专利名称：烟草花叶病毒外壳蛋白三个突变体基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蛋白质工程方法。根据烟草花叶病毒TMV外壳蛋白的三维结构和病毒离子组装的特点制备出TMV外壳蛋白基因突变体，这些突变体具有抗性强，且不会产生异源包被问题，还涉及将这些基因插入转化载体。及将它用于生产对TMV抗病毒感染具有高抗转基因植物。
现有技术烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus-TMV)，可以侵染50多科的上百种植物，并引起多种作物的病毒病，给农业、园艺和经济作物造成严重的损失，烟草花叶病毒是植物病毒中研究最多的一个病毒，在形态、粒子结构、化学组成、组装、重组，外壳蛋白亚基间、亚基与RNA之间的相互作用及基因组一级结构与功能、核酸复制和蛋白翻译，病毒在细胞间运动，抗病毒基因工程等多方面为病毒学提供了一个非常经典的例子。(一)基因组结构该病毒基因组由一单链正链RNA组成，分子量为2×106，由6395核苷酸组成。基因组结构于功能研究的较为清楚。基因组5′端第一个ORF可以编码一个126kDa蛋白。试验证明这个126kDa ORF的终止密码子UAG可以被通读，并编码一个分子量更大的蛋白183kDa。这个通读蛋白的最后5个密码子与第三个ORF重叠。第三个ORF可以编码一个分子量为30kDa的蛋白位于第三个终止密码子下游两个核苷酸处是第四个ORF的启始密码子，该ORF位于TMV基因组的RNA的3′端，可以编码一个分子量为17.6kDa的病毒外壳蛋白，ORF3和4有TMV两个亚基组分RNA编码。TMV基因组RNA3′端非翻译区可以折叠成一个类似tRNA的结构，能够接收组氨酸。(二)外壳蛋白介导的抗病毒基因工程研究1986年Powell等首先利用CaMV35S启动子在烟草中高水平表达了TMV外壳蛋白基因，当这些转基因植物受到TMV-U1及相关成员攻击时，表现出明显的抗性。目前外壳蛋白介导的抗性在多种病毒于植物组合中得到广泛的应用，如马铃薯，小麦，玉米，番茄，木瓜，苜蓿，等的抗病毒基因工程。外壳蛋白介导的抗性机理还不清楚，目前面临的另一个更大的问题是利用外壳蛋白介导的抗性存在的潜在的异源包被问题，尤其是对那些在转基因植物中表达这种虫传病毒的外壳蛋白基因如黄瓜花叶病毒CMV，马铃薯病毒PVX，马铃薯病毒Y PVY，大麦黄矮病毒BYDV，马铃薯卷叶病毒PLRV。这一问题已引起许多科学家关注，即如有A、B两种较相近的病毒，例如A病毒是虫传病毒，B是非虫传病毒，如在植物中大量表达A病毒野生外壳蛋白，而B病毒正好侵染这些转基因植物，那么就完全有可能A病毒外壳包被B病毒的核酸，所形成的杂合病毒就获得了被虫传播的特性，B病毒就可以被虫传播。
发明目的为了利用外壳蛋白介导的抗性而避免出现异源包被问题，我们以TMV和烟草为模式病毒和植物，通过蛋白质工程手段突变TMV外壳蛋白中一些与核酸结合的位点，加强外壳蛋白与核酸的结合，同时突变一些蛋白亚基间的相互作用位点达到突变后的突变体外壳蛋白形成的例子的稳定性降低，他的侵染性将会减弱。在植物中大量表达这种突变体外壳蛋白基因，既干扰了病毒的装配和复制，达到抗病毒的目的，又解决了异源包被的问题。
发明的优点及效果本发明创立的新型基因工程方法获得大量对TMV高抗性、经济价值高、抗病毒转基因植物，又解决了异源包被问题，有广泛的农业利用价值。提供了三种含有TMV-U1的不同外壳蛋白突变体基因、花椰菜花叶病毒35S基因的启动子、以及花椰菜花叶病毒35S基因的多腺苷酸信号的植物转化载体。
三种含有植物转化载体的细菌细胞，它们均含有TMV-U1的不同外壳蛋白突变体基因、花椰菜花叶病毒35S基因的启动子、以及花椰菜花叶病毒35S基因的多腺苷酸信号。
三种含有TMV-U1的不同外壳蛋白突变体基因、花椰菜花叶病毒35S基因的启动子、以及花椰菜花叶病毒35S基因的多腺苷酸信号的转化植物细胞。
三种含有转化细胞的植物，转化细胞中含有TMV-U1的不同外壳蛋白突变体基因、花椰菜花叶病毒35S基因的启动子、以及花椰菜花叶病毒35S基因的多腺苷酸信号。本发明的转化植物包括烟草，茄科(辣椒、西红柿等)的植物。
一种产生抗病毒植物的方法，包括繁殖三种表达TMV外壳蛋白突变体基因的植物。特别是产生茄科植物的方法。
发明的技术路线图1-图5用来表示本发明的构成。采用一些常规方法，图示质粒和DNA片段。
在实施本发明中所采用的大部分重组DNA的方法是该领域中专业人员所熟知的标准方法。酶是由商业来源得到的，并按照说明书建议的方式使用。各种试剂、缓冲剂和培养条件业都是该领域中的专业人员公知的。包括这些标准技术的一般参考资料有以下文献T.Maniatis等(1982)，Molecular CloningA Laboratory Manual；Matthews(1991)，PlantVirology，Academic Press.
