 1 MgSO4 (25mmol/L), 5 μ IdNTPs (2mmol/L) ,KOD DNA 聚合酶 1 μ 1,32. 5μ 1 ddH20,1 μ 1 正向引物(20ymol/L)和 1μ 1 反向引物(20ymol/L)。反应条件为98°C 10s，50°C 30s，68°C 65s，36个循环。经电泳检测获得长1976bp 的DNA片段，测序得SEQ ID No 1所示序列。上述实验通过实时荧光定量PCR验证各候选基因在玉米各组织的相对表达量，并克隆在心叶特异高表达基因-ZmPEPl的启动子，该启动子有望在以后的抗虫转基因育种中有重要的应用前景。
权利要求
1.一种玉米心叶特异性启动子，具有如下a)或b)的核苷酸序列a)序列表中SEQID No 1所示的核苷酸序列；b)在严格条件下与序列表中SEQID No 1限定的DNA序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述严格条件为在0.1 X SSPE和0. 1 % SDS的溶液中，或者在0. IXSSC和0. SDS的溶液中，65 °C条件下杂交并洗膜。
3.含有权利要求1所述的启动子的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
4.权利要求1所述的启动子在培育转基因植物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物为玉米。
全文摘要
本发明公开了一种玉米心叶特异性启动子及其应用。该启动子为玉米ZmPEP1基因的启动子，具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列，或者是在严格条件下可与该序列杂交，且具有相同功能的核苷酸序列。本发明的启动子具有心叶组织特异性，可应用于转基因植物育种领域，通过构建含有该启动子的植物表达载体，将其转化到植物(例如玉米)中，驱动下游基因在植物心叶中特异表达，达到育种目的。
文档编号C12N5/10GK102373201SQ201010247328
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者徐唯涛, 洪龙, 瞿礼嘉, 顾红雅, 高远, 魏桐 申请人:北京大学