专利名称：一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法
技术领域：
本发明为转基因作物育种领域，具体涉及一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法
背景技术：
萝卜(Raphanus sativus L.)，别名莱菔，芦菔，属十字花科萝卜属，根部为主要肉食器官，营养丰富，世界各地均有栽培。萝卜的转基因工作还处于起步阶段，对于转化材料的筛选与鉴定，使用传统的分子检测方法不仅工作量大、成本高，且不易操作。同时，对于获得的植株还要对其后代的遗传规律进行研究，这些都需要大量的转基因后代的筛选和鉴定工作。因此，利用简便的标记基因进行转基因植株的快速检测方法已越来越受到重视。卡那霉素(Kanamycin，简写Kan) 是目前被广泛应用于植物遗传转化的选择标记基因，卡那霉素多用于组织培养阶段对转化植株进行初步筛选，再利用PCR、Southern blot杂交等方法检测目的基因是否整合到植物基因组中。卡那霉素田间快速筛选转基因植株的方法，在转基因棉花、大豆、番茄、水稻、小麦中已有报道，但在转基因萝卜植株的筛选方面尚未见报道。卡那霉素田间快速选择的效果因植物种类，以及对应的涂抹浓度、观测时间而变化很大。为此，此试验以带有NPT II标记基因的转基因萝卜为材料，利用不同浓度卡那霉素叶片进行叶片涂抹，以确定其适宜的涂抹浓度和观测时间，并对卡那霉素涂抹方法的可靠性进行了 PCR验证，其结果对于实现萝卜田间转基因植株的规模化快速选择、加快育种进程具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法，确定了 Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度、观察时间；经PCR检测验证，Kan筛选抗性苗的阳性检测率达到93.8%。研究建立了一种在田间对转基因萝卜进行大量筛选的简便方法，对于转基因萝卜材料的选育具有重要价值。本发明采用的技术方案是一种卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法，其特征在于按以下步骤进行(1)材料准备试验材料为NPT II标记基因的转基因萝卜(为市售产品，购买于湖北省农业科学院经济作物研究所；也可通过常规基因工程技术获得Bt基因构建于质粒pCMIaN中，选择标记为NPT II基因，农杆菌菌株转化)(2)叶片卡那霉素涂抹适宜浓度和观测时间的确定卡那霉素用附加0. 2%吐温20的双蒸水分别配制成Omg/L，250mg/L，500mg/L， 750mg/L，lOOOmg/L, 1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L 浓度的 8 个处理，每处理重复 4 次，采用随机区组设计；Kan用毛笔涂抹于植株的完全展开的两片真叶的中间叶片上，湿润即可。分
3别在涂抹后第3、6、9、12、15天观察记录叶片的反应情况，以确定萝卜叶片的情况，卡那霉素筛选浓度和观察时间。(3)转基因Ttl代萝卜卡那霉素涂抹筛选试验转基因植株60个株系的后代Ttl代种子播种于育苗床，每株系40 150粒种子， 当株高达到20 25cm时，按照上述方法用1000mg/L浓度的Kan进行叶片涂抹，12天后调查结果，以处理部位叶面颜色正常为Kan抗性转基因植株，叶面出现褪绿斑点的植株为Kan 敏感阴性植株。(4) Kan涂抹结果的PCR检测验证为检测Kan涂抹结果的可靠性，随机挑选4个等级的68个转化植株和1 个未转化的植株为阴性对照，小量法抽提DNA，并利用BtCrylIa基因的引物Pl 5，-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3，；P2 :5，-ACTTGGATGCGGATGGAC-3，进行 PCR 扩增，扩增条带为 769bp，扩增产物用1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测。所述的Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度为1000mg/L，观察时间以12天为宜。本发明取得的有益效果经PCR检测验证，Kan筛选抗性苗的阳性检测率达到93.8%。研究建立了一种在田间对转基因萝卜进行大量筛选的简便方法，对于转基因萝卜材料的选育具有重要价值。
具体实施例方式下面对本发明作一详细说明实施例1材料与方法1.1试验材料1. 1. 1植物材料(1)材料准备试验材料为NPT II标记基因的转基因萝卜(为市售产品，购买于湖北省农业科学院经济作物研究所；也可通过常规基因工程技术获得Bt基因构建于质粒pCMIaN中，选择标记为NPT II基因，农杆菌菌株转化)1. 2叶片卡那霉素涂抹适宜浓度和观测时间的确定卡那霉素用附加0. 2%吐温20的双蒸水分别配制成0mg/L，250mg/L，500mg/L， 750mg/L，lOOOmg/L, 1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L 浓度的 8 个处理，每处理重复 4 次，采用随机区组设计；Kan用毛笔涂抹于植株的完全展开的两片真叶的中间叶片上，湿润即可。分别在涂抹后第3、6、9、12、15天观察记录叶片的反应情况，以确定萝卜叶片的情况，卡那霉素筛选浓度和观察时间。1. 3转基因TO代萝卜卡那霉素涂抹筛选试验转基因植株60个株系的后代TO代种子播种于育苗床，每株系40 150粒种子， 当株高达到20 25cm时，按照上述方法用1000mg/L浓度的Kan进行叶片涂抹，12天后调查结果，以处理部位叶面颜色正常为Kan抗性转基因植株，叶面出现褪绿斑点的植株为Kan 敏感阴性植株。1. 4 Kan涂抹结果的PCR检测验证
