关联玉米对斐济病毒属的抗性的基因座的制作方法

专利名称：关联玉米对斐济病毒属的抗性的基因座的制作方法
技术领域：
本公开涉及可用于在植物中产生或增强斐济病毒属(Fijivirus)抗性的组合物和方法，尤其是对马德里约柯托病毒(Mai de Rio Cuarto Virus)和/或玉米粗缩病毒(MaizeRough Dwarf Virus)的抗性。
背景技术：
由马德里约柯托病毒(MRCV)所引起的疾病是阿根廷的主要的玉米疾病，其在严重爆发年份中占超过70%的产量损失(Rodriguez PE等人，(1998) Plant Dis.82:149-52)。该疾病是斐济病毒属血清组2的成员，所述血清组2包括了其它病毒，诸如玉米粗缩病毒、水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarf virus)和马唐草矮化病毒(Uyeda I &Milne RG (1995) Semin.Virol.6:85-88)。MRCV 的主要媒介是科氏飞虱(Delphacodeskuscheli),但是其它飞風(Delphacodes)物种(诸如赫氏飞風(D.haywardi)和虎纹飞風(D.tigrinus))和黑边黄脊飞風(Toya propinqua)据显示也携带该病毒。该病毒并不表现出通过种子的子代传播。Dist6fano 等人，Arch.Virol.147:1699-1709 (2002)分析了 MRCV序列并提出其为与MRDV (玉米粗缩病毒)相关的新型斐济病毒。MRDV可见于多个欧洲国家(例如，捷克共和国、法国、意大利、挪威、西班牙、瑞典)和中国，而MRCV还在乌拉圭(OrnaghiJ.A., Beviacqua J.E., Aguirrezabala D.A., March G.J.和 Lenard0n S.L.1999.Detection of Mal de Rio Cuarto virus in Uruguay.Fitopatologia Brasileira24:471)被检测到。MRCV感染导致了异常的玉米发育并且显著降低了作物产量。易感表型包括矮化、节间缩短、多穗且散粒(multiple ears with scattered grain)、无花药的变形雄穗、叶背侧出现小耳突、减少的根部、截短且减少的叶。植物症状取决于该植物的生育期、植物基因型和环境(Lenard0n 等人，“Virus del Mal de Rio Cuarto en maiz，，，in Proyecto deInvestigaciones en Fitovirologia (Lenard0n 编辑)，2:10 (1999))。大多数严重症状发生于在胚芽鞘一初叶期受到感染时。在1996-1997年的严重MRCV爆发中，在阿根廷有超过300，000公顷的玉米受到影响，导致了总计约$1.20亿的损失。科氏飞虱在2006年的增多种群显然导致了阿根廷玉米植物中的病毒疾病的复发，这极大地影响了 2007年度的收成。易感基因型在流行地区(科尔多瓦省)受到MRCV的严重影响并在其它玉米产区受到中度影响。分子遗传标记 的开发辅助了对玉米的农业重要性状的标测和甄选，并且已经鉴定出了玉米中对马德里约柯托病毒抗性的QTL。玉米I号和8号染色体上的微卫星标记据发现关联于马德里约柯托病抗性的QTL (DiRenzo等人，(2004) J.AgriculturalSciencel42:289-295)并且在2号染色体上鉴定出产生玉米对斐济病毒抗性的另一种主要QTL (W02009/058335)。此外，在玉米中产生马德里约柯托病毒抗性的QTL被标测于I号染色体的短臂和长臂以及4号、8号和10号染色体(Kreff等人，(2006) Journal of Basicand Applied Geneticsl7:41-50)。通过使用与MRCV感染抗性相关联的分子标记进行选择具有下列优点:使得至少一些选择仅基于子代的遗传组合物进行。此外，MRCV感染抗性在植物生命周期非常早的阶段甚至早至种子期就可确定。使用与所述抗性性状相关联的分子标记可获得提高的选择率，这就意味着MRCV感染抗性的植物育种可更迅速地开展，从而在相对较短的时间内生成商业上可接受的抗性植物。因此，希望提供用于鉴定和选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的组合物和方法。可在育种程序中使用这些植物，以便产生具有MRCV感染抗性的高产杂交种。

发明内容
本发明提供了鉴定和选择对马德里约柯托病毒(MRCV)或相关斐济病毒属所导致的疾病具有增强抗性的玉米植物的组合物和方法。在一个实施例中，提供了鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法。在这些方法中，检测了至少一种标记等位基因的存在情况并且鉴定和/或选择了具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物。标记等位基因可包括与下列连锁并关联的任何标记等位基因:由下列组成的单倍型:相对于SEQ ID NO: 44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A” ；由下列组成的单倍型:相对于SEQ IDN0:42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A”;或由下列组成的单倍型:相对于SEQ ID N0:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”。在其它实施例中，所述标记等位基因可在单次减数分裂图上以30cM、25、20、15、
10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2 或 0.1cM 连锁:由下列组成的单倍型:相对于SEQ ID N0:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A”；由下列组成的单倍型:相对于SEQ ID NO: 42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A” ；或由下列组成的单倍型:相对于SEQ IDNO:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”。在另一个实施例中，提供了鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，其中检测了单倍型并且鉴定和/或选择了具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物。所述单倍型可包括:包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A” ;包含下列的单倍型:相对于SEQID N0:42，在位置85处的“A”、 在位置344处的“C”和在位置355处的“A”;或包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”;或上述单倍型的任何组合。在另一个实施例中，通过检测与玉米植物种质中的增强的MRCV感染抗性相关联的标记等位基因或单倍型来鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法。所述单倍型可在一个或多个标记基因座处包含等位基因，其中所述一个或多个标记基因座可见于4号染色体上的区间，所述区间包含并侧接:1.PHM1718 和 PHM8008 ;以及i1.PHM669 和 PHM8008。所述单倍型还可选自:包含下列的单倍型:相对于SEQ ID NO: 44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A”;包含下列的单倍型:相对于SEQ ID NO: 42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A”;包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A” ；或上述单倍型的任何组合。在另一个实施例中，获得了鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，其中在基因组中包含下列单倍型的玉米植物可与其它玉米植物杂交:包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A”;包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:42，在位置85的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A” ；包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”;或所述单倍型的任何组合；并且可针对所述一种或多种单倍型的存在或缺乏评价子代，由此而鉴定和/或选择了具有增强的MRCV感染抗性的子代植物。在另一个实施例中，提供了通过检测玉米植物基因组中的标记基因座来鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述检测使用标记基因座的序列、标记基因座的部分序列、或标记基因座的互补序列或其部分序列作为标记探针。标记探针在严格条件下与介于下列序列之间并包括下列序列的邻接DNA杂交:SEQ ID N0:71或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO: 71具有95%相同的核苷酸序列、以及SEQ ID NO: 50或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0:50具有95%相同的核苷酸序列，并且所述标记基因座包含至少一个关联所述增强的MRCV感染抗性的等位基因。在另一个实施例中，提供了通过检测玉米植物种质中至少一个关联增强的抗性的标记等位基因来鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法。所述标记基因座能够选自下列标记基因座中的任一个:PHM15741、PHM12093、PHM15051、PHM8091、PHM6248, PHM9452, PHM12615, PHM5713, PHM692U PHM1683 和 PHM17281 ;以及与这些标记连锁的任何其它标记。标记基因座还可见于5号染色体上的任何下列区间，所述区间包含并侧接:i.PHMl2615 和 PHM9452 ；ii.PHM12615 和 PHM17281 ；iii.PHM12615 和 PHM1683 ;以及iv.PHM15741 和 PHM9452。所述标记基因座包含至少一个关联增强的MRCV感染抗性的等位基因。在另一个实施例中，提供了通过检测玉米植物种质中关联增强的MRCV感染抗性的单倍型来鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法。所述单倍型在一个或多个标记基因座处包含等位基因，其中所述一个或多个标记基因座可见于5号染色体上的区间，所述区间包含并侧接:1.PHMl2615 和 PHM9452 ；i1.PHM12615 和 PHM17281 ；ii1.PHM12615 和 PHM1683 ;以及·iv.PHM15741 和 PHM9452。在另一个实施例中，提供了鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的植物的方法。在一个方面，获得具有标记基因座的至少一个等位基因的第一玉米植物，其中所述等位基因关联增强的抗性。所述标记基因座可见于5号染色体上的区间，所述区间包含并侧接:1.PHM12615 和 PHM9452 ;i1.PHM12615 和 PHM17281 ；ii1.PHM12615 和 PHM1683 ;以及iv.PHM15741 和 PHM9452。然后可将第一玉米植物与第二玉米植物杂交，并且针对所述第一玉米植物的等位基因可评价杂交所得子代植物。可选择具有第一玉米植物的等位基因的子代植物作为具有增强的MRCV感染抗性的植物。此外，通过上述方法鉴定或选择的玉米植物是受关注的，通过上述方法鉴定或选择的玉米植物的子代也是受关注的。附图和序列表说明根据下列的详细描述和附图以及序列表，可以更全面地理解本发明，下列的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。此序列表中以单个字母表示核苷酸，以三个字母表不氨基酸，如 Nucleic Acids Researchl3:3021-3030 (1985)和 BiochemicalJournal219 (N0.2):345-373 (1984)所描述的IUPAC-1UBMB标准中所规定，它们以引用方式全文并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循如37C.F.R.§ 1.822所示的规定。


