专利名称：一种新的大蒜重金属抗性相关基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程和植物修复领域，具体地说，本发明涉及一种对重金属具抗性的基因即大蒜植物络合素合酶基因，以及含有该基因的对重金属具抗性的转化子，进一步涉及在培育用于清除环境重金属污染的工程植物，以及制备在食用部分低吸收重金属的新型安全农作物中的应用。
背景技术：
目前重金属污染已经危及全球生态环境以及人类健康。重金属的危害首先表现为对植物正常代谢活动的干扰，包括对细胞膜的损伤、对参与光合和呼吸代谢的大分子结构的破坏、氧化胁迫、核酸分子的降解等。受重金属污染的重要经济作物表现生长缓慢、产量下降。其次，通过食物链或者重金属污染的水源等途径进入人体内的重金属可以导致人类严重疾病，如日本的骨痛病便是因为长期食用被重金属污染的稻米和大豆所致。
目前国内外对重金属污染导致农作物减产和品质不良进而严重威胁人类健康的问题都非常重视，各国政府及科学家着力通过两个途径解决这一问题一为利用物理的、化学的方法试图清除土壤或水体的重金属污染，；二为利用现代生物技术清除污染，其中利用具有重金属超富集特性的植物清除污染是一种正在兴起的生物技术，称为植物修复。然而野生的具有吸收重金属能力的植物通常都生长缓慢，生物量小，难以直接利用，使得植物修复技术的发展受到了很大限制。解决这一问题的根本途径在于研究这类植物耐受重金属的分子生物学机制，克隆这类植物中重金属耐受的关键基因，通过基因工程手段获得可直接用于植物修复的转基因植物。但是目前从这些植物中克隆到的在重金属排拒、螯合或区室化过程中起重要作用的基因还很少。
植物对重金属的络合作用和区域化作用是有关重金属防御机制研究中资料最为丰富的。重金属离子与专一性的高亲和力配体结合后，会降低其在胞内的自由离子浓度，从而减轻其对植物的毒性。同时，植物会进一步将重金属加以区域化隔离，如将其富集于液泡中，以避免细胞中具有重要生物学功能的大分子结构受到金属离子的伤害。目前研究最多的重金属高亲和力配体为植物络合素(phytochelatin，PC)和金属硫蛋白(metallothionin，MT)。
植物络合素是一类富含巯基的多肽，可结合多种重金属离子。80年代，Grill等人发现蛇根木Rauvolfia serpentina悬浮培养细胞在200μM CdSO4胁迫下，产生结合重金属离子的复合物。他们采用Edman降解和γ-谷氨酰转移酶反应结合的方法，阐明了其一级结构为(NH3+)-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-γ-Glu-Cys-Gly-COO-。此后，从裂殖酵母Schizosaccharomycespombe中也分离得到一类可与镉(Cd)结合的多肽化合物，其一级结构为(γ-Glu-Cys)n-Gly，其中n＝2～3。迄今为止，人们已发现这类多肽存在于从酵母、藻类、苔藓、蕨类直到种子植物的多种生物体内。鉴于其在植物界的广泛分布，人们将这类化合物命名为植物络合素，通式为(γ-Glu-Cys)n-Gly，(n＝2～11)。在高等植物中，除了以Gly为C-末端氨基酸的PC分子之外，还存在以其它氨基酸为C-末端氨基酸的PC分子，这类分子常被称为异植物络合素(iso-Phyotchelatins)。Rauser将C-末端氨基酸不同的PC归为以下五种(1)(γ-Glu-Cys)n；(2)(γ-Glu-Cys)n-Glu；(3)(γ-Glu-Cys)n-Gly；(4)(γ-Glu-Cys)n-β-Ala；(5)(γ-Glu-Cys)n-Ser。
PC的合成是以GSH为前体的。植物细胞内合成GSH的酶系及相应的生化反应目前已研究得较清楚，这些酶主要分布于细胞质及质体中。首先，Glu与Cys由依赖ATP的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)催化合成二肽γ-Glu-Cys；然后，由依赖ATP的GSH合成酶催化将Gly转到γ-Glu-Cys上合成GSH。在阐明从GSH合成PC的生物合成途径时，Grill等首先在膀胱麦瓶草Silenecucubalus的细胞培养物中发现了一种酶，这种酶在体外特定的反应系统中可利用GSH先合成(γ-Glu-Cys)2-Gly，15分钟后产生(γ-Glu-Cys)3-Gly，继而是(γ-Glu-Cys)4-Gly。这种将GSH的半分子γ-Glu-Cys转移到另一个GSH分子上的酶被命名为γ-谷氨酰半胱氨酸二肽转肽酶，简称为PC合酶(phytochelatin synthase，PCS，E.C.2.3.2.15)。