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为检测Kan涂抹结果的可靠性，随机挑选4个等级的68个转化植株和1个未转化的植株(为阴性对照)，小量法抽提DNA，并利用引物(Pl 5‘-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3‘ ；P2 5’ -ACTTGGATGCGGATGGAC-3’ )进行PCR扩增，扩增条带为769bp，扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。2结果与分析2. 1萝卜叶片对Kan处理后的变色效果以未转化Bt基因萝卜品种)(D2-A为供试材料，观测了 Kan涂抹后叶片颜色的变化情况。根据田间观察的结果，萝卜叶片对Kan处理后的最终反应程度划分为4个等级。1 级涂抹部位叶色正常；2级叶片涂抹部位的叶色轻微变黄(与周边正常叶色略有差异， 但不明显)，叶色仍为绿色；3级涂抹部位失绿，叶色由绿转黄，与周边正常叶色差异明显； 4级处理部位严重失绿，叶色转白色或褐色。在以上4个等级中，叶片反应处在1、2级的处理，未能完全消除萝卜叶片自身对卡那霉素抗性的限度，在转基因植株的检测中，会增加假阳性单株的数量，从而影响选择的效果。叶片在3级的处理，基本上消除了叶片自身对卡那霉素处理的负面效应，可作为卡那霉素起始筛选的标准。2. 2 Kan的筛选浓度及观察时间当筛选浓度为250mg/L时，随着反应时间的延长叶片颜色几乎无变化，主要呈现1 级反应；当筛选浓度为500mg/L时，叶片对Kan的反应随时间的延长变化不明显，主要表现为2级反应，因此若以上述浓度进行筛选，会增加假阳性单株的数量，影响选择的效果；当 Kan浓度彡1000mg/L时，叶片颜色迅速变黄，甚至枯死。因此，以1000mg/L作为筛选的临界浓度较为理想，在该筛选浓度下，叶片失绿明显，且随着筛选时间的延长反应级明显升高， 便于区分和观察。除250mg/L和500mg/L处理随着时间的延长叶片反应无明显变化外，其他浓度处理，1 12天反应级持续增高，12天后基本趋于稳定，故观察时间以12天为宜。2. 3 TO代转基因萝卜Kan涂抹结果用1000mg/L浓度的Kan进行叶片涂抹，12天后可以看到，对照植株涂抹部位有明显的褪绿斑点，而转基因株系则表现为不明显的褪绿。2. 4 Kan涂抹结果的PCR检测验证随机挑选1000mg/L浓度Kan涂抹筛选转基因植株36株，其中1级反应PCR检测阳性率为100%，2级反应PCR检测阳性率为87. 5%，3、4级反应PCR检测阳性率均为0。对Kan表现高抗和抗性的植株(反应1 2级)中，Kan涂抹检测结果与PCR检测结果的符合度为93.8%。由此表明，利用Kan叶片涂抹法可以快速、准确的筛选转基因萝
卜植株的外源基因的情况，其涂抹检测结果与PCR检测具有较好的一致性。
权利要求
1.一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法，其特征在于按以下步骤进行(1)材料准备试验材料为NPTII标记基因的转基因萝卜；(2)叶片卡那霉素涂抹适宜浓度和观测时间的确定卡那霉素用附加0. 2%吐温20的双蒸水分别配制成Omg/L，250mg/L，500mg/L，750mg/ L，lOOOmg/L, 1500mg/L，2000mg/L，2500mg/L浓度的8个处理，每处理重复4次，采用随机区组设计；Kan用毛笔涂抹于植株的完全展开的两片真叶的中间叶片上，湿润即可；分别在涂抹后第3、6、9、12、15天观察记录叶片的反应情况，以确定萝卜叶片的情况，卡那霉素筛选浓度和观察时间；(3)转基因Ttl代萝卜卡那霉素涂抹筛选试验转基因植株60个株系的后代Ttl代种子播种于育苗床，每株系40 150粒种子，当株高达到20 25cm时，按照上述方法用1000mg/L浓度的Kan进行叶片涂抹，12天后调查结果，以处理部位叶面颜色正常为Kan抗性转基因植株，叶面出现褪绿斑点的植株为Kan敏感阴性植株；(4)Kan涂抹结果的PCR检测验证为检测Kan涂抹结果的可靠性，随机挑选4个等级的68个转化植株和1个未转化的植株为阴性对照，小量法抽提DNA，设计引物进行PCR扩增，扩增条带为769bp，扩增产物用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤(2)中Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度为1000mg/L，观察时间为12天。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的步骤⑷中设计引物具体为P1 5，-AGCCGTTTGTTAGTGCCT-3，；P2 :5’ -ACTTGGATGCGGATGGAC-3，。
全文摘要
本发明提供一种利用卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因萝卜的方法，试验材料为NPT II标记基因的转基因萝卜，Kan叶片涂抹田间筛选的最佳浓度为1000mg/L，观察时间以12天为宜；经PCR检测验证，Kan筛选抗性苗的阳性检测率达到93.8％。研究建立了一种在田间对转基因萝卜进行大量筛选的简便方法，对于转基因萝卜材料的选育具有重要价值。
文档编号A01G1/00GK102217472SQ20111006544
公开日2011年10月19日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者丁自立, 何云启, 崔磊, 张兴中, 梅时勇, 梅雪飞, 王晴芳, 甘彩霞, 高翔, 黄来春 申请人:湖北省农业科学院经济作物研究所