图1示出了热带亚群内4号染色体上的显著性标记性状关联的峰。这些结果获自实例2中描述的对475个品系组的结构关联分析。图2示出了热带亚群内5号染色体上的显著性标记性状关联的峰。这些结果获自实例2中描述的对475个品系组的结构关联分析。图3示出了阿根廷自交系(Argentinean inbred)组的5号染色体上的显著性标记性状关联的峰(实例3)。图4示出了描述PHFHHxPHBNB种群中4号染色体上的MRCV抗性的QTL的图。图5示出了描述PHFHHxPHBNB种群中5号染色体上的MRCV抗性的QTL的图。图6示出了描述来源于双亲杂交PHFNHxPHKVl的F3种群中5号染色体上的MRCV抗性的QTL的图。SEQ ID NO:1 是 PHM1718 外部正向引物。SEQ ID NO:2 是 PHM1718 内部正向引物。SEQ ID NO:3 是 PHM1718 内部反向引物。
SEQ ID N0:4 是 PHM1718 外部反向引物。SEQ ID NO: 5 是 PHM669 外部正向引物。SEQ ID N0:6 是 PHM669 内部正向引物。SEQ ID N0:7 是 PHM669 内部反向引物。SEQ ID N0:8 是 PHM669 外部反向引物。SEQ ID NO:9 是 PHMl 1786 外部正向引物。
·
SEQ ID NO: 10 是 PHM11786 内部正向引物。SEQ ID NO: 11 是 PHM11786 内部反向引物。SEQ ID NO: 12 是 PHM11786 外部反向引物。SEQ ID NO: 13 是 PHM8008 外部正向引物。SEQ ID NO: 14 是 PHM8008 内部正向引物。SEQ ID NO: 15 是 PHM8008 内部反向引物。SEQ ID勵:16是卩腿8008外部反向引物。SEQ ID N0:17 是 PHM15741 外部正向引物。SEQ ID NO: 18 是 PHM15741 内部正向引物。SEQ ID NO: 19 是 PHM15741 内部反向引物。SEQ ID NO: 20 是 PHM15741 外部反向引物。SEQ ID NO:21 是 PHM12093 外部正向引物。SEQ ID NO: 22 是 PHM12093 内部正向引物。SEQ ID NO: 23 是 PHM12093 内部反向引物。SEQ ID NO: 24 是 PHM12093 外部反向引物。SEQ ID NO:25 是 PHM15051 外部正向引物。SEQ ID NO:26 是 PHMl5051 内部正向引物。SEQ ID NO:27 是 PHMl5051 内部反向引物。SEQ ID NO:28 是 PHM15051 外部反向引物。SEQ ID NO:29 是 PHM8091 外部正向引物。SEQ ID NO:30 是 PHM8091 内部正向引物。SEQ ID NO:31 是 PHM8091 内部反向引物。SEQ ID NO:32 是 PHM8091 外部反向引物。SEQ ID NO: 33 是 PHM6248 外部正向引物。SEQ ID NO:34 是 PHM6248 内部正向引物。SEQ ID NO:35 是 PHM6248 内部反向引物。SEQ ID N0:36 是 PHM6248 外部反向引物。SEQ ID N0:37 是 PHM9452 外部正向引物。SEQ ID NO:38 是 PHM9452 内部正向引物。SEQ ID NO:39 是 PHM9452 内部反向引物。SEQ ID N0:40 是 PHM9452 外部反向引物。SEQ ID NO:41 是 PHM1718 参考序列。SEQ ID NO:42 是 PHM669 参考序列。
SEQID NO:43 是 PHMl 1786 参考序列。SEQID NO:44 是 PHM8008 参考序列。SEQID NO:45 是 PHM15741 参考序列。SEQID NO:46 是 PHM12093 参考序列。SEQID N0:47 是 PHM15051 参考序列。SEQID NO:48 是 PHM8091 参考序列。SEQID NO:49 是 PHM6248 参考序列。SEQID NO: 50 是 PHM9452 参考序列。SEQID NO:51 是 PHM12615 外部正向引物。SEQID NO:52 是 PHM12615 内部正向引物。SEQID NO:53 是 PHM12615 内部反向引物。SEQID NO:54 是 PHM12615 外部反向引物。SEQID NO:55 是 PHM5713 外部正向引物。SEQID N0:56 是 PHM5713 内部正向引物。SEQID N0:57 是 PHM5713 内部反向引物。SEQID N0:58 是 PHM5713 外部反向引物。SEQID N0:59 是 PHM6921 外部正向引物。SEQID N0:60 是 PHM6921 内部正向引物。SEQID N0:61 是 PHM6921 内部反向引物。SEQID N0:62 是 PHM6921 外部反向引物。SEQID N0:63 是 PHM1683 外部正向引物。SEQID N0:64 是 PHM1683 内部正向引物。SEQID N0:65 是 PHM1683 内部反向引物。SEQID N0:66 是 PHM1683 外部反向引物。SEQID N0:67 是 PHM17281 外部正向引物。SEQID NO:68 是 PHMl7281 内部正向引物。SEQID NO:69 是 PHMl7281 内部反向引物。SEQID N0:70 是 PHM17281 外部反向引物。SEQID N0:71 是 PHM12615 参考序列。SEQID N0:72 是 PHM5713 参考序列。SEQID N0:73 是 PHM6921 参考序列。SEQID N0:74 是 PHM1683 参考序列。SEQID N0:75 是 PHM17281 参考序列。
具体实施例方式
通过使用标记辅助选择来鉴定和/或选择具有增强的马德里约柯托病毒(MRCV)抗性或对由该病毒导致的疾病或感染的抗性的玉米植物可提供有效并且环保的方法以用于克服这一疾病所导致的损失。本发明提供玉米标记基因座，所述玉米标记基因座显示了统计上显著的MRCV共分离。对这些基因座或另外的连锁基因座的检测可在标记辅助的玉米育种程序中使用来产生抗性植物，或对于MRCV或相关斐济病毒或由MRCV或相关斐济病毒导致的感染或疾病具有增强抗性的植物。提供下列定义以利于理解本发明。在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施例的限制，它当然能够改变。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施例，而不旨在进行限制。当在本说明书和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。因此，例如术语“一个植物”也包括多个植物；也取决于上下文，使用的术语“植物”也可包括该植物遗传相似或相同的子代；使·用的术语“核酸”实际上任选地包括该核酸分子的多个拷贝；同样地，术语“探针”任选地(并且通常)包括许多相似或相同的探针分子。除非另外说明，核酸是以5’到3’方向从左往右写。说明书中所述的数字范围包括限定范围的端值并且包括在限定范围内的各个整数或任何非整数的分数。除非另外指明，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员一般理解相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的测试实践，但本文描述了优选的材料和方法。在本发明的描述和权利要求中，将根据下文列陈述的定义使用下列术语。术语“等位基因”指在特定基因座处发生的两个或更多个不同核苷酸序列的其中一个。“等位基因频率”指等位基因存在于个体、品系、或一组品系中的基因座上的频率(比例或百分比)。例如，就等位基因“A”而言，基因型“AA”、“Aa”、或“aa”的二倍体个体分别具有1.0、0.5、或0.0的等位基因频率。人们能够通过平均化来自品系的个体样品的等位基因频率来估计该品系中的等位基因频率。同样地，人们能够通过平均化构成种群的品系的等位基因频率来计算该种群品系中的等位基因频率。就一组限定数目的个体或品系而言，可将所有等位基因频率表示为包含等位基因的个体或品系(或任何其它指定组)的计数。“扩增子”是被扩增的核酸，例如使用任何可用的扩增方法(例如PCR、LCR、转录等)通过扩增模板核酸制备的核酸。在核酸扩增的情况下术语“扩增”是其中产生附加拷贝的选择核酸(或其转录形式)的任何过程。一般的扩增方法包括基于多种聚合酶的复制方法，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶介导的方法如连接酶链反应(LCR)、以及基于RNA聚合酶的扩增(例如通过转录)方法。术语“装配”应用于BAC以及它们聚集以形成邻接DNA片段的倾向。BAC基于序列比对“装配”成重叠群，如果BAC进行测序，或经由它的BAC指纹与其它BAC指纹的比对“装配”成重叠群。可使用因特网上公开可用的Maize Genome Browser找到公开的装配。当等位基因是影响性状表达的DNA序列或等位基因的一部分或与之连锁时，所述等位基因“关联”所述性状。所述等位基因的存在是该性状将如何被表达的指征。“BAC”或细菌人工染色体是来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的天然存在的F因子的克隆载体，其本身是可作为环状质粒存在或可整合进入细菌染色体的DNA元件。BAC能够接受DNA序列的较大插入序列。在玉米中，各自包含来自玉米自交系B73的玉米基因组DNA的较大插入序列的大量BAC已经装配成为重叠群(重叠的邻接基因片段，或“邻接DNA”)，并且这一装配可公开获得于因特网。