PC合酶是PC合成途径的关键酶。自从Grill在膀胱麦瓶草中鉴定了PC合酶的活性之后，类似的酶活也在豌豆、西红柿、拟南芥、水稻中被发现。膀胱麦瓶草中的PCs合酶，分子量为Mw＝95KDa，等电点pI＝2.7；被Cd2+激活的PCs合酶呈25KDa亚单位四聚体形式，可在较宽的温度范围内保持活性，最适反应温度为35℃，最适pH值为7.9；其二聚体形式仍然保持合酶活性。它催化的反应可用Grill总结的反应式表示(γ-Glu-Cys)n-Gly+(γ-Glu-Cys)n-Gly→(γ-Glu-Cys)n+1-Gly+(γ-Glu-Cys)n-1-Gly其中，γ-Glu-Cys由GSH提供(对GSH，Km＝6.7mM)，当胞内GSH缺乏时，PC如(γ-Glu-Cys)2-Gly亦可提供该半分子，作为供体以合成更长链的PC。此酶只有在金属离子存在的条件下才表现活性。在体外实验中，Cd2+是最强的激活剂，其次有Ag+，Bi3+，Pb2+，Zn2+，Cu2+，Hg2+，AuCl4-等；而其它一些离子，如Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Fe3+，Al3+没有激活作用。
尽管Grill等在1989年就得到了PC合酶，但是直到1999年，才有三个研究小组分别从拟南芥、小麦和裂殖酵母中分离得到编码PC合酶的基因。拟南芥中PC合酶基因AtPCS1编码一个55-KD的多肽，含485个氨基酸残基。就N-端结构域的氨基酸序列而言，它与裂殖酵母中PC合酶SpPCS在此序列区的同源性达45％；C-端结构域的序列同源性较低。但两者在C-端结构域都有多个Cys残基(拟南芥中为10个，裂殖酵母中为7个)，并分别有4个和6个Cys残基成对存在。这些Cys残基在位置上并不保守。小麦中TaPCS与拟南芥AtPCS全序列同源性有55％，其中TaPCS有14个Cys(在C-端结构域形成2个Cys残基对)。早期的研究表明，PC合酶基因的表达是组成型的，也就是说在PC生物合成的调控机制中可能不存在PC基因转录水平的调节。如AtPCS1的表达产物的Northern Blot和RT-PCR分析表明其mRNA水平在Cd2+处理前后无明显变化。然而，小麦根中TaPCS1的mRNA水平会因Cd2+的处理而上升。而在翻译后的蛋白质水平上，PC合酶的激活特性却可调节胞内PC的合成。
然而，迄今为止PC合酶基因在植物对重金属抗性中究竟起什么作用仍不清楚，也没有从重金属耐受或超富集植物中克隆到PC合酶基因的报道。大蒜富含巯基化合物，如大蒜素等，大蒜的根、鳞茎、叶片均可超量累积重金属，那么在大蒜对重金属的抗性中哪些基因起关键作用？PCs合酶基因的表达产物在大蒜富含巯基化合物的合成及大蒜对重金属的富集中是否起重要作用？发明内容本发明的目的在于从重金属超富集植物中克隆重金属抗性基因，即从对重金属具抗性的大蒜中克隆了重金属抗性基因。
本发明的另一个目的在于制备用于清除环境重金属污染的转化体，进一步培育高耐受低吸收重金属的新型农作物。
发明详述本发明克隆了一种新的植物络合素合酶基因，尤其是一种大蒜重金属抗性相关基因大蒜PC合酶基因。
本发明也包括含有大蒜重金属抗性相关基因的重组载体，尤其是涉及含有大蒜重金属抗性相关基因的酵母穿梭表达载体pFL61-AsPCS。
本发明还在真核细胞中表达了大蒜PC合酶基因，获得了抗不同种类和不同浓度的重金属的转化宿主细胞。尤其是转化的酵母菌株。
本发明进一步包括大蒜PC合酶基因的编码产物。
发明效果本发明从一种对重金属高度抗性的植物材料中克隆了植物络合素合酶的全长cDNA，并对其结构特性和在重金属的抗性中的功能进行了分析。结构特性分析表明，PC合酶基因所编码的氨基酸序列中氨基端有7个完全保守的Cys残基和4个完全保守的His残基，而不是原来报道的5个Cys和1个His；而且在羧基端也有4个完全保守的Cys残基，以前的报道认为羧基端不保守是由于已克隆的PC合酶基因甚少所致。与拟南芥、小麦、印度荠菜不同的是，大蒜氨基端第47位为Cys残基而非Tyr，而且在保守区内大蒜有17个氨基酸残基与已报道的不同，表明这是一个新的序列。以酵母功能互补实验证明该cDNA在酵母中的表达可以使对重金属敏感的酵母菌株耐受一定浓度的重金属，其中对砷的抗性提高此前未见报道。
本发明在以下两方面将产生有益效果将该cDNA置于植物强启动子调控之下，转入生长速度快、生物量大、适生性强的植物，培育用于清除环境重金属污染的工程植物；将该cDNA的反义序列置于主要农作物的种子特异性表达启动子的调控下，转化主要农作物，在食用部分低吸收重金属的新型安全农作物。
