潮霉素抗性基因及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种潮霉素抗性基因及其应用，其解决了潮霉素抗性基因在假丝酵母菌中不能正常表达，从而不能作为筛选标记来使用的技术问题，其编码区核苷酸序列如序列表的序列12和13所示。本发明同时提供了其应用，可用于假丝酵母菌的基因工程改造。
【专利说明】
潮霉素抗性基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种潮霉素抗性基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 在微生物分类中，有一类酵母菌被称为假丝酵母（Candida)，在分类地位上属于 属，一般能形成假菌丝、不产生子囊孢子，大多属于二倍体，即每个基因都有等位基因，两个 等位基因具备同等的生理功能。不少的假丝酵母能利用正烷烃为碳源进行石油发酵脱蜡， 并产生有价值的产品，在发酵工业中有着广泛的应用。其中氧化正烷烃能力较强的假丝酵 母，如解脂假丝酵母（C. lipolytica)或热带假丝酵母（C. tropicalis)，能够生产长链二元 酸。有些种类可用作饲料酵母；个别种类能引起人或动物的疾病。由于假丝酵母在工业生 物技术、医学等领域具有重要的研究价值，利用基因工程进行菌种改造受到了广泛关注。高 效的遗传操作系统，包括良好的筛选标记、有效的转化手段和高效的同源重组方法，是代谢 工程育种的前提。一般情况，可以利用营养缺陷型（如不同的氨基酸营养缺陷型）或抗性 (如不同的耐药性）作为筛选标记。由于菌种、菌株的不同，其细胞壁结构、生理生化特性和 遗传背景相差较大，抗性标记并不一定完全通用，在实际使用上有一定的限制。特别是，假 丝酵母在密码子使用方面具有特殊性，将CUG密码子翻译成丝氨酸，而其他绝大多数物种 将该密码子翻译为亮氨酸。这就限制了外源抗性基因作为选择性标记在假丝酵母菌种改造 中的使用。另外，在二倍体酵母的基因工程改造中，往往需要几种抗性联合作为筛选标记来 完成对含有等位基因的靶位点或多个不同靶位点的基因工程改造，如基因敲除、基因插入、 基因替换、基因表达增强或减弱等等。
[0003] 潮霉素是来源于吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus)的氨基糖苷类抗生 素，分子式为C2(]H37N 3013，含有A、B两种组分。其中，潮霉素B是一种常用的抗性筛选药物， 通过干扰70S核糖体移位，导致错误翻译，抑制蛋白合成。其抗性基因表达产物是一个蛋 白激酶，通过磷酸化潮霉素B使其丧失活性，由于在真核和原核生物中潮霉素B筛选假阳 性率低，重复性好，被广泛使用。大肠杆菌的hph基因就编码这样一个蛋白激酶，能使潮霉 素B丧失活性。最早潮霉素抗性基因hph由科学家从大肠杆菌里分离获得，并且作为筛 选标记应用于酿酒酵母的遗传操作中（Gene 1983, 25 (2-3): 179-88)，又经过改进获得质粒 pAG32 (Yeastl999, 15:1541-53)〇
[0004] 然而由于假丝酵母密码子系统具有上述的特殊性，未经优化的潮霉素B抗性基因 (如大肠杆菌的hph基因）在假丝酵母菌中不能正常表达，从而不能作为筛选标记来使用。
【发明内容】
[0005] 本发明就了为了解决潮霉素B抗性基因在假丝酵母菌中不能正常表达，从而不能 作为筛选标记来使用的技术问题，提供一种可以在假丝酵母菌中正常表达，从而可作为筛 选标记来使用的潮霉素抗性基因及其应用。
[0006] 本发明提供了一种潮霉素抗性基因，其编码区核苷酸序列如序列表的序列12所 不。
[0007] 优选地，潮霉素抗性基因，其编码区核苷酸序列符合假丝酵母属的密码子编码系 统。
[0008] 本发明同时提供一种潮霉素抗性基因，其核苷酸序列如序列表的序列13所示。
[0009] 本发明还提供潮霉素抗性基因在假丝酵母菌基因工程改造中的应用。
[0010] 优选地，本发明在对假丝酵母菌基因工程改造中，对靶位点等位基因之一进行敲 除；基因敲除的靶位点为酯酰辅酶A合成酶基因，该基因的等位基因分别为如序列表14所 示的 CandidaA00308 和序列表 15 所示的 Candida01833。
