一种检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法及使用其的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测食品中卡那霉素的的样本前处理方法及使用其的检测方法， 尤其适用于检测牛奶中的卡那霉素。
【背景技术】
[0002] 卡那霉素在农业、畜牧业和水产业中应用比较广泛，也常被添加到饲料中促进动 物生长发育，但残留在畜产品中的抗生素被人类长期食用后将对人类健康产生巨大危害。 因此，欧盟、美国FDA以及日本等许多国家和机构对该类抗生素在食品中的残留限量都作 了明确的规定。我国也加强了该类抗生素在牛奶以及其它动物源性食品中的残留监控。
[0003] 目前，卡那霉素的检测方法很多，如微生物法、酶联免疫法、气相色谱法、高效液相 色谱法以及液相色谱-质谱联用法。检测牛奶中卡那霉素时，通常样品前处理比较复杂，且 最终回收率往往不尽人意。在《GB/T 22969-2008奶粉和牛奶中链霉素、双氢链霉素和卡那 霉素残留量的测定之液相色谱-串联质谱法》中，样品经磷酸溶液提取并除去蛋白后，上清 液需分别通过苯磺酸型固相萃取柱和羧酸型固相萃取柱的净化程序，检测过程耗时较长、 操作步骤繁琐，不能满足日常快速检测的要求。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法，其简单快速， 且可有效保留样本中的卡那霉素。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种检测牛奶中卡那霉素的方法，其操作简单快速， 且回收率和精密度较高。
[0006] 本发明提供了一种检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法，包括：取待测牛奶样 品，加入磷酸水溶液振荡提取8至10分钟，再加入三氯乙酸水溶液，混合30秒后离心，取离 心后的上清液经滤纸过滤，得到滤液；将滤液用混合型阳离子交换固相萃取柱净化，得到净 化液；以及将净化液在40°C水浴中氮气吹干，再加入定溶液，涡旋溶解后经0. 22 μ m水系滤 膜过滤，得到待测液；定溶液的配制方法为：取4毫升甲酸，用0. 01摩尔/升的庚烷磺酸钠 水溶液定容至100毫升。
[0007] 在检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法的一种示意性实施方式中，磷酸水溶液 中磷酸的体积分数为5%，处理每克待测牛奶样品需要磷酸水溶液的量为3. 75毫升。
[0008] 在检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法的一种示意性实施方式中，三氯乙酸水 溶液中三氯乙酸的浓度为1克/毫升，处理每克待测牛奶样品需要三氯乙酸水溶液的量为 0· 375晕升。
[0009] 在检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法的一种示意性实施方式中，离心的转速 为4000至5000转/分钟，离心时长为8至10分钟。
[0010] 在检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法的一种示意性实施方式中，净化的步骤 为：将滤液加入已活化的混合型阳离子交换固相萃取柱，控制流速不高于2毫升/分钟，待 滤液全部通过后，依次用3毫升体积分数为2%的甲酸水溶液和3毫升甲醇洗涤混合型阳离 子交换固相萃取柱，弃去全部流出液，最后用3毫升体积分数为5%的氨化甲醇溶液洗脱，收 集洗脱液，得到净化液。
[0011] 在检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法的一种示意性实施方式中，混合型阳离 子交换固相萃取柱活化的方法为：先用3至5毫升甲醇过柱，再用3至5毫升水过柱。
[0012] 本发明还提供了一种检测牛奶中卡那霉素的方法，包括：用上述的检测牛奶中卡 那霉素的样本前处理方法对待测牛奶样品进行前处理，得到待测液；以及用液相色谱-串 联质谱法对待测液中卡那霉素的含量进行检测。
[0013] 在检测牛奶中卡那霉素的方法的一种示意性实施方式中，液相色谱-串联质谱法 的色谱条件为：色谱柱=ACQUITy UPLC HSS T3柱（Φ2. IX 100毫米，1. 8微米);柱温：40°C; 进样体积：1〇微升；洗脱液体：流动相A为乙腈，流动相B为体积分数为0. 1%的甲酸水溶 液；梯度洗脱：〇分钟，10%流动相A，其余部分为流动相B ;0至1. 5分钟，10%至25%流动相 A，其余部分为流动相B ; 1. 5至2. 5分钟，25%至100%流动相A，其余部分为流动相B ;2. 5 至3. 0分钟，100%流动相A，其余部分为流动相B ;3. 0至3. 5分钟，100%至10%流动相A， 其余部分为流动相B ;3. 5至4. 5分钟，10%流动相A，其余部分为流动相B ;和流速：0. 3毫 升/分钟。
[0014] 在检测牛奶中卡那霉素的方法的一种示意性实施方式中，液相色谱-串联质谱法 的质谱条件为：离子化模式：电喷雾正离子模式；质谱扫描方式：多反应监测；电离电压： 3. 00千伏；离子源温度：120°C ;去溶剂气温度：40(TC ;去溶剂气：氮气；流量：600升/小 时；和碰撞气：高纯Ar ;流量：50升/小时。