实施例1 TMV-U1 RNA的分离在烟草植物中繁殖烟草花叶病毒病毒株U1(TMV-U1)，并用Li等人(Journal ofPhytopathology 134121-132.1992)的方法分离RNA。
实施例2 TMV-U1外壳蛋白突变体基因的获得1.首先选择点突变的位点，选择依据主要根据以下几个原则(1)选择在病毒粒子组装中保守并且有重要作用的位点；(2)强化RNA于蛋白的结合；(3)减弱蛋白相邻亚基之间某些位点的结合能力，如离子键、共价键、氢键转变成δ-与δ+；(4)将空间结构小的残基变成空间结构大的残基，增加结合障碍等。2.分子设计(1)分子模型与分子设计在计算机图形工作站分析，利用计算机模拟烟草花叶病毒外壳蛋白的三维结构，选择合适的突变位点A.TMV外壳蛋白有很高比例的二级结构，50％的残基形成α-螺旋，10％的残基为β-片状结构，此外还有数处的回转结构(reverse turns)。B.外壳蛋白的N-端和C-端均暴露在离子的表面，除了C-末端的4个残基外(aa155-158)，其他的残基都形成了很有序的结构(Namba et al，1989)。C.外壳蛋白亚基之间及亚基与RNA的相互作用使得外壳蛋白紧密地堆积在病毒RNA周围形成了完整的病毒颗，蛋白亚基于亚基、蛋白亚基与核酸的相互作用可归为以下几个方面a.磷酸基团与蛋白质侧链的静电作用；b.碱基和蛋白之间的疏水作用；
c.RNA中，5碳糖(D-核糖)2位OH与蛋白质的作用；d.相邻亚基之间的相互作用。D.水分子在TMV结构中的作用Namba等(1989)研究结果表明水分子分布于外壳蛋白亚基表面，病毒粒子的内表面以及亚基之间的界面，对稳定病毒粒子也有作用。E.TMV外壳蛋白与它的RNA装配是特异的，不与含有装配启始位点的任何DNA组装，这种特异性可能是设计五碳糖2′-OH与蛋白的特异相互作用。正是由于这些相互作用形成了TMV稳定的棒状结构。另外，在分析烟草花叶病毒组不同成员外壳氨基酸序列的同源性时发现只有很少一部分氨基酸残基是保守的，在这些保守残基中主要有位于上述提到相互作用的位点，大约有1/3的位点是维持蛋白质的疏水结构，通过不同的突变体可以得到对病毒结构的稳定产生不同的影响。(2)利用设计引物、链式聚合酶扩增法得到突变体基因；A.根据计算机模拟的外壳蛋白三维结构数据以及TMV蛋白质之间和蛋白与RNA之间的相互作用，我们设计了三个突变体，分别为M37Thr37-Arg(ACA→AGA)M42Thr42-Trp(ACT→TGG)M123Ser123-Glu(AGC→GAA)根据TMV外壳蛋白基因碱基序列(见图1)，采用植物偏爱的密码子，设计了三对突变体引物，分别为Thr42-Trppm42a 5′-ACAACAAGCTCGATGGGTCGTTCAAAGACA-3′pm42b 5′-TGTCTTTGAACGACCCATCGAGCTTGTTGT-3′Thr37-Argpm37a 5′-AAATCAGTTTCAAAGACAACAAGCTCGAAC-3′pm37b 5′-GTTCGAGCTTGTTGTCTTTGAAACTGATTT-3′Ser123-Glupm123a 5′-GGTGGCCATAAGGGAAGCGATAAATAATTT-3′pm123b 5′-AAATTATTTATCGCTTCCCTTATGGCCACC-3′B.根据基因工程方法我们设计了PCR-Directed突变法，采用了合适的条件，得到了突变体外壳蛋白基因。
试验方法如下(PCR-Directed突变方法见附图2)通过PCR方法得到突变CP基因后(见图3)，用Klenow酶补平，插入pBS质粒EcoRV位点。由于PCR方法在DNA扩增过程中，Taq聚合酶缺乏校正功能，因此可能引入错配碱基。所以通过α互补筛选(蓝白筛选)，通过电泳进行质粒大小差异鉴定及酶切鉴定得到重组质粒后，进行DNA序列测定(Sanger etal.1977)，筛选出含有正确突变基因的克隆。
实施例3 包含TMV外壳蛋白突变体基因的植物表达载体克隆的构建PCR-Directed突变法得到的基因克隆入克隆载体pT-vector(由Promega公司购得)采用双脱氧法对序列测定，确定所得的突变体为目的突变体。
将突变体基因采用合适的限制性内切酶(XhoI和BamHI)释放出来，克隆入带有35S启动子的真核表达载体pE3(用XhoI和BglII两种酶切开)中。经过壮观霉素筛选以及酶切鉴定后确认得到了真核表达质粒pE3TMVm37，pE3TMVm42，pE3TMVm123(见图4、5)。
实施例4 利用土壤农杆菌将目的基因导入模式植物—烟草通过感受态法将三个突变体的表达质粒转化入农杆菌LBA4404。采用Dot Blotting的方法对转化的农杆菌进行筛选，得到三个转化菌株TMVm37，TMVm42，TMVm123。用组培无菌烟草叶片为材料，采用叶盘侵染法，用农杆菌菌株分别转化。通过组织培养得到转基因植株；采用PCR法、卡那霉素筛选法得到植物愈伤组织，经过诱导得到转基因再生植株。
