一种筛选烟用农药或安全剂的方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及去毒代谢途径关键酶一一谷胱甘肽转移酶及其在烟用农药安全剂筛选中的应用。
【背景技术】
[0002]杂草和各种病原菌侵染是农业生产的大敌，因此各种除草剂、杀菌剂等化学药剂的使用非常普遍，这些药剂在除草杀菌的同时也造成了环境污染和农作物中较高的农药残留问题。在进入作物体内的农药代谢中，谷胱甘肽转移酶(GSTs)是其中比较关键的一类解毒蛋白。GSTs的主要功能是通过催化还原型谷胱甘肽与内源或外源有毒物质的结合，形成较小毒性和较高水溶性结合物，并可进一步被分泌到质外体或区隔化，达到降低毒性的目的。
[0003]近年来为了降低农药在作物体内的毒性积累及提高作物对农药的抗性、减少农药对作物生长的影响，农药安全剂的研发和使用越来越多。农药安全剂是指可以提高去毒代谢途径中酶(如GSTs)的表达，从而提高作物对除草剂等的耐受性的一类农药。一些作物耐受性农药在作物体内也可以提高作物去毒代谢途径中酶的表达，从而降低农药的毒性及其对作物生长的影响。一般认为植物GSTs活性是植物抵抗除草剂等农药能力的一项重要指标，因此，通过分析作物在施用农药后GSTs活性的变化，筛选可通过GSTs降解去毒的农药和安全剂，有助于指导农业生产、增加作物的安全性。
【发明内容】
[0004]本发明提供一种筛选烟用农药或安全剂的方法，是通过监测农药对烟草GSTs活性变化的影响来实现的。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0006]—种筛选烟用农药或安全剂的方法及应用，以不同待筛选烟用农药或安全剂喷施烟草，取叶片和根作为样品，同时以未施药的烟草叶片和根为对照样，提取样品和对照样的全蛋白提取液，以GSH和CDNB为反应底物，检测各组全蛋白提取液340nm下的吸光值，计算GS-CDNB偶联产物量，进而确定GSTs活性，筛选能使GSTs活性升高的农药或农药安全剂。
[0007]所述GSTs指烟草GSTs家族，包括烟草中所表达的所有的GSTs。
[0008]所述谷胱甘肽转移酶活性分析过程中，使用的底物是GSH和CDNB。
[0009]所述GSTs活性分析作为农药脱毒代谢检测中的应用。
[0010]本发明的有益效果:通过对不同烟用农药或安全剂处理的烟草的全蛋白提取液中的谷胱甘肽转移酶活性进行分析，筛选上调GSTs活性的农药或安全剂。该方法具有操作简单、分析快速、高通量的特点，且对仪器要求不高，可以实现对烟用农药的快速筛选，在烟用农药筛选中具有一定的应用价值和经济价值。
【附图说明】
[0011]图1为不同农药对烟草根中GSTs活性的影响；
[0012]图2为不同农药对烟草叶片中GSTs活性的影响。
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
[0014]以不同待筛选烟用农药或安全剂喷施烟草，取叶片和根作为样品，同时以未施药的烟草叶片和根为对照样，提取样品和对照样的全蛋白提取液，以GSH和CDNB为反应底物，检测各组全蛋白提取液340nm下的吸光值，计算GS-CDNB偶联产物量，进而确定GSTs活性，筛选能使GSTs活性升高的农药或农药安全剂。
[0015]具体步骤如下:样品准备:从市场购置烟草农业上常用除草剂敌草胺、百草枯和杀菌剂甲基托布津、代森猛锌；当实验室内土培栽培烟草(Nicotianatobacum L.)生长至6叶龄时，按照施用说明建议的用量分别喷施在种植烟草的土壤表面或烟草叶片上，分别在施用农药前、施用后5小时、I天、2天取烟草幼苗的根和第三、四位叶片，同时取未施用农药的烟草对照样品。
[0016]全蛋白提取液的制备:使用10mM磷酸缓冲液(pH7.5)按照3:1 (v/w)的比例加入烟草样品中，冰浴研磨至勾楽，离心(14000印111、20111；[11、4°0，上清即为烟草根或叶片的全蛋白提取液，并利用BCA试剂盒(Thermo ,pierce)测定全蛋白提取液的蛋白浓度。