[0011] 本发明提供一种潮霉素抗性筛选标记元件的构建方法，通过分子生物学方法在该 基因的前后分别加上启动子和终止子序列，其包括如下步骤：（1)准备引物PI、P2、P3、P4、 P5、P6 ; (2)使用步骤一中的引物分别扩增启动子、优化的潮霉素抗性基因片段及终止子； (3)步骤1中的P1和P6为引物，步骤2中的PCR产物为模板，扩增完整的潮霉素抗性筛选 标记元件；(4)将步骤3中获得的潮霉素抗性筛选标记元件进行末端加A反应；（5)将步骤 4中获得的片段与PMD-18T载体相连接，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，蓝白斑筛选，阳性 克隆通过测序验证，制备质粒，保存备用。本发明获得的质粒含有优化的潮霉素抗性基因筛 选标记元件。
[0012] 本发明同时提供一种通过双交换同源重组对假丝酵母菌进行基因工程改造的方 法，其包括如下步骤：（1)准备引物ACS-hph-F和ACS-hph-R ; (2)准备假丝酵母菌感受态细 胞；⑶使用步骤⑴中的引物进行扩增HygB抗性基因，利用扩增的产物对菌种中的靶位 点等位基因之一进行敲除；（4)通过PCR扩增、纯化、电转、筛选、鉴定，得到基因工程改造后 的新菌株。
[0013] 本发明提供的假丝酵母菌基因工程改造方法中，所使用的菌株为假丝酵母Candia sp.(参见《微生物学报》1980,20(1):88-93,正烷烃发酵生产长链混合二羧酸，可从中国科 学院微生物研究所购买）。
[0014] 总体上，由于假丝酵母密码子系统的特殊性，天然的潮霉素抗性基因本身不能直 接应用于假丝酵母菌的基因工程操作。本发明提供了一种解决方法，解决了这个问题。具 体地讲，潮霉素抗性基因序列经优化并人工合成后，再经过分子生物学组装加上启动子和 终止子元件，从而得以在假丝酵母体内中进行功能性表达，使得假丝酵母能在含潮霉素的 培养基中生长。因而，本发明优化后的潮霉素抗性基因可以作为筛选标记用于基因工程操 作中，实现对假丝酵母的菌种改造，如基因敲除、基因插入、基因替换、基因表达增强或减弱 等等。
【附图说明】
[0015] 图1为本发明涉及到的潮霉素抗性筛选标记元件得构建流程图；
[0016] 图2为本发明涉及到的潮霉素抗性筛选标记元件构建过程中的PCR扩增结果电泳 图；
[0017] 图3为本发明涉及到的基因敲除流程图；
[0018] 图4为本发明涉及到的利用潮霉素抗性筛选标记元件进行ACS基因敲除结果示意 图。
【具体实施方式】
[0019] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0020] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0021] 本发明中，序列表中序列名称如下：序列1 :引物P1 ;序列2 :引物P2 ;序列3 :弓丨 物P3 ;序列4 :引物P4 ;序列5 :引物P5 ;序列6 :引物P6 ;序列7 :引物ACS-hph-F ;序列 8 :引物ACS-hph-R;序列9 :引物ACS-U ;序列10 :引物ACS-D ;序列11 :大肠杆菌潮霉素 抗性基因hph编码区核苷酸序列；序列12 :优化后的潮霉素抗性基因hph编码区核苷酸 序列；序列13 :带有启动子和终止子的潮霉素抗性筛选标记元件的核苷酸序列；序列14 : CandidaA00308 ;序列 15 :Candida01833〇
[0022] 以下实施例中使用了下面所列的培养基：
[0023] 1、YPD培养基，其配方为：1%的酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固体培养基， 加入2%琼脂粉。上述百分比为质量体积百分比，即每100毫升培养基所需该组分的克数。 若要添加抗生素，液体培养基在使用时加入至相应终浓度。固体培养基在高压灭菌后冷却 至50摄氏度左右时，加入抗生素至相应终浓度，混匀后立刻倒如无菌的培养皿中，待凝固 后倒置，放于4摄氏度冰箱，两周内使用。