附图1为大蒜植物络合素合酶cDNA(AsPCS)的全序列；附图2为AsPCS表达产物的氨基酸序列；附图3A为表达AsPCS的酵母转化株ABDE-1/AsPCS与对照在含10μM Cd2+YPD液体培养基中生长曲线；附图3B为表达AsPCS的酵母转化株FD236-6A/AsPCS与对照在含200μM As3+YPD液体培养基中生长曲线。
具体实施例方式
实施例一大蒜PC合酶基因(phytochelatin synthasegene of Allium sativum，AsPCS)全序列的克隆〖一〗RNA的提取取l00mg大蒜根和叶，利用Trizol(Gibcol)提取其总RNA。
〖二〗cDNA的合成取1μl总RNA，按照SMARTTMcDNA Library ConstructionKit(Clontech)合成cDNA。
〖三〗大蒜PC合酶基因片段的克隆根据拟南介、酵母、线虫的PC合酶基因(AtPCS1，CePCS，SpPCS)的保守序列设计一对简并引物，并以大蒜的cDNA为模板进行了PCR扩增，得到一条350bp左右大小的条带。将所得条带进行回收、纯化(鼎国DNA回收试剂盒)，并测序。
〖四〗AsPCS 5’RACE根据得到的PCS片段的序列，以及大蒜cDNA5’端特有的引物序列(SMART III5’Primer)，在所得的序列靠近5’端的序列区设计合成了一条可以与SMART III配合使用的GSP(GeneSpecific Primer)，分别为GSP15’CAGTTCCAGTCTGACCGAAAGC3’以SMART III/GSP1为引物，以大蒜的cDNA为模板，按照SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit进行5’-RACE，得到一条600bp大小的条带并克隆到pGEM-T(购自Promega公司)载体上进行测序。根据测得的序列，再设计另一条靠近SMARTIII的引物GSP25’ATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT 3’以GSP2/CDSIII为引物，以大蒜的cDNA为模板，进行长距离PCR(LD PCR)，得到1.8kb大小的条带并克隆到pGEM-T(购自Promega公司)载体中。
〖五〗AsPCS的序列分析测序结果表明这一1868bp的cDNA AsPCS为一全长cDNA(见附图1)。其中开读框架为1521bp，编码507个氨基酸(见附图2)；5’端非翻译区98bp，3’终止区249bp含24个polyA。其编码的氨基酸序列与已知的其他物种的PCS cDNA具有较高的同源性。根据PSORT分析，其表达产物很可能定位在细胞质中，并且自身未发现信号肽。
〖六〗大蒜、绊根草、小麦、拟南芥和印度芥菜PC合酶基因产物的氨基酸同源性比较通过blastp比较发现PC合酶基因在单、双子叶植物之间不仅氨基端的序列有较高的保守性，羧基端同样有较高的保守性。这在以前的文献中没有报道。其中同为禾本科植物的绊根草和小麦之间的同源性最高，同为十字花科植物的拟南芥和印度芥菜之间的同源性也很高，而属单子叶植物百合科的大蒜介于绊根草、小麦与拟南芥、印度芥菜之间。与前人之报道不同的是，这五种植物的PC合酶氨基酸序列中氨基端有7个完全保守的Cys残基和4个完全保守的His残基，而不是原来报道的5个Cys和1个His，而且在羧基端也有4个完全保守的Cys残基。此外与拟南芥、小麦、印度荠菜不同的是，大蒜氨基端第47位为Cys残基而非Tyr，而且在保守区内大蒜有17个氨基酸残基与已报道的不同，表明这是一个新的序列。
实施例二大蒜PC合酶基因的功能分析本实施例中利用酵母转化实验分析大蒜PC合酶基因(AsPCS)的功能。
〖一〗酵母表达载体的构建设计以下一对引物，在AsPCS两端引入BstXI的酶切位点。
PAsPCSbst15’CCAGTGTGCTGGATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT 3’PAsPCSbst25’AGCCAGTGTGATGGATGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 3’以大蒜的cDNA为模板进行PCR。分别将PCR产物和酵母穿梭表达载体pFL61(M.Minet，M-E.Dufour and F.Lacroute.Complementation of Saccharomyces cerevisiae auxotrophicmutants