BAC指纹是分析多个DNA样品之间的相似度的方法，其基于特定限制性位点的存在或缺乏而进行(限制性位点是由切割或“限制”DNA的酶所识别的核苷酸序列)而进行。使用相同的限制性酶组消化两种或更多种BAC样品并且比较所形成的片段的大小，这通常使用凝胶分离进行。“回交”指其中杂交子代反复与其中一个亲本回交的过程。在回交方案中，“供体”亲本是指具有用于进行掺入的所需基因、基因座或具体表型的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或多次)指将基因或基因座渗入其中的亲本植物。例如参见 Ragot, M.等人(1995) Marker-assisted backcrossing:a practical example,in Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques,第 72卷，第 45-56 页，以及 Openshaw 等人，(1994) Marker-assisted Selection in BackcrossBreeding, Analysis of Molecular Marker Data,第 41-43 页。初始杂交产生 Fl 代；然后术语“BC1”指轮回亲本的第二次使用，“BC2”指轮回亲本的第三次使用等等。厘摩(“CM”)是重组频率的量度单位。IcM等于经过单代杂交在一个基因座上的标记将与在第二基因座上的标记分离的1%的概率。如本文所用，术语“染色体区间”指位于植物单个染色体上的基因组DNA的邻接线性区域。位于单染色体间隔上的遗传因子或基因是物理上连锁的。不特别限定染色体区间的大小。在一些方面，位于单个染色体区间内的基因元件在遗传上连锁，遗传重组距离通常为例如小于或等于20cM，或小于或等于10cM。即，位于单个染色体区间内的两个基因元件以小于或等于20%或10%的频率进行重组。“染色体”是包含大量基因的单条螺旋DNA，所述基因在细胞分裂期间作为整体发挥作用并移动，并且因此可称为是连锁的。“染色体”也可称为“连锁群”。在本专利申请中，短语“紧密连锁”指两个连锁基因座间重组的发生频率为等于或小于约10% (即在基因图谱上的分离频率不超过10cM)。换句话说，紧密连锁的基因座至少90%的情况下共分离。当标记基因座显示与期望性状(例如病原体抗性)共分离(连锁)的显著概率时，它们在本发明中尤其有用。紧密连锁的基因座如标记基因座和第二基因座可显示10%或更低，优选约9%或更低，更优选约8%或更低，更优选约7%或更低，更优选约6%或更低，更优选约5%或更低,更优选约4%或更低,更优选约3%或更低,更优选约2%或更低的基因座内重组频率。在高度优选的实施例中，关联基因座显示约1%或更低的重组频率，例如约0.75%或更低，更优选约0.5%或更低，更优选约0.25%或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10% (例如约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%,0.5%、0.25%、或更低)的两个基因座也称为彼此“接近”。在某些情况下，两个不同标记能够具有相同的基因图谱坐标。在那种情况下，两个标记彼此足够接近使得它们之间的重组发生频率低至无法检测。术语“互补序列”指与给定核苷酸序列互补的核苷酸序列，即所述序列根据沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对原则而相关联。术语“邻接DNA”指未中断的基因组DNA片段，其由部分重叠的片段或重叠群表示。当涉及两个遗传因子 间的关系时，例如有助于抗性的遗传因子和邻近的标记，“相弓I”相连锁指示下述状态:其中在抗性基因座上的“有利”等位基因与相应连锁的标记基因座的“有利”等位基因物理上关联在相同染色体链上。在相引相中，两个有利等位基因被继承了该染色体链的子代一起继承。术语“受到杂交”或“杂交”是指有性杂交，并且涉及两组单倍体配子通过授粉进行的融合，从而产生二倍体子代(例如，细胞、种子或植株)。该术语包括一株植物被另一株植物授粉和自交(或自花授粉，例如当花粉和胚珠来自相同植株时)。本文称为“二倍体”的植物具有两组染色体(基因组)。短语“由马德里约柯托病毒所导致的疾病”或“由MRCV所导致的疾病”是指由MRCV或相关斐济病毒对植物的感染所导致的植物疾病。本文称为“双单倍体”的植物通过倍增单倍体染色体组进行开发(S卩，正常染色体数目的一半)。双单倍体植物具有两组相同的染色体，并且认为全部基因座是纯合的。“优良品系”是源自育种并选择优异农学性能的任何品系。玉米植物中对MRCV或由MRCV所导致的感染或疾病的“增强的抗性”指示在引入该疾病的诱发剂的情况下该玉米植物在产量和/或存活能力或其它相关农学指标上较少受影响。抗性是一个相对定义，指示被感染的植物比另一株同样处理的、更易感的植物玉米产量更高。即，与易感玉米植物相比，在抗性玉米植物中病害引起的玉米存活率和/或产量减少的程度较低。“外来玉米品种”或“外来玉米种质”是来源于不属于可利用优良玉米品系或品种的种质的玉米的品种或种质。在杂交发生在两个玉米植株或品种的种质之间的情况下，夕卜来种质的子代不与它杂交的优良种质密切相关。最常见的是外来种质不来源于任何已知的玉米优良品系，而是选择将新遗传因子(通常新等位基因)导入育种程序。“有利等位基因”是在特定基因座的等位基因，它赋予或有助于农学上所期望的表型，例如MRCV抗性，并允许对具有农学上所期望表型的植株的鉴定。标记的有利等位基因是与有利表型共分离的标记等位基因。“片段”旨在表示核苷酸序列的一部分。使用本文所公开的方法，片段可用作杂交探针或PCR引物。“基因图谱”是对给定物种中一个或多个染色体(或连锁群)上的基因座间的基因连锁关系的描述，一般以图表或表格形式描述。对于各个基因图谱，基因座之间的距离通过在种群中它们的等位基因在一起出现的频繁程度(它们的重组频率)而测量。可使用DNA或蛋白质标记或可观测的表型检测等位基因。基因图谱是作图的种群、使用的标记的类型、以及不同种群间各个标记的多态性潜力的产物。一个基因图谱与另一个基因图谱在基因座之间的遗传距离可以不同。然而，使用共同标记能够将一个图谱与另一个图谱的信息关联。本领域的普通技术人员可使用共同标记位点来鉴定在各个个体基因图谱上的标记位点和受关注的其它基因座。尽管由于，例如，在不同种群中检测替代性的复式基因座的标记、用于将标记定序的统计方法中的差异、新型突变或实验室误差而在标记顺序上经常存在细微变化，但是基因座的顺序在图谱间不应变化。“基因图谱位置”是在相同连锁群上，相对于围绕的遗传标记在基因图谱上的位置，其中能够在给定种群中发现指定标记。“基因作图”是限定基因座的连锁关系的方法，该方法通过使用遗传标记、标记的种群分离、以及重组频率 的标准遗传原则进行。“遗传标记”是种群中的多态核酸，并且其中可通过一种或多种分析方法检测并区分出它们的等位基因，例如RFLP、AFLP、同功酶、SNP、SSR等。该术语也指与基因组序列互补的核酸序列，如用作探针的核酸。对应于种群成员之间的遗传多态性的标记能够通过本领域已建立的方法进行检测。这些方法包括例如基于PCR的序列特异性扩增方法、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP )、或扩增片段长度多态性检测(AFLP )。已经建立的方法也已知用于检测表达序列标签(EST)和来源于EST序列的SSR标记以及随机扩增的多态性 DNA (RAPD)。“遗传重组频率”是两个基因座之间的交换事件(重组)的频率。在标记和/或减数分裂后性状的分离后可观察到重组频率。“基因组”指总DNA或整套基因，由染色体或染色体组携带。术语“基因型”是个体(或个体组)在一个或多个基因座上的基因组成。基因型由一个或多个已知基因座的等位基因限定，个体已经从其亲本中继承了所述基因座。术语基因型可被用于指个体在单个基因座·上的基因组成，在多个基因座上的基因组成，或更一般的，术语基因型可被用于指个体在其基因组中的所有基因的基因组成。“种质”是指遗传物质，其属于或来自于个体(例如，植株)、个体的组(例如，植物品系、品种或家族)或来自品系、品种或培养物的克隆，或某一物种或多个物种的全部个体(例如，玉米种质集合(maize germplasm collection)或 Andean 种质集合(Andean germplasmcollection))。种质可为生物或细胞的部分，或可从生物或细胞中分离得到。种质通常提供遗传物质与特异性分子构成，该分子构成提供生物或细胞培养物的一些或全部遗传性状的物理基础。如本文所用，种质包括可从中生长出新植物的细胞、种子或组织，或植物部分如叶、茎、花粉、或细胞，它们能够被培养成整个植株。称为“单倍体”的植物具有一组染色体(基因组)。“单倍型”是个体在多个基因座上的基因型，即等位基因组合。单倍型描述的基因座通常是物理上和遗传上连锁的，即在相同染色体片段上。术语“单倍型”可指位于特定基因座的等位基因或指沿染色体片段位于多个基因座上的等位基因。术语“异质”用于指明一组内的个体在一个或多个特定基因座上基因型不同。“杂种优势群”包含一组基因型，它们当与来自不同杂种优势群的基因型杂交时表现良好(Hallauer 等人(1998) Corn breeding,第 463-564 页，G.F.Sprague 和 J.ff.Dudley(编辑),Corn and corn improvement中)。将自交系归类为杂种优势群,并且将其进一步细分为杂种优势群内的家族，所述分类基于若干个标准如家谱、基于分子标记的关联、以及杂交体组合的性能(Smith等人(1990)，Theor.Appl.Gen.80:833_840)。美国两个最广泛使用的杂种优势群称为“爱荷华刚性莖杆合成群(1wa Stiff Stalk Synthetic)”(本文中也称为“刚性茎杆”)和“Lancaster”或“Lancaster Sure Crop”(有时称为NSS或非刚性茎杆)。假如一种以上的等位基因类型存在于给定基因座上(例如二倍体个体具有两个不同等位基因中的每一个的一个拷贝)，则该个体是“杂合的”。术语“同质”指一组成员在一个或多个特定基因座上具有相同基因型。假如个体在等位基因仅有一种类型的等位基因(例如二倍体个体在两个同源染色体中的每一个的基因座上具有一拷贝的相同等位基因)，则该个体是“纯合的”。术语“杂交体”指至少两个基因相异的亲本间杂交获得的子代。“杂交”或“核酸杂交”指互补RNA和DNA链配对以及互补DNA单链配对。术语“杂交”指核酸链的互补区域之间形成碱基对。“IBM基因图谱”可指任何下列图谱:IBM、IBM2、IBM2邻接、IBM2 FPC0507、IBM22004 邻接、IBM2 2005 邻接、IBM2 2005 邻接框、IBM2 2008 邻接、IBM2 2008 邻接框、或maizeGDB网站的最新版本。IBM基因图谱基于B73 XMol7种群，其中来自初始杂交的子代在构建重组自交系用于作图前随机交配产生多代。较新的版本反映了遗传的或BAC作图的基因座的添加，以及由于从其它遗传图谱或物理图谱、经过清理的数据或新算法的使用获得的信息的整合而提高的图谱精度。术语“自交”指已经进行育种以获得遗传同质性的品系。术语“插入缺失”是指插入或缺失，其中可指一个品系相对于第二品系具有插入的核苷酸或DNA片段，或可指所述第二品系相对所述第一品系具有缺失的核苷酸或DNA片段。术语“渗入”指基因座的期望等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如在特定基因座的期望等位基因通过渗入、经由相同物种的两个亲本间的有性杂交可被传递到至少一个子代，其中至少一个亲本在其基因组中具有期望的等位基因。作为另外一种选择，例如等位基因的传递能够通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合原生质体中，其中至少其中一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。所期望的等位基因可以，例如，根据关联于表型的标记在QTL、转基因等等中加以检测。在任何情况下，能够将包含期望等位基因的子代与具有期望遗传背景的品系反复回交并选择期望的等位基因以产生固定在选择遗传背景中的等位基因。当重复“基因渗入”过程两次或更多次时，该过程常被称为“回交”。 “品系”或“品种”是一组具有相同亲本的个体，它们一般是某种程度的自交体，并且一般在大多数基因座是纯合的和同质的(同基因的或接近同基因的)。“亚系”指子代的自交体亚群，它们与相同祖先来源的其它相似自交体亚群遗传上不同。如本文所用，术语“连锁”用于描述一种标记基因座与另一种标记基因座或其它一些基因座的相关联程度。分子标记和影响表型的基因座之间的连锁关系用“概率”或“调整概率”表示。连锁可以用期望的限度或范围表达。例如，在一些实施例中，当任何标记与任何其它标记在单次减数分裂图(基于已经进行一轮减数分裂的种群(例如，F2)的基因图谱；由多次减数分裂组成的IBM2谱图)上间隔低于50、40、30、25、20或15个作图单位(或cM)时，所述标记是连锁的(基因上或物理上)。在一些方面，限定加括号的连锁范围是有利的，例如介于10和20cM之间，介于10和30cM之间，或介于10和40cM之间。标记与第二基因座的连锁越紧密，标记对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”如标记基因座和第二基因座显示10%或更低，优选约9%或更低，更优选约8%或更低，更优选约7%或更低，更优选约6%或更低，更优选约5%或更低，更优选约4%或更低，更优选约3%或更低，更优选约2%或更低的基因座 内重组频率。在高度优选的实施例中，关联基因座显示约1%或更低的重组频率，例如约0.75%或更低，更优选约0.5%或更低，更优选约0.25%或更低的重组频率。位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10% (例如约 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%,0.5%、0.25%、或更低)的两个基因座也称为相互“邻近”。因为IcM是显示出1%的重组频率的两个标记之间的距离，因此任何标记与邻近的任何其它标记紧密连锁(基因上和物理上)，例如等于或小于IOcM的距离。在相同染色体上的两个紧密连锁的标记可相互定位为9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.75、0.5或0.25cM或更近。术语“连锁不平衡”指基因座或性状(或两者都有)非随机地分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以高于随机(即非随机)的频率一起分离。显示连锁不平衡的标记被认为是连锁的。连锁基因座在超过50%的情况下共分离，例如约51%至约100%的情况。换句话说，共分离的两个标记具有小于50% (并且根据定义，在相同连锁群上分离距离小于50cM)的重组频率。如本文所用，连锁可存在于两个标记或标记和影响表型的基因座之间。标记基因座可“关联”(连锁)性状。标记基因座和影响表型性状的基因座的连锁程度可以根据，例如，该分子标记与所述表型共分离的统计概率(例如，F统计或LOD评分)加以测量。连锁不平衡最常见地用量度r2测量，它使用Hill，ff.G.和Robertson，A, Theor.Appl.Genet.38:226-231 (1968)所描述的公式加以计算。当r2=l时，两个标记基因座间存在完全的LD，意味着所述标记还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。所述r2值应依赖于所使用的种群。r2值大于1/3显示了用于作图的足够强的LD (Ardlie等人，Nature Reviews Genetics3:299-309 (2002))。因此，当成对标记基因座间的r2值大于或等于0.33,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。如本文所用，“连锁平衡”描述其中两个标记独立地分离的情况，即，在子代中随机分离。认为显示连锁平衡的标记不连锁(无论它们是否位于相同染色体上)。“基因座”是染色体上的位点，例如，核苷酸、基因、序列或标记所处的位点。“优势对数(LOD)值”或“L0D 评分” (Risch, Science 255:803-804 (1992))用于基因区间作图以描述两个标记基因座之间的连锁程度。两个标记间LOD评分为三指示连锁概率比无连锁的概率高1000倍，而LOD评分为二指示连锁概率比无连锁的概率高100倍。大于或等于二的LOD评分可用于检测连锁。LOD评分还可用于在“数量性状基因座”作图中显示标记基因座和数量性状之间的关联强度。在这一情况下，LOD评分大小取决于所述标记基因与影响所述数量性状的基因座之间的接近度，以及所述数量性状效应的大小。“玉米”指玉米属(Zea mays L.ssp.mays)植株，也称为“玉蜀黍”。术语“玉米植物”包括整个玉米植株、玉米植物细胞、玉米植物原生质体、可从其中再生玉米植株的玉米植物细胞或玉米组织培养物、玉米植物愈伤组织、玉米植物丛生物和玉米植物中的完整玉米植物细胞或玉米植物部分，如玉米种子、玉米芯、玉米花、玉米子叶、玉米叶、玉米茎、玉米芽、玉米根、玉米根尖等。“标记”是发现基因或物理图谱上的位点或发现标记与性状基因座(影响性状的基因座)之间的连锁的手段。标记所检测的位点可通过检测多态性等位基因及其基因作图而获知，或通过对已经进行物理标测的序列进行杂交、序列匹配或扩增而获知。标记可以是DNA标记(检测DNA多态性)、蛋白质(检测所编码多肽的变异)或简单遗传表型(诸如‘腊质’表型)。可通过基因组核苷酸 序列或表达的核苷酸序列(例如，通过剪接的RNA或cDNA)开发DNA标记。根据DNA标记技术，所述标记由侧接所述基因座的互补引物或与该基因座处的多态性等位基因杂交的互补探针组成。DNA标记或基因标记还可用于描述该染色体自身上的基因、DNA序列或核苷酸(而非用于检测该基因或蛋白序列的组分)并且其通常在该DNA标记关联于人遗传学中的特定性状时使用(例如乳腺癌标记)。术语标记基因座是该标记所检测的基因座(基因、序列或核苷酸)。检测种群成员之间的遗传多态性的标记在本领域中是众所周知的。标记可由其所检测的多态性的类型以及用于检测所述多态性的标记技术所定义。标记类型包括但不限于:限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标记检测、随机扩增的多态性DNA (RAPD)、扩增片段长度多态性检测(AFLP)、简单重复序列检测(SSR)、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、或单核苷酸多态性检测(SNP)。SNP可通过，例如，通过DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增方法、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、动态等位基因特异性杂交(DASH)、分子信标·、微阵列杂交、寡核苷酸连接酶分析、Flap核酸内切酶、5’核酸内切酶、引物延伸、单链构象多态性(SSCP)或温度梯度凝胶电泳(TGGE)进行检测。DNA测序(诸如焦磷酸测序技术)具有能够检测组成单倍型的一系列连锁SNP等位基因的优点。单倍型倾向于比SNP更具信息性(检测更高水平的多态性)。“标记等位基因”或“标记基因座的等位基因”可以指种群中位于标记基因座的多个多态性核苷酸序列的其中一个。“标记辅助选择”(MAS)是基于标记基因型选择个体植物的方法。“标记辅助反选择”是一种通过它将标记基因型用于鉴定植物的方法，所述植物将不被选择，使得它们被从育种程序或种植中去除。“标记单倍型”是指在标记基因座的等位基因的组合。“标记基因座”是物种基因组中的特定染色体位点，其中可存在特定标记。“标记基因座”可用于追踪第二连锁基因座的存在情况，例如影响表型性状表达的连锁基因座。例如，标记基因座能够用于监控在遗传上或物理上连锁的基因座上的等位基因的分离。“标记探针”是可用于通过核酸杂交鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸分子探针。包含标记基因座的30个或更多邻接核苷酸(“所有或部分”标记基因座序列)的标记探针可用于核酸杂交。作为另外一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。如上所述，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标记”可用于指遗传标记，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。标记能够来源于基因组核苷酸序列或来源于表达的核苷酸序列(例如来源于剪接的RNA、cDNA等)，或来源于编码的多肽。该术语也指与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，如用作探针或能够扩增标记序列的引物对的核酸。“分子标记探针”是可用于鉴定标记基因座存在与否的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。作为另外一种选择，在某些方面分子探针指能够区别(即基因型)存在于标记基因座上的特定等位基因的任何类型的探针。当核酸在溶液中特异性杂交时，例如根据Watson-Crick碱基配对原则杂交,核酸是“互补的”。当位于插入缺失区域，例如本文所述的非共线区域时，本文所述的一些标记也称为杂交标记。这是因为，根据定义，插入区域是关于无插入的植株的多态性。因此，标记仅需要指明插入缺失区域是否存在。任何合适的标记检测技术都可用于鉴定此类杂交标记，例如SNP技术用于本文提供的实例。当等位基因与性状关联时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将不发生在包含等位基因的植物中的指示时，等位基因与性状“负”相关。“核苷酸序列”、“多核苷酸”、“核酸序列”、和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。“核苷酸”是构成DNA或RNA聚合物的单体单元，它由嘌呤或嘧啶碱基、戊糖、和磷酸基组成。核苷酸(通常以它们的5’ -单磷酸形式存在)可以用它们的单字母名称指代如下:“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任意核苷酸。术语“表型”、“表型性状”或“性状”可指基因或成系列基因的可观测表达。表型对于肉眼或本领域任何其它已知手段而言可以是可观测的，例如称重、计数、测量(长度、宽度、角度等)、显微法、生化分析或机电分析法。在某些情况下，表型可直接受控于单一基因或基因座，即，“单一基因性状”或“简单遗传性状”。在缺少大水平环境变化的情况下，单一基因性状在种群中分离，从而给出“性质”或“离散”分布，即，表型归于离散的类别。在其它情况下，表型是多种基因的结果并且可认为是“多基因性状”或“复合性状”。多基因性状在种群中分离以给出“数量”或“连续”分布，即，所述表型不能分离成为离散的类别。单一基因和多基因性状均可受到其表达所处的环境的影响，但是多基因性状倾向于具有更大的环境组分。基因组的“物理图谱”是显示染色体DNA上可辨认的界标(包括基因、标记等)的线性顺序的图谱。然而与基因图谱相比，界标间的距离是绝对的(例如以碱基对测量的或分离的或重叠的邻接基因片段)并且不基于基因重组(所述基因重组可在不同的种群中有所变化)。“植物”可为整个植株、其任何部分、或来源于植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可指代下列任何一种材料:整个植株、植物部分或器官(例如叶片、茎、根等)、植物组织、种子、植物细胞、和/或子代的相同材料。植物细胞是从植物中获得的细胞或来源于从植物中所获得细胞经培养出的细胞。