[0024] 2、LB培养基，其配方为：0. 5%的酵母膏，1%蛋白胨，1% NaCl，若制固体培养基， 加入1%琼脂粉。121°C灭菌30分钟。
[0025] 以下实施例中使用了下面所列的菌体培养及发酵液处理方式：
[0026] 1、平板培养：在YH)平板上划线或涂布后倒置于30°C培养箱内，2-3天即可观察到 大而饱满的乳白色菌落形成。
[0027] 2、摇床培养：平板上接种单菌落至液体培养基中，或从液体培养基转接过来，30°C 摇床培养，转速保持在220转/分钟。
[0028] 实施例1 :潮霉素抗性筛选标记元件的构建
[0029] (1)潮霉素抗性筛选标记元件的构建流程图如图1所示。根据启动子序列（质粒 PAG32的TEF启动子），优化合成后的潮霉素抗性基因序列，终止子序列（质粒pAG32的TEF 终止子）设计引物。弓丨物设计：TEF启动子的下游引物P2的右半段是优化合成后的潮霉素 抗性基因的上游引物P3的部分序列；P3同理；则P2和P3的部分碱基可互补配对。同理设 计P4和P5引物。
[0030] (2)以质粒pAG32为模板，P1和P2为引物1和引物2,进行PCR扩增得到TEF启 动子片段，大小为400bp左右，标为PCR产物1。以优化合成的潮霉素抗性基因为模板，以 P3和P4为引物1和引物2,进行PCR扩增得到潮霉素抗性基因片段，大小约为1050bp，标为 PCR产物2。以质粒pAG32为模板，P5和P6为引物1和引物2,进行PCR扩增得到TEF终止 子，大小约为274bp，标为PCR产物3。结果见附录图2。
[0031] PCR反应体系为：
[0032] ]Ox缓冲液 5 Pi 模版 1 P 1 引物1 (10 p M ) 1 il l 引物 2 (10 yM ) 1 il l dNTP (10 mM) 1 p 1 DNA聚合酶（5 U/ tt 1) 0. 25 yl 超纯水_40.75 pi ft 50 p 1
[0033] DNA聚合酶是宝生物工程有限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的 Phusion DNA聚合酶，活性单位均为5U/ y 1 〇
[0034] PCR 程序为：
[0035] 94°C： 2 min 9'rc 30 s - 55r： 30 s - 30 个循环 72〇C 1 min 15 s. - 7:2 "C： 10 min
[0036] (3)以步骤2中的PCR产物1、2、3以1:1:1的比例作为模板，以PI、P6位引物1和 引物2,进行PCR扩增得到大小约为1660bp的PCR产物4。PCR反应体系同步骤2。结果见 附录图2。
[0037] PCR 程序为：
[0038] 94。。 2 min 9'rc 30 s - 58V 30 s - 30个循环 72V 2 min - 72 V 1(3 min
[0039] (4)在步骤3所得的PCR产物4中加入0? 2 y 1 dNTP和0? 3 y 1 ExTaqDNA聚合酶 (5U/ y 1，宝生物公司），72°C保温反应10分钟。反应结束后，取5 y 1上述PCR样品进行琼 脂糖电泳检测，证明扩增所得的DNA片段大小与预计的一样，而且没有杂带，对DNA进行纯 化，利用PCR纯化试剂盒（购自Omega公司），按照说明书进行操作。
[0040] (5)将步骤4中回收的DNA与pMD-18T载体16°C连接，将连接产物转化至大肠杆 菌DH5a感受态细胞（全式金公司），按照说明书进行操作。其中，热击和复苏处理后将菌 液与 40 y 1 IPTG (100mM)、15 y lX-gal (20mg/ml)均匀，涂布于 LB 平板（含 100 y g/ml 氨苄 青霉素）上，37°C培养16小时。挑选蓝色单菌落，接种至lml LB液体培养基（含100 y g/ ml氨苄青霉素），振荡培养2小时，用T载体通用引物进行菌液PCR鉴定，鉴定结果如附录 图2所示。将PCR验证正确的质粒送公司进行sanger法测序验证，测序结果表明，含有启 动子和终止子的潮霉素抗性基因元件获得了正确构建，构建过程中没有引入突变。新构建 的质粒命名为pUC-hph 113。