图1烟草花叶病毒外壳蛋白突变体基因图2 PCR-Directed的方法获得外壳蛋白突变体基因图3突变TMV-CP基因构建的主要步骤图4植物表达载体pE3MCP的构建图5植物表达载体pE3MCP示意图
权利要求
1.一种制备具下列三种不同序列的烟草花叶病毒U1(TMV-U1)外壳基因突变体基因的方法(三个突变位点)1ATGTCTTACAGTATCACTAC TCCATCTCAG TTCGTGTTCT41 TGTCATCAGCGTGGGCCGAC CCAATAGAGT TAATTAATTTM3781 ATGTACTAATGCCTTAGGAA ATCAGTTTCA
M42121
GTCGTTCAAA GACAATTCAG TGAGGTGTGG161 AAACCTTCACCACAAGTAAC TGTTAGGTTC CCTGACAGTG201 ACTTTAAGGTGTACAGGTAC AATGCGGTAT TAGACCCGCT241 AGTCACAGCACTGTTAGGTG CATTCGACAC TAGAAATAGA281 ATAATAGAAGTTGAAAATCA GGCGAACCCC ACGACTGCCG321 AAACGTTAGATGCTACTCGT AGAGTAGACG ACGCAACGGTM123361 GGCCATAAGG
ATAATTTAAT AGTAGAATTG401 ATCAGAGGAACCGGATCTTA TAATCGGAGC TCTTTCGAGA441 GCTCTTCTGGTTTGGTTTGG ACCTCTGGTC CTGCAACTTG Atranslation＝″MSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQ
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VVQRQFSEVWKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIEVENQANPTTAETLDATRRVDDATVAIR
AINNLIVELIRGTGSYNRSSFESSSGLVWTSGPAT″*□所指为突变位点M37Thr37-Arg (ACA→AGA)M42Thr42-Trp (ACT→TGG)M123Scr123-Glu(AGC→GAA)该方法包括如下步骤提取分离TMV RNA，合成外壳蛋白的cDNA；计算机分析烟草花叶病毒的外壳蛋白三维结构，选择合适的突变位点；合成三对带有突变氨基酸密码子的引物；通过PCR-Directed突变法获得三个外壳蛋白突变体基因；
2.将突变体基因连接入克隆载体、植物表达载体，该方法包括以下步骤PCR-Directed突变法得到的基因克隆入克隆载体pT-vector，经过序列测定，确定所得的突变体为目的突变体，可以进行下一步工作；将突变体基因采用合适的限制性内切酶释放出来，克隆入带有CaMV35S启动子的植物表达载体中，该载体另外至少含有一个多腺苷酸信号和一个植物可以表达的NPTII基因，从而使突变体外壳蛋白基因位于启动子的上游和多腺苷酸信号下游；经过鉴定后确认得到了真核表达质粒pE3TMVm37，pE3TMVm42，pE3TMVm123；
3.制备植物转化载体的细菌细胞的方法，该方法包括如下步骤按照权利要求2制备一个植物转化载体；将该植物转化载体转移到土壤农杆菌中；
4.制备含有突变体基因的转化植物细胞的方法，该方法包括如下步骤按照权利要求3的方法制备含植物转化载体的细菌细胞；将该植物转化载体转移到植物细胞中；
5.一种制备含TMV外壳蛋白突变体基因的转基因植物的方法，该方法包括如下步骤按照权利要求4制备含突变体基因的转化植物细胞；由该转化植物再生植物；
6.一种制备病毒抗性植物的方法，该方法包括如下步骤按照权利要求5的方法制备转基因植物；繁殖该转基因植物。
全文摘要
利用计算机模拟TMV外壳蛋白结构选择合适的氨基酸位点,采用蛋白质工程方法使之突变为所需的氨基酸,从而得到比表达野生型外壳蛋白基因更强的抗烟草花叶病毒植株,并且不会产生异源包被现象,有广泛的农业利用价值。本发明包括利用基因工程方法获得新型的抗病毒植株的方法涉及分子设计、预测,定点突变位点的选择,突变体的获得,基因转化,转基因植物的再生及电镜技术等,采用本发明可以得到大量对TMV高抗性、经济价值高的作物。
文档编号C12N15/40GK1254757SQ9812511
公开日2000年5月31日 申请日期1998年11月24日 优先权日1998年11月24日
发明者李毅, 陈章良, 周北雁, 李恩虎, 俞立 申请人:北京大学