“多态性”是在种群内2个或更多个体之间的DNA中的变异。多态性在种群中优选地具有至少1%的频率。可用的多态性可包括单核苷酸多态性(SNP)、简单重复序列(SSR)、或插入/缺失多态性，本文也称为“插入缺失”。当等位基因与性状连锁时，以及当存在的等位基因是期望的性状或性状形式将发生在包含等位基因的植株中的指示时，等位基因与性状“正”相关。“概率值”或“P-值”是表型的特定组合和特定标记等位基因的存在或不存在是否随机的统计学概率。因此，概率计分越低，基因座和表型相关联的可能性就越高。概率计分可受到第一基因座(通常是标记基因座)与影响该表型的基因座的邻近度以及表型效应的量级(由等位基因替换导致的表型变化)的影响。在某些方面，认为概率评分是“显著的”或“不显著的”。在一些实施例中，认为随机分离的概率评分为0.05(p=0.05，或5%的概率)是关联的显著性指示。然而， 可接受的概率可为小于50% (p=0.5)的任何概率。例如，显著概率可小于0.25、小于0.20、小于0.15、小于0.1、小于0.05、小于0.01、或小于0.001。“生产标记”或“生产SNP标记”是已经为高通量目的而开发的标记。生产SNP标记被开发用于检测特异性多态性，并且被设计用于多种化学反应和平台。本文所使用的标记名称，以前缀PHM表示“先导杂交标记(Pioneer Hybrid Marker)”,然后是针对其所被设计针对的序列的数字，之后是”或然后是针对DNA多态性的后缀。标记的版本也能够按照(A、B、C等)表示针对该特异性多态性的标记的版本的方式。术语“子代”指杂交产生的后代。“子代植物”是通过两个植物间的杂交所生成的植物。术语“数量性状基因座”或“QTL”指在至少一种遗传背景下(例如在至少一个育种种群中)，具有与数量表型性状的差异表达关联的DNA区域。QTL的区域涵盖了或紧密地连锁于影响所关注性状的基因。 “参考序列”·或“共有序列”是用作序列比对基准的定义序列。通过在该基因座对多个品系测序，在序列比对程序中比对核苷酸序列(例如Sequencher )并且随后获得所述比对的最具共同性的序列而获得PHM标记的参考序列。见于个体序列中的多态性标注于该共同序列中。参考序列通常并非任何个体DNA序列的精确复制，而是可用序列的混合体并且用于设计针对该序列内的多态性的引物和探针。在“相斥”相连锁中，在受关注基因座上的“有利”等位基因与在邻近的标记基因座上的“不利”等位基因物理上连锁，并且两个“有利”等位基因不被一起继承(即这两个基因座彼此“异相”)。技术人员应了解，玉米植物对MRCV的“抗性”相差很大，能够提供一系列抗性较高至抗性较低的表型，并且其根据感染的严重程度能够发生变化。然而，通过简单观察，技术人员可确定不同植物、植物品系或植物家族对MRCV的相对抗性或易感性，并且此外还应认识到“抗性”的表型渐差(示例性的计分系统在下文实例I中给出)。“顶交测试”是通过将各个体(例如，选择物、自交系、克隆或子代个体)与相同的花粉亲本或“测试物(tester)”(通常是纯合品系)杂交而实施的测试。短语“在严格条件下”指在该条件下探针或多核苷酸将与特定核酸序列杂交，杂交通常在核酸混合物中进行，但是基本上无其它序列。严格条件是序列依赖性的并将因不同的环境而异。较长序列具体地讲在较高温度下杂交。特定序列在限定离子强度、PH的情况下，严格条件通常选择比热解链温度(Tm)低约5-10°C。Tm是(在限定离子强度、pH和核酸浓度的情况下)50%与靶互补的探针平衡杂交到靶序列上(因为存在的靶序列过多，在Tm50%的探针被平衡占用)的温度。严格条件应为如下条件:在PH7.0至8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子，通常约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且对于短探针(例如10至50个核苷酸)温度为至少约30°C，而对于长探针(例如多于50个核苷酸)温度为至少约60°C。严格条件也可以通过加入诸如甲酰胺之类的去稳定剂来实现。就选择性杂交或特异性杂交而言，阳性信号是至少两倍于背景，优选10倍于背景杂交。示例性严格杂交条件通常为:50%的甲酰胺，5x SSCJP 1%SDS，在 42°C孵育，或 5x SSC，1%SDS，在 65°C孵育，并用 0.2x SSC 以及0.1%SDS在65°C洗涤。就PCR而言，约36°C的温度是典型的低严格扩增，而退火温度取决于引物长度可介于约32°C和48°C之间。决定杂交参数的附加准则在多个参考文献中提供。标记的“不利等位基因”是与不利植物表型共分离的标记等位基因，因此提供鉴定能从育种程序或栽培中移除的植物的有益效果。术语“产量”指具有商业价值的特定植物产品每单位面积的产量。例如玉米产量一般以每季每英亩种子蒲式耳数或每季每公顷种子公吨数来测量。产量受遗传和环境因素的影响。“农学”、“农学特性”、和“农学性能”指给定植物品种的性状(以及产生性状的遗传因子)，所述性状有助于经过生长期的产量。单个农学特性包括出苗活力、营养势、胁迫耐受性、病害抗性或耐受性、除草剂抗性、发生分枝、开花、结实率、种子大小、种子密度、抗倒伏性、脱粒率等等。因此产量是所有农学特性的最终结果。序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于LASERGENEa'生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison,
WI)的MEGALIGNfj程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins 和 Sharp, CABI OS.5:151-153 (1989))采用默认参数(GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY= 10)执行。使·用Clustal V方法进行逐对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为 KTUPLE=I, GAP PENALTY=3, WIND0W=5、以及 DIAGONALS SAVED=5。对于核酸，这些参数为 KTUPLE=2、GAP PENALTY=5、WIND0W=4、以及 DIAGONALS SAVED=4。用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算的。本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述:Sambrook, J., Fritsch, E.F.and Maniatis, T., Molecular Cloning:ALaboratory Manual ；Cold Spring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989(下文称为 “Sambrook”)。在详述本发明之前，应当了解本发明不受特定实施例的限制。也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定实施例，而不旨在进行限制。当在本文和所附权利要求中使用时，除非内容清楚地表明，单数和单数形式的术语包括复数指代。因此，例如术语“一个植物”也包括多个植物；取决于上下文，使用的术语“植物”也可包括该植物遗传相似或相同的子代；使用的术语“核酸”任选地包括该核酸分子的多个拷贝；现在来看实施例:对马德早.约柯托病毒(MRCV)所导致疾病的抗性马德里约柯托病毒(MRCV)所导致的疾病是由斐济病毒属物种导致的破坏性玉米疾病。与MRCV抗性相关联的分子标记和分子标记的等位基因的鉴定允许仅基于子代的遗传组成来选择抗性。本文提供了通过评价基因组成(根据使用分子标记及其等位基因进行的估测而进行)来鉴定和/或选择具有增强的MRCV抗性或对马德里约柯托病毒(MRCV)所导致的疾病或感染的抗性的玉米植物的方法。某闵作图已经认识到，在相当一些情况下可在生物体的基因组中标测与特定表型(诸如对马德里约柯托病毒(MRCV)所导致疾病的抗性)相关联的基因座。有利的是，植株育种人员可使用分子标记通过检测标记等位基因鉴定期望的个体，所述标记等位基因显示与期望表型共分离的统计意义上显著的概率，表现为连锁不平衡。通过鉴定与受关注的性状共分离的分子标记或分子标记簇，植株育种人员能够对合适的分子标记等位基因进行正选择(该过程称为标记辅助选择或MAS)从而迅速选择期望表型。
本领域中具有多种熟知的方法用于检测与所关注的性状(诸如对马德里约柯托病毒(MRCV)所导致疾病的抗性)共分离的分子标记或分子标记簇。这些方法的基本原理是检测具有显著不同平均表型的供选择基因型(或等位基因)的标记。因此，比较标记基因座之间的供选择基因型(或等位基因)之间的差异大小或差异显著性水平。推断性状基因位于最靠近一个或多个标记的位置，所述标记与基因型差异具有最大的关联性。两种用于检测所关注的性状基因座的此类方法是:1)基于种群的关联分析和2)传统的连锁分析。在基于种群的关联分析中，从具有多个创始者(例如优良育种品系)的已有种群中获得品系。基于种群的关联分析依靠连锁不平衡(LD)的弱化和下列观点:在非结构化的种群中，在如此多代随机交配之后，仅有控制受关注性状的基因和与这些基因紧密连锁的标记之间的关联将保存下来。实际上，大多数已有种群具有种群亚结构。因此，通过把个体分配到种群中，使用得自无规分布于基因组的标记的数据，采用结构关联方法有助于控制种群结构，从而最小化由于单个种群(也称为亚种群)内的种群结构带来的不平衡。表型值与在亚群中每个品系的每个标记基因座上基因型(等位基因)进行比较。显著的标记-性状关联指示标记基因座和涉及该性状表达的一个或多个基因座接近。传统的连锁分析使用相同的原则；然而，LD通过从少量创始者产生种群生成。选择创始者以最大化结构化种群内的多态性水平，并且评估多态性位点与给定表型的共分离水平。许多统计学方法已经用于鉴定显著的标记-性状关联。一种此类方法是区间作图方法(Lander和Botstein，Geneticsl21:185-199 (1989)，其中针对控制受关注性状的基因位于该位点的概率来测试沿基因图谱(IcM的区间)的许多位点中的每一个位点。基因型/表型数据用于计算每个测试位点的LOD评分(概率比率的对数)。当LOD评分大于阈值时，存在控制受关注性状的基因位点位于基因图谱上的该位点上的显著证据(它将位于两个特定标记基因座之间)。本发明提供了玉米标记基因座，根据传统的连锁分析测定，其显示了与对马德里约柯托病毒(MRCV)所导致疾病的抗性的统计上显著的共分离。这些基因座或附加连锁基因座的检测可用于标记辅助玉米育种程序，以产生具有增强的MRCV抗性的植物。标记纟目合物本文鉴定了与对马德里约柯托病毒(MRCV)所导致疾病的抗性相关联的标记。方法涉及检测玉米植物的种质中与增强的抗性相关联的一个或多个标记等位基因的存在。玉米植株可以是杂交体或自交体。对于在4号染色体上鉴定的QTL，标记基因座可选自表2中提供的任何标记基因座，包括PHM标记PHM1718、PHM669、PHM11786和PHM8008 ；以及与这些标记连锁的任何其它标记(连锁的标记能够从Maize⑶B资源确定)。对于在5号染色体上鉴定的QTL，标记基因座可选自表2和3中提供的任何标记基因座，包括 PHM 标记 PHM15741、PHM12093、PHM15051、PHM8091、PHM6248、PHM9452、PHM12615、PHM5713、PHM6921、PHM1683和PHM17281 ;以及与这些标记连锁的任何其它标记(连锁的标记能够从Maize⑶B资源确定)。QTL的物理图谱 位置基因元件或位于单个染色体上的基因组DNA的邻接线性片段上的基因是物理上连锁的。