[0041] 本发明对大肠杆菌的潮霉素抗性基因编码区序列进行了优化，使其符合假丝酵母 菌的密码子系统（参见表1)。其中，优化前大肠杆菌hph基因的序列如序列表中序列11所 示，优化后的序列如序列表中序列12所示，再将该优化序列通过公司进行人工合成。
[0042] 表1 :假丝酵母属密码子使用频率表
[0043]
[0046] 实施例2 :潮霉素抗性筛选标记用于脂酰辅酶A合成酶基因的敲除
[0047] (1)基因敲除实验流程如图3所示
[0048] 引物ACS-hphF和ACS-hphR的5'末端为同源臂序列，对应于革巴位点的上游和下 游序列。这两个长引物的3'末端分别与质粒pUC-hph 1^中敲除模块（deletion cassette) 的上游和下游配对，即与潮霉素抗性基因的启动子5'末端和终止子3'末端分别配对。以 ACS-hphF和ACS-hphR为引物，质粒pUC-hph ea为模版，PCR扩增后得到的DNA片段，两头分 别带上下游同源臂，中间为潮霉素抗性筛选标记。PCR反应体系同实施例1中的步骤2，PCR 程序同实施例1中的步骤3。抗性筛选标记通过同源臂区域，能够宿主基因组发生双交换同 源重组，抗性基因从而得到表达，使得菌体能够在含潮霉素的培养基平板上生长，并形成菌 落。同时对抗性平板生长出来的菌落，进行纯化和验证。
[0049] 验证时，使用到一对检测引物ACS-U和ACS-D，分别与靶位点的上游和下游区域配 对。如果没有同源重组发生，通过这一对等位基因为模版扩增出来的片段在长度上是一样 的，在琼脂糖电泳中只能观察到一条带。如果其中一个等位基因由于双交换事件被抗性基 因片段替换了，那么经过扩增得到的片段长度就发生变化，在琼脂糖电泳中可以观察到两 条带。
[0050] 本实施例中引物设计的原则为：用于同源重组的同源臂区域和检测引物的设计都 选择在靶位点等位基因的序列比对中完全相同的区域，从而达到两个等位基因敲除和检测 具有同等的概率。
[0051] (2)PCR 扩增
[0052] 10X缓冲液 5 pl 质粒p.UC-hph (2 ng/u 1) 1 P 1 引物ACS-hphF (10 uM) 1 p 1 引物ACS-hphR (10 PM) 1 P.1 dNTP (10 mM) 1 p .l DNA聚合酶（5 U/p 1) 0. 25 p 1 超纯水_40. 75 P 1 jt- 50 u 1
[0053] DNA聚合酶是宝生物工程有限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的 Phusion DNA聚合酶，活性单位均为5U/ y 1 〇
[0054] PCR 程序为：
[0055] MX： 2min MX： 30s ' 56°C 30s - 30 个循环 72〇C 2.5rain - 72〇C 10m in
[0056] (3) DNA 纯化
[0057] 反应结束后，取5 y 1上述PCR样品进行琼脂糖电泳检测，证明扩增所得的DNA片 段大小与预计的一样，而且没有杂带，进行两步纯化和浓缩，为后面的转化准备DNA样品。
[0058] 第一步是利用PCR Cycle-Pure Kit纯化试剂盒（购自Omega公司），按照说明书进 行。一般是50 y 1体系，做4管，总体积共200 y 1，PCR纯化的最后一步用50或100 y 1 TE 缓冲液洗脱柱子。纯化后的DNA，用NanoDrop仪器测浓度，计算得到的DNA总量约为20 y g。
[0059] 第二步是将纯化的DNA再用乙醇/醋酸钠/糖原处理进行沉淀。具体做法是：往上 述溶在TE缓冲液的DNA溶液加入1 y 1糖原（20mg/ml)、100 y 1醋酸钠（3M，pH5. 2)和lml 预冷的无水乙醇；放置_80°C冰箱冷却30分钟；4度离心机，14000转/分的转速下，离心10 分钟，留沉淀；沉淀再用75%预冷的乙醇洗两遍；超净台里风干；4°C冰箱储存，电转之前重 悬在10 yl超纯水备用。
[0060] (4)感受态制备及电转