[0015] 在检测牛奶中卡那霉素的方法的一种示意性实施方式中，液相色谱-串联质谱法 的质谱参数为：保留时间：2. 52分钟；驻留时间：0. 05秒；锥孔电压：40V ;母离子质荷比： 485. 1 ;第一碰撞能量：25eV ;第一子离子质荷比：162. 6 ;第二碰撞能量：15eV ;第二子离子 质荷比：323. 8。
[0016] 本发明提供的一种检测牛奶中卡那霉素的样本前处理方法，其操作简单快速，可 有效保留样本中的卡那霉素。
[0017] 本发明提供的一种检测牛奶中卡那霉素的方法，其操作简单快速，且回收率和精 密度较高。
【具体实施方式】
[0018] 为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下实施例说明 本发明的【具体实施方式】。
[0019] 第一实施例：样本前处理方法。
[0020] 1、试剂与材料。
[0021] 卡那霉素标准品购自德国Dr. Ehrenstorfer GmbH ;甲醇、乙腈均为色谱纯；磷酸、 甲酸、乙酸、氢氧化钠、三氯乙酸、庚烷磺酸钠等试剂均为优级纯；实验室用水为去离子水； 定量滤纸为中速滤纸，直径12. 5cm ;混合型阳离子交换固相萃取柱（MCX 50mg/3mL，waters 公司）。
[0022] 体积分数为0. 3%乙酸水溶液：加入0. 3mL乙酸至IOOmL容量瓶，用水定容至刻度， 其中所用乙酸的浓度为36% (质量分数)。
[0023] 标准溶液：准确称取适量的卡那霉素标准品，用体积分数为0. 3%乙酸水溶液配制 成100mg/L的标准储备液，4°C冰箱储存。使用时，用体积分数为0. 3%乙酸水溶液稀释成 0. 01 μ g/mL、0. 02 μ g/mL、0. 05 μ g/mL、0. 10 μ g/mL 和 0. 20 μ g/mL 的五个浓度梯度的标准 工作液。
[0024] 磷酸水溶液：其中磷酸的体积分数为5%;配制方法为取50mL磷酸，用水定容至 IL0
[0025] 三氯乙酸水溶液：其中三氯乙酸的浓度为1克/毫升；配制方法为称取三氯乙酸 20g，用水定容至20mL。
[0026] 甲酸水溶液：其中甲酸的体积分数为2% ;配制方法为吸取2mL甲酸与98mL水混 合。
[0027] 体积分数为5%的氨化甲醇溶液：取5mL氨水至IOOml容量瓶,用甲醇定容至刻度。 其中所使用氨水的质量分数为25%。
[0028] 定溶液：取4mL甲酸，用0,01mol/L庚烷磺酸钠水溶液定容至100mL。
[0029] 2、待测牛奶样品的前处理： a、 取4克待测牛奶样品(精确到0. 01克)于50毫升离心管中，加入15毫升磷酸水溶液 置于振荡器上振荡提取10分钟；再加入1. 5毫升三氯乙酸水溶液，在涡旋混合器上混合30 秒后离心，离心的转速为5000转/分钟，离心时长为10分钟；取离心后的上清液经滤纸过 滤，得到滤液； b、 将混合型阳离子交换固相萃取柱先用3毫升甲醇过柱，再用3毫升水过柱，得到已活 化的混合型阳离子交换固相萃取柱；将步骤a中得到的滤液加入已活化的混合型阳离子交 换固相萃取柱，控制流速不高于2毫升/分钟；待滤液全部通过后，依次用3毫升甲酸水溶 液和3毫升甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，弃去全部流出液；最后用3毫升体积分 数为5%的氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到净化液； c、 将净化液在40°C水浴中氮气吹干，再加入1毫升定溶液，涡旋溶解后经0. 22 μ m水系 滤膜过滤，得到待测液。
[0030] 第二实施例：样本前处理方法。
[0031] 1、试剂与材料：与第一实施例所述"试剂与材料"相同。
[0032] 2、待测牛奶样品的前处理： a、 取4克待测牛奶样品(精确到0. 01克)于50毫升离心管中，加入15毫升磷酸水溶液 置于振荡器上振荡提取8分钟；再加入1. 5毫升三氯乙酸水溶液，在涡旋混合器上混合30 秒后离心，离心的转速为4000转/分钟，离心时长为8分钟；取离心后的上清液经滤纸过 滤，得到滤液； b、 将混合型阳离子交换固相萃取柱先用5毫升甲醇过柱，再用5毫升水过柱，得到已活 化的混合型阳离子交换固相萃取柱；将步骤a中得到的滤液加入已活化的混合型阳离子交 换固相萃取柱，控制流速不高于2毫升/分钟；待滤液全部通过后，依次用3毫升甲酸水溶 液和3毫升甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，弃去全部流出液；最后用3毫升体积分 数为5%的氨化甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，得到净化液； C、将净化液在40°C水浴中氮气吹干，再加入1毫升定溶液，涡旋溶解后经0. 22 μ m水系 滤膜过滤，得到待测液。
[0033] 第三实施例：样本前处理方法。
[0034] 1、试剂与材料：与第一实施例所述"试剂与材料"相同。
[0035] 2、待测牛奶样品的前处理： a、 取4克待测牛奶样品(精确到0. 01克)于50毫升离心管中，加入15毫升磷酸水溶液 置于振荡器上振荡提取9分钟；再加入1. 5毫升三氯乙酸水溶液，在涡旋混合器上混合30 秒后离心，离心的转速为4500转/分钟，离心时长为9分钟；取离心后的上清液经滤纸过 滤，得到滤液； b、 将混合型阳离子交换固相萃取柱先用4毫升甲醇过柱，再用4毫升水过柱，得到已活 化的混合型阳离子交换固相萃取柱；将步骤a中得到的滤液加入已活化的混合型阳离子交 换固相萃取柱，控制流速不高于2毫升/分钟；待滤液全部通过后，依次用3毫升甲酸水溶 液和3毫升甲醇洗涤混合型阳离子交换固相萃取柱，弃去全部流出液；最后用3毫升体积分