在关联分析中发现PHM1718和PHM8008划定了 4号染色体上的MRCV抗性的QTL。PHM1718和PHM8008位置是基于PHB基因图谱，其如表I中的描述对标记排序。然而，来源于公开玉米品系B73的公开物理图谱表现出如下的顺序:PHM669、PHM1718、PHMl 1786和PHM8008。能与介于下列序列之间并包括所述序列的邻接DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与MRCV抗性性状相关联的标记基因座:SEQ ID N0:41(PHM1718的参考序列)或基于ClustalV比对方法与SEQ ID N0:41具有95%相同的核苷酸序列与SEQ ID NO:44 (PHM8008的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO: 44具有95%相同的核苷酸序列。此外，能与介于下列序列之间并包括所述序列的邻接DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与MRCV抗性性状相关联的标记基因座:SEQ ID NO:42 (PHM669的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO:42具有95%相同的核苷酸序列与SEQ ID NO:44 (PHM8008的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO: 44具有95%相同的核苷酸序列。在实施于475个品系组上的关联作图分析中发现，PHM12615和PHM17281划定了5号染色体上的MRCV抗性的QTL。PHM12615和PHM17281位置是基于PHB基因图谱，其如表2中的描述对标记排序。然而，来源于公开玉米品系B73的公开物理图谱表现出如下的顺序:PHM12615、PHM5713、PHM6921、PHM17281和PHM1683。能与介于下列序列之间并包括所述序列的邻接DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与MRCV抗性性状相关联的标记基因座:SEQ ID N0:71 (PHM12615的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0:71具有95%相同的核苷酸序列与SEQ ID NO: 75 (PHM17281的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO: 75具有95%相同的核苷酸序列。此外，能与介于下列序列之间并包括所述序列的邻接DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与MRCV抗性性状相关联的标记基因座:SEQ IDNO: 71 (PHM12615的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO: 71具有95%相同的核苷酸序列与SEQ ID NO:74 (PHM1683的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQID NO: 74具有95%相同的核苷酸序列。在实施于阿根廷自交系的组上的关联作图分析中发现，PHM15741和PHM9452划定了 5号染色体上的MRCV抗性的QTL。能与介于下列序列之间并包括所述序列的邻接DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与MRCV抗性性状相关联的标记基因座:SEQ ID NO:45 (PHMl5741的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0:45具有95%相同的核苷酸序列与SEQ ID NO:50(PHM9452的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0:50具有95%相同的核苷酸序列。5号染色体上涵盖一个或多个QTL的较大QTL区间以PHM12615和PHM9452为界。能与介于下列序列之间并包括所述序列的邻接DNA装配的任何多核苷酸可覆盖与MRCV抗性性状相关联的标记基因座:SEQ ID N0:71 (PHM12615的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID N0:71具有95%相同的核苷酸序列与SEQ ID NO:50 (PHM9452的参考序列)或基于Clustal V比对方法与SEQ ID NO: 50具有95%相同的核苷酸序列。连锁关系连锁的常见量度是性状共分离的频率。这可以共分离百分比(重组频率)表示，或以厘摩(CM)表示。CM是基因 重组频率的量度单位。IcM等于由于在一代中的交换导致的在一个基因座上的性状将与在另一个基因座上的性状分离的概率为1%(意味着性状99%的情况下共分离)。因为染色体距离与性状间交换事件的频率大约成比例，有与重组频率关联的近似物理距离。标记基因座本身是性状，并且在分离期间能够通过跟踪标记基因座、根据标准连锁分析进行评估。因此，IcM等于经过单代杂交的标记基因座将与在另一个基因座分离的1%的概率。标记距离控制受关注性状的基因越近，则标记作为期望性状的指示越有效和有利。紧密连锁的基因座显示约10%或更低，优选约9%或更低，更优选约8%或更低，更优选约7%或更低，更优选约6%或更低，更优选约5%或更低，更优选约4%或更低，更优选约3%或更低，更优选约2%或更低的基因座内交换频率。在高度优选的实施例中，相关基因座(例如标记基因座和靶基因·座)显示约1%或更低的重组频率,例如约0.75%或更低，更优选地约0.5%或更低，或更优选地约0.25%或更低的重组频率。因此，所述基因座分开距离为约10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0.75cM、0.5cM 或 0.25cM 或更低。换句话说，位于相同染色体上，并且它们间的距离使得两个基因座间的重组发生频率小于10% (例如约9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.75%,0.5%、0.25%、或更低)的两个基因座称为彼此“接近”。尽管特定的标记等位基因可与MRCV抗性共分离，重要的是注意所述标记基因座不一定引起所述MRCV抗性表型的表达。例如，该标记多核苷酸序列是产生增强的MRCV抗性或对MRCV所导致的疾病或感染的基因的一部分(例如，是基因开放阅读框的一部分)并非必需条件。特定标记等位基因与增强的MRCV抗性表型的关联，是由于在等位基因从中起源的祖先玉米品系中，标记等位基因和等位基因之间的最初“相引”相连锁。最后通过反复重组，标记和基因座间的交换事件能够改变这种取向。正是因为这个原因，有利标记等位基因可根据存在于耐受性亲本中的相连锁发生改变，所述耐受性亲本用于制备分离种群。这不改变可使用标记监控表型分离的事实。它仅仅改变在给定分离种群中认为哪个标记等位基因是有利的。对于4号染色体上的QTL，表I中列出的标记可用于推测玉米植物中MRCV抗性性状的状态。这包括处于 PHM 标记 PHM1718、PHM669、PHMl 1786 和 PHM8008 的 50cM、40cM、30cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0.75cM、0.5cM 或 0.25cM内的任何标记。对于5号染色体上的QTL，表2和3中列出的标记可用于推测玉米植物中MRCV抗性性状的状态。这包括处于 PHM 标记 PHMl5741、PHMl2093、PHMl5051、PHM8091、PHM6248、PHM9452、PHM12615、PHM5713、PHM6921、PHM1683 和 PHM17281 的 50cM、40cM、30cM、20cM、15cM、10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0.75cM、0.5cM 或 0.25cM 内的任何标记。染色体区间提供了与MRCV抗性关联的染色体区间。本领域熟知的多种方法可用于鉴定染色体区间。此类染色体区间的边界扩展到涵盖将与控制受关注性状的基因连锁的标记。换句话说，扩展染色体区间使得位于区间内的任何标记(包括限定区间边界的末端标记)可用作MRCV抗性标记。每个区间包含至少一个QTL，此外甚至可包含一个以上的QTL。相同区间中非常接近的多个QTL可搅乱特定标记与特定QTL的关联，因为一个标记可显示与一个以上的QTL连锁。相反地，例如如果非常接近的两个标记显示与期望表型性状共分离，有时分不清楚是否那些标记中的每一个鉴定相同QTL或两个不同的QTL。无论如何，完成或实施本发明不需要了解在特定区间中有多少QTL。下文描述的区间示出了与MRCV抗性共分离的标记簇。该簇标记发生在染色体上相对小的结构域内，并且指示那些染色体区域中的一个或多个QTL的存在。区间扩展到涵盖与MRCV抗性共分离的标记。区间被它们末端的标记限定，其中区间涵盖在区间内作图的标记以及限定末端的标记。通过限定区间端点的末端标记描述的区间将包括末端标记和位于该染色体结构域内的任何标记，无论这些标记目前是否已知。对于4号染色体上的QTL，区间可被如下标记限定并且包括它们:PHM1718与PHM8008,或PHM669和PHM8008。位于这些区间内的任何标记可作为MRCV抗性标记使用。对于5号染色体上的QTL，位于下列任何区间内的任何标记可作为MRCV抗性标记使用，所述区间由下列限定并且包括下列:i.PHMl2615 和 PHM9452 ；ii.PHM12615 和 PHM17281 ；iii.PHM12615 和 PHM1683 ;以及iv.PHM15741 和 PHM8452。染色体区间也可通过与QTL标记连锁(表现出连锁不平衡)的标记限定，r2是关联性研究中连锁不平衡(LD)的常见量度。如果，例如，位于PHM12615和PHM9452区间内的5号染色体标记基因座与另一个紧邻的5号染色体标记基因座之间的LD的r2值大于1/3(Ardlie 等人,Nature Reviews Genetics3:299-309 (2002)),则这两个基因座彼此连锁不平衡。标记等位基因和单倍型组合本发明的标记也可为一个或多个标记基因座上的等位基因的组合，其通常称为单倍型。下列4号染色体单倍型在本文中据显示连锁于对MRCV感染的增强抗性，并且可用于标记辅助的选择以选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物:a)包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A” ；b)包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A” ；和c)包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”。任何上述单倍型均可单独使用或组合使用来鉴定和选择具有增强的MRCV感染抗性的植物。技术人员将期望可能存在附加的多态性位点，所述位点位于本文鉴定的5号染色体和4号染色体标记内部的以及周围的标记基因座上，其中一个或多个多态性位点与单倍型的一个或多个多态性位点上的等位基因连锁不平衡(LD)。不同多态性位点上的两个特定等位基因，在其中一个位点上所述等位基因的存在倾向于推测在相同染色体上的另一位点上存在等位基因的情况下，所述等位基因被称为处于LD (Stevens, Mol.Diag.4:309-17(1999))。技术人员将理解等位基因频率(进而单倍型频率)可因种质库不同而不同。