[0061] 从新鲜活化的平板上挑出发菌株（Candida Sp.DC12,参见《微生物学报》20(1): 88-93, 1980,正烷烃发酵生产长链混合二羧酸，可从中国科学院微生物研究所购买）的单 菌落于3ml液体YH)培养基中，30 °C摇床培养过夜，转速为220转/分钟；2 %转接于20ml YPD，30°C摇床培养，220转/分钟，至0D600达到1. 8 ;将菌液置于冰上静置15分钟，使其 停止生长，4000转/分钟，4°C离心3分钟，留菌体沉淀；用4ml预冷无菌水洗一次；4000转/ 分钟，4°C离心3分钟，留菌体沉淀；加入4mlTE/0. 1M LiOAc，150转/分钟，30°C的摇床内振 荡90分钟；加入0. lml 1MDTT，继续150转/分钟、30°C的摇床箱内振荡30分钟；4000转/ 分钟，4°C离心3分钟，留菌体沉淀；加入4ml预冷无菌水，洗3次；加入2ml 1M山梨醇，洗1 次，4000转/分钟，4°C离心3分钟；弃上清，加入120 y 1山梨醇将细胞悬起；取出40ul的细 胞悬液于1. 5ml离心管，加入5 y 1上述纯化后重悬在无菌水的PCR扩增产物（约10 y g)， 混匀，置于冰上5分钟；转入预冷的电转杯中，擦干电转杯，进行电转（电转条件为：2mm狭 缝的电转杯，电压为1800伏，电击时间为5毫秒）；电转后立刻加入lml山梨醇，混匀后吸出 放到1. 5ml的离心管中；4000转/分钟离心3分钟，弃上清，加入lml YH)培养基，37°C的 摇床内培养2小时；4000转/分钟离心3分钟，弃上清，加100 y 1 YPD重悬菌体，涂布YPD 固体平板（含300 y g/ml潮霉素），放到30°C培养箱内培养至单菌落出现。
[0062] (5)筛选抗性菌落
[0063] 上述抗性平板上长出的单菌落分别接种到lml YH)培养基的离心管中，加潮霉素 至终浓度为400 y g/ml，220转/分钟，30°C摇床培养。出现生长，说明带有抗性，证明抗性 基因已经整合到菌体基因组中并发挥作用，这部分菌落用于下一步验证。没有出现生长的 菌落，说明是假阳性，等同于出发菌株，停止处理。
[0064] (6)鉴定
[0065] 上面出现生长的抗性菌落，接种YH)液体培养基培养过夜，吸取500 y 1菌液，利用 宝生物工程有限公司的基因组提取试剂盒制备基因组DNA，具体操作按照试剂盒说明书进 行。以获得的基因组DNA为模版，ACS-U和ACS-D为引物进行PCR扩增，具体反应体系及反 应条件参照本实施例2的第2)条。如果靶位点上的等位基因没有被敲除，从两条等位染色 体上扩增出来的DNA片段大小一样，在琼脂糖电泳上表现为一条带。如果靶位点上其中一 个等位基因被敲除，从两条等位染色体上扩增出来的DNA片段大小不一样，在琼脂糖电泳 上表现为两条带（见图4)。鉴定为抗性阳性并且靶位点被敲除的菌株，再进一步经菌落纯 化和相同方法的鉴定，得到成功敲除靶位点基因的新菌株。本实施例证实了本发明提供的 潮霉素抗性在假丝酵母遗传操作系统中能够作为筛选标记应用，实现假丝酵母菌的基因工 程改造。
【主权项】
1. 一种潮霉素抗性基因，其特征是其编码区核苷酸序列如序列表的序列12所示。2. 根据权利要求1所述的潮霉素抗性基因，其特征是其符合假丝酵母属的密码子编码 系统。3. -种潮霉素抗性基因，其特征是其核苷酸序列如序列表的序列13所示。4. 如权利要求1或3所述的潮霉素抗性基因在假丝酵母菌基因工程改造中的应用。5. 根据权利要求4所述的潮霉素抗性基因在假丝酵母菌基因工程改造中的应用， 其特征在于在对假丝酵母菌基因工程改造中，对靶位点等位基因之一进行敲除；基因 敲除的靶位点为酯酰辅酶A合成酶基因，该基因的等位基因分别为如序列表14所示的 CandidaA00308 和序列表 15 所示的 Candida01833。
【文档编号】C12N15/54GK106032537SQ201510103245
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月10日
【发明人】张子娟, 赖小勤, 葛书华, 晏礼明, 杨勇, 陶勇, 傅深展
【申请人】中国科学院微生物研究所