[0017]吸光值的检测:使用酶标板作为比色皿，依次加入ΙΟΟμΙ全蛋白提取液、97.8μ1上述10mM磷酸缓冲液、2μ1 GSH(200mM)、0.2yl CDNB(IM)，空白对照为 197.8μ1 上述10mM磷酸缓冲液、2μ1 GSH(200mM)、0.2μ1 CDNB(IM)，每个样品设置3个重复，放入酶标仪中连续监测340nm下5min内的光吸收值变化。
[0018]活性计算:使用反应伊始和反应2min时340nm处的读数计算△ A340/min，根据公式
[0019]活性=[AA340/min(样品)-AA340/min(空白对照)]X0.2ml/5.3(mM-lcm-l)/
0.lml/Con(g/ml)X1000
[0020]计算全蛋白粗提液的GSTs活性，其中0.2ml为反应总体积，0.1ml为蛋白粗提液的加入量，5.3为摩尔消光系数，Con为粗提液的蛋白浓度，活性单位为每克蛋白每分钟生成的CDNB偶联产物的微摩尔数。
[0021 ] GSH与CDNB偶联的反应式为:
[0022]C6H3 (NO2)2Cl +GSH^C6H3 (NO2)2 SG+H++C1-
[0023]结果分析:在GSTs参与下该反应可快速进行，CDNB-SG偶联产物在340nm处有特征吸收峰，因此根据340nm处光吸收值的变化快慢可以判别GSTs的活性强弱。
[0024]不同农药处理后烟草根和叶片全蛋白提取液中CDNB偶联活性的变化如图1和图2所示，敌草胺和代森锰锌可以显著提高烟草根或叶片中的GSTs的活性，说明敌草胺和代森锰锌对烟草GSTs的表达具有诱导作用，高GSTs活性有利于异源物质的代谢去毒。因此根据GSTs在异源有毒物质代谢中的作用，在本实验所筛选的几种农药中，除草剂敌草胺和杀菌剂代森锰锌可优先应用于烟草农业实际生产，事实上多年农业生产实践也表明敌草胺和代森锰锌是安全、低毒、有效的农药试剂，在烟草农业中的应用非常广泛。
【主权项】
1.一种烟用农药或安全剂筛选的方法，以不同待筛选烟用农药或安全剂喷施烟草，取叶片和根作为样品，同时以未施药的烟草叶片和根为对照样，其特征在于:提取样品和对照样的全蛋白提取液，以GSH和CDNB为反应底物，检测各组全蛋白提取液340nm下的吸光值，计算GS-CDNB偶联产物量，进而确定GSTs活性，筛选能使GSTs活性升高的农药或农药安全剂。2.如权利要求1所述的烟用农药或安全剂筛选的方法，其特征在于:所述GSTs指烟草GSTs家族，包括烟草中所表达的所有的GSTs。3.如权利要求2所述的烟用农药或安全剂筛选的方法，其特征在于:所述谷胱甘肽转移酶活性分析过程中，使用的底物是GSH和CDNB。4.一种筛选烟用农药或安全剂的方法在作为农药脱毒代谢检测中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种烟用农药或安全剂筛选的方法，以不同待筛选烟用农药或安全剂喷施烟草，取叶片和根作为样品，同时以未施药的烟草叶片和根为对照样，其特征在于：提取样品和对照样的全蛋白提取液，以GSH和CDNB为反应底物，检测各组全蛋白提取液340nm下的吸光值，计算GS-CDNB偶联产物量，进而确定GSTs活性，筛选能使GSTs活性升高的农药或农药安全剂。该方法具有操作简单、分析快速、高通量的特点，且对仪器要求不高，可以实现对烟用农药的快速筛选，在烟用农药筛选中具有一定的应用价值和经济价值。
【IPC分类】A01N25/32, G01N21/31
【公开号】CN105445209
【申请号】CN201511025441
【发明人】周会娜, 陈千思, 翟妞, 刘萍萍, 陈霞, 郑庆霞, 张慧, 徐国云, 林福呈
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月31日