种质库由于成熟期差异、杂种优势群、地理分布等等而不同。因此，SNP和其它多态性可能在一些种质库中无法提供信息。标记辅助诜择分子标记可用于多种植株育种应用(如参见Staub等人(1996) Hortscience31:729-741 ;Tanksley (1983)Plant Molecular Biology Reporter.1:3-8)。受关注的主要领域之一是使用标记辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。展示出与影响期望表型性状的基因座连锁的分子标记提供了在植株种群中选择性状的有用工具。当表型难以测定(例如很多病害抗性性状)，或表型发生在植株发育的晚期(例如籽粒特征)时，尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的种群，增加了发现具有从供体·品系移动至受体品系的靶片段的重组体的概率。连锁越紧密，标记越有用，这是因为重组不太可能发生于标记和引起性状的基因之间，所述重组可导致假阳性。由于需要双重组事件，侧接标记减少了假阳性选择发生的概率。理想情况是基因本身具有标记，使得标记和基因之间的重组不能发生。此类标记称为“完美标记”。当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域(G印ts.(2002)Crop Sci ;42:1780-1790)。这称为“连锁累赘”。在供体植株与受体植株极不相关的情况下，这些侧接区域携带可编码农学上不良性状的附加基因。该“连锁累赘”也可导致产量减少或其它负面农学特性，即便与优良玉米品系回交多个周期后。这有时也称为“产量累赘”。侧接区域的大小可通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小(Young等人(1998) Genetics 120:579-585)。在经典育种中，通常只是单凭偶然因素选取有助于减小供体片段大小的重组(Tanksley等人(1989)Biotechnology7:257-264)。即使在此类回交次数达20次后，可预期找到的仍与所选基因连锁的供体染色体还是具有相当大的片段。然而如果使用标记的话，就可能选取那些在受关注的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植株中，至少一株植株经历交换有95%的概率，所述交换在基于单次减数分裂图距的IcM基因内进行。标记使得能够明确鉴定这些个体。对于300株植株的一次附加回交，在基因另一侧的IcM单次减数分裂图距内有95%的交换概率，从而产生在基于单次减数分裂图距小于2cM的靶基因附近的片段。用标记时在两代就可实现，而不用标记时则需要平均100代(参见Tanksley等人，同上)。当基因的确切位置已知时，围绕基因的侧接标记可用于在不同的种群大小中对重组进行正选择。例如，在更小的种群中，预期重组可进一步远离基因，因此需要更远端的侧接标记来检测重组。包含增强密度的公开玉米标记的玉米基因组整合连锁图谱的可用性促进了玉米基因作图和MAS。参见如IBM2Neighbors图谱，该图谱可在Maize⑶B网站上在线获得。具体实施MAS的关键是:(i)限定标记-性状的关联在其中将被测定的群体，其能够是分离群体、或随机的或结构化的群体；(ii)监测多态性标记相对于性状的分离或关联，并使用统计学方法确定连锁或关联；(iii)基于统计学分析的结果限定一组所期望的标记，和(iv)运用和/或外推该信息至当前的育种种质，以使得能够作出基于标记的选择决定。本公开中描述的标记，以及其它标记类型例如SSR和FLP，可用于标记辅助选择方案。
简单重复序列(SSR)能够被定义为相对少量的6bp或更短的DNA的串联重复(Tautz (1989)Nucleic Acid Researchl7:6463_6471 ;Wang 等人(1994)Theoretical andApplied Genetics,88:1_6)。多态性由于重复单元数量的变化而增加,这种变化很可能是由 DNA 复制过程中的滑移导致的(Levinson 和 Gutman (1987)Mol Biol Evol4:203_221)。重复长度的变化可通过在保守的非重复侧接区域设计PCR引物来检测(Weber和May(1989)Am J Hum Genet.44:388-396)。SSR非常适于作图和MAS，因为它们是多等位基因的、共显性的、可再现的，并且适合高通量自动化(Rafalski等人(1996)Generating and using DNAmarkers in plants, In:Non-mammaIian genomic analysis:a practical guide.Academicpress，第 75-135 页) 可生成各种类型的SSR标记，并且来自抗性品系的SSR特征图可通过扩增产物的凝胶电泳获得。标记基因型的评分基于扩增片段的大小。由位于Saint-Jean-sur-Richelieu, Quebec, Canada 的 DNA Landmarks 依据合同规定向公众提供玉米的SSR服务。也可生成各种类型的FLP标记。最常见地，扩增引物用于生成片段长度多态性。此类FLP标记在很多方面类似于SSR标记，不同的是由引物扩增的区域通常不是高度重复区域。通常由于插入或缺失，扩增区域或扩增子在种质间还具有足够的可变性，使得由扩增引物产生的片段能够在多态性个体中区分开，并且已知此类插入缺失常常发生于玉米中(Bhattramakki 等人(2002) Plant Mol Biol48, 539-547 ；Rafalski (2002b)，同上)。SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在所有分子标记类型当中，SNP是最多的，因此具有提供最高基因图谱分辨率的能力(Bhattramakki等人，2002，Plant MolecularBiology48:539-547)。SNP可在甚至比SSR更高的通量水平上进行检测，即以所谓的“超高通量”模式进行检测，因为它们不需要大量DNA，并且可直接进行自动化检测。SNP也具有成为相对低成本系统的前景。这三个因素一起使得SNP对在MAS中的应用具有高度吸引力。若干种方法可用于SNP基因分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶酶解、微测序和编码球。此类方法已经被下列文献叙述:Gut (2001) Hum Mutatl7,第475-492 页；Shi (2001) Clin Chem47，第 164-172 页；Kwok (2000) Pharmacogenomics 1，第 95-100 页；Bhattramakki 和 Rafalski (2001)Discovery and application of singlenucleotide polymorphism markers in plants, In:R.J.Henry 编辑，Plant Genotyping:The DNA Fingerprinting of Plants, CABI Publishing, Wallingford。多种可商购获得的技术利用这些方法和其它方法检查SNP,包括Masscode.TM.(Qiagen)、invadd' " (Third
Wave Technologies)和 Invader Plus > SnapShot (Applied Biosystems)> Taqman
(Applied Biosystems)和 BeadarrayS* (Illumina)。许多一起在单条序列内、或跨越连锁序列的SNP可用于描述任何特定基因型的单倍型(Ching 等人(2002) BMC Genet.3:19 ;Gupta 等人 2001 ；Rafalski (2002b) PlantScience 162:329-333)。单倍型可比单个的SNP提供更多信息，并且可描述较多的任何特定基因型。例如，单个 的SNP可以是具有增强的MRCV感染抗性的特定品系或品种的等位基因“T”，但是等位基因“T”也可发生在用于轮回亲本的玉米育种种群中。在这种情况下，单倍型例如在连锁SNP标记上的等位基因组合可提供较多的信息。一旦已经将唯一的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可用于种群或其任何亚群以确定是否个体具有特定基因。参见例如W02003054229。使用本领域普通技术人员已知的那些自动化高通量标记检测平台使得这一方法高效和有效。由于存在插入/缺失多态性，很多PHM标记可易于用作FLP标记来对4号和5号染色体上的基因座进行正选择。PHM标记的引物也可用于将这些标记转化为在相同区域内的SNP或其它结构上类似或功能上等同的标记(SSR、CAP、插入缺失等)。一种非常高效的SNP 转化方法描述于 Rafalski (2002a)Current opinion in plant biology5 (2):94-100以及Rafalski (2002b)Plant Sciencel62:329_333。使用PCR时，引物用于扩增来自个体(优选地自交体)的DNA片段，所述个体代表受关注种群的多样性。将PCR产物在一个或两个方向直接测序。比对所得的序列并且鉴定多态性。多态性不限于单核苷酸多态性(SNP)，还包括插入缺失、CAPS、SSR、和VNTR (可变数目串联重复)。具体地讲，针对本文所述的精细图谱信息，人们可易于使用本文提供的信息来获得在通过本公开列出的引物扩增的区域内的附加多态性SNP (和其它标记)。可将在所述图谱区域内的标记杂交到BAC或其它基因组文库，或与基因组序列电子比对，以便在与所述标记的基本近似的位置处查找新序列。除了如上所述的SSR、FLP和SNP以外，其它类型的分子标记也广泛使用，包括但不限于表达序列标签(EST)、来源于EST序列的SSR标记、随机扩增多态性DNA (RAPD)、和其它基于核酸的标记。在一些情况下，同功酶特征图和连锁的形态学特征也可间接用作标记。尽管它们不直接检测DNA差异，它们通常也受特定的遗传差异影响。然而，检测DNA变异的标记远远多于同功酶或形态学标记并且更具多态性(Tanksley (1983)Plant Molecular BiologyReporter 1:3_8)。序列比对或重叠群也可用于查找本文列出的特定标记的上游或下游序列。这些新序列靠近本文所述的标记，然后被用于发现和开发功能等同的标记。例如将不同的物理和/或基因图谱进行比对以定位等同标记，所述标记不在所述公开中描述，但是位于相似区域内。这些图谱可在玉米物种中，或甚至包括已经与玉米进行了遗传上或物理上的比对的其它物种，如大米、小麦、大麦或高粱。一般来讲，MAS使用的多态性标记是经鉴定具有与表型(诸如MRCV抗性)共分离的显著概率的多态性标记。推测此类标记在图谱上接近赋予植株MRCV抗性表型的一个或多个基因，并且认为此类标记是期望性状的指示，或是标记。测试植株是否在标记中存在期望的等位基因，并且期望在一个或多个基因座上包含期望基因型的植株将期望基因型与期望表型一起转移到它们的子代。因此，具有增强的MRCV感染抗性的植物可通过检测一种或多种标记等位基因进行选择，并且此外还可选择源于这些植物的子代植物。因此，获得了在给定的染色体区域中包含所期望的基因型(即，与增强的MRCV感染抗性关联的基因型)的植株并将其与另一植株进行杂交。随后可使用一种或多种标记对这一杂交的子代进行基因型评价并且随后应选择在给定染色体区域具有相同基因型的子代植物以作为具有增强的MRCV感染抗性。本文鉴定的标记可用于MAS中，以选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物。单倍型也可用于MAS中 ，以将增强的MRCV感染抗性引入易感玉米品系或品种。下列4号染色体单倍型可用于标记辅助选择，以对具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物进行选择:a)包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A” ；b)包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A” ；或c)包含下列的单倍型:相对于SEQ ID N0:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”。实魁提供下列实例以示·出受权利要求书保护的本发明，但本发明不受下列实例的限制。应当理解本文所述的实例和实施例仅用于例证性的目的，并且本领域的技术人员将认识到在不脱离本发明精神或所附权利要求范围的情况下可改变多种试剂或参数。实例1
表征对MRCV感染的反应玉米品系可根据其对MRCV感染的抗性或易感性程度进行表征。使用了从一到九的标度，其中“I”是指高度易感的植物而“9”是指高度抗性植物。在这类标度中，1-3的计分表示多数植物表现出严重的矮化、严重的节间缩短、不良的穗发育或无穗发育，或过早死亡；4_6的计分表示多数植物仅仅显示耳突和/或中度节间缩短，很少植物显示出严重的症状；并且7-9的计分显示了无症状或少量耳突的高度抗性植物。通常在具有天然感染的地点作出疾病计分。本实验中包括了对照或对MRCV感染具有为人熟知的反应的品系以标定任何具体地点的疾病压力。如果某一地点据信具有足够的疾病压力，则通常在开花后采集疾病计分。实例 2475个品系的组中的关联作图分析实施了关联作图策略来鉴定玉米中与MRCV抗性关联的标记。在该关联分析中，通过对4，000-10, 000个基因(基因座)进行DNA测序分析475个玉米品系的集合。所述品系包括优良种质、可商购获得的栽培变种、以及其它公开的品种。根据实例I中的描述对所述玉米品系进行表型分型。在本分析中使用了疾病计分的组合，这包括在2006年获自大田的计分和在多个地点和多个年份上收取的同意以历史记录。使用标准关联作图方法进行基于结构的关联分析，其中使用标记数据控制种群结构。使用由Pritchard等人开发的基于模型的集分析软件Structure以880个优良玉米自交系在两百种标记上的数据来估测混合系数(admixture coefficient)并且将所述自交系分成七个亚种系(J.K.Pritchard, M.Stephens 和 P.J.Donnelly (2000) “Inference ofpopulation structure using multilocus genotype data, ”Geneticsl55:945-959)。这降低了假阳性的发生概率，假阳性可能由对关联作图统计的群体结构效应引发。使用了用于检验两种分布是否相同的柯伊伯统计来针对给定亚种群中单倍型和表型之间的关联检验给定标记(W.H.Press, S.A.Teukolsky,ff.T.Vetterling, B.P.Flannery, 2002 !NumericalRecipes in C,第二版，Cambridge University Press, NY)。在热带亚种群的4号染色体上鉴定显著标记性状关联的峰(
图1)。基于模型的集分析软件Structure将80个品系分配为这一热带亚种群。与MRCV抗性表现出最显著性关联的标记是PHM8008 (P-值=9.4Χ1(Γ5)，其位于内源遗传图谱(PHB)上的136.03位置。此夕卜，另外三种标记也在该热带亚种群中显著地关联于MRCV抗性，P-值彡0.01。表I示出了显著关联于MRCV抗性的4号染色体标记，p-值< 0.01。复1所述热带亚种群中显著关联MRCV抗性的4号染色体标记，p-值< 0.0权利要求
1.鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，包括: a.在所述玉米植物中检测第一标记等位基因，所述第一标记等位基因连锁并关联: 1.由下列组成的单倍型:相对于SEQID NO:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A” ； i1.由下列组成的单倍型:相对于SEQID NO:42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A” ；或 ii1.由下列组成的单倍型:相对于SEQID NO:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”；以及 b.鉴定和/或选择所述玉米植物，所述玉米植物具有所述第一标记等位基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一标记等位基因在单次减数分裂图上以20cM 连锁 i)、ii)或 iii)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一标记等位基因在单次减数分裂图上以2cM 连锁 i)、ii)或 iii)。
4.鉴定和/或选择具有增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，包括: a.在所述玉米植物中检测: 1.包含下列的单倍 型:相对于SEQID N0:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A” ； i1.包含下列的单倍型:相对于SEQID NO:42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A”； ii1.包含下列的单倍型:相对于SEQID NO:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”；或 iv.1-1ii的任何组合；以及 b.鉴定和/或选择所述玉米植物，所述玉米植物具有(a)中1-1v的任何项。
5.鉴定和/或选择表现出增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测在一个或多个标记基因座处包含等位基因的单倍型，其中: a.所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接:1.PHM1718 和 PHM8008 ;或i1.PHM669 和 PHM8008 ;并且 b.所述单倍型关联增强的MRCV感染抗性。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述单倍型选自: a.包含下列的单倍型:相对于SEQID N0:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A” ； b.包含下列的单倍型:相对于SEQID NO:42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A”； c.包含下列的单倍型:相对于SEQID NO:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”；或d.a-c的任何组合。
7.鉴定和/或选择表现出增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括: a.获得第一玉米植物，所述第一玉米植物在其基因组内包含: i.包含下列的单倍型:相对于SEQID N0:44，在位置324处的“G”、在位置345处的“C”、在位置504处的“G”和在位置565处的“A” ； i1.包含下列的单倍型:相对于SEQID NO:42，在位置85处的“A”、在位置344处的“C”和在位置355处的“A”； ii1.包含下列的单倍型:相对于SEQID NO:43，在位置58处的“G”、在位置61处的插入、在位置70处的“C”、在位置85处的“C”、在位置90处的“T”、在位置194处的“G”和在位置287处的“A”； 或 iv.1-1ii的任何组合； b.将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交； c.针对(a)中1-1v的任何项评价子代植物；以及 d.鉴定和/或选择具有(a)中1-1v的任何项的子代植物。
8.鉴定和/或选择表现出增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在玉米植物中检测标记基因座,其中: a.将包含全部或部分所述标记基因座或其互补序列的标记探针在严格条件下与邻接DNA杂交，所述邻接DNA介于下列序列之间并包括下列序列:SEQ ID NO: 71或基于ClustalV比对方法与SEQ ID NO:71具有95%相同的核苷酸序列、以及SEQ ID NO: 50或基于ClustalV比对方法与SEQ ID NO: 50具有95%相同的核苷酸序列；并且 b.所述标记基因座包含至少一个关联所述增强的MRCV感染抗性的等位基因。
9.鉴定和/或选择表现出增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测标记基因座的等位基因,其中: a.所述标记基因座位于选自下列的染色体区间内: i.包含并侧接PHM12615和PHM9452的染色体区间； i1.包含并侧接PHM12615和PHM17281的染色体区间； ii1.包含并侧接PHM12615和PHM1683的染色体区间； iv.包含并侧接PHM15741和PHM9452的染色体区间；并且 b.所述等位基因关联增强的MRCV感染抗性。
10.鉴定和/或选择表现出增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括在所述玉米植物的种质中检测在一个或多个标记基因座处包含等位基因的单倍型，其中: a.所述一个或多个标记基因座位于染色体区间内，所述染色体区间包含并侧接PHM15741 和 PHM9452 ;并且 b.所述单倍型关联增强的MRCV感染抗性。
11.鉴定和/或选择表现出增强的MRCV感染抗性的玉米植物的方法，所述方法包括: a.获得第一玉米植物，所述第一玉米植物具有至少一个标记基因座的等位基因，其中所述标记基因座位于选自下列的染色体区间内: i.包含并侧接PHM12615和PHM9452的染色体区间； i1.包含并侧接PHM12615和PHM17281的染色体区间；ii1.包含并侧接PHM12615和PHM1683的染色体区间；和iv.包含并侧接PHM15741和PHM9452的染色体区间；并且此外其中所述等位基因关联增强的MRCV感染抗性；b.将所述第一玉米植物与第二玉米植物杂交；c.针对所述第一玉米植物的等位基因评价子代植物；以及d.鉴定和/或选择具有所述第一玉米植物的等位基因的子代植物。
12.通过权利要求1- 11的方法中的任何方法鉴定和/或选择的玉米植物。
全文摘要
本发明涉及鉴定和/或选择玉米植物的方法和组合物，所述玉米植物具有新产生的斐济病毒属抗性或增强的斐济病毒属抗性，或易感于斐济病毒属，尤其是马德里约柯托病毒(MRCV)和/或玉米粗缩病毒(MRDV)。所述方法使用分子遗传标记鉴定、选择和/或构建抗性植物或鉴定并反向选择易感植物。通过本发明的方法产生的表现出新产生的斐济病毒属抗性或增强的斐济病毒属抗性(或由该病毒所导致的感染或疾病)的玉米植物也是本发明的特征。
文档编号A01H1/04GK103220904SQ201180054738
公开日2013年7月24日 申请日期2011年11月10日 优先权日2010年11月17日
发明者A.托马斯, S.拉克, T.马丁, E.D.克雷夫 申请人:纳幕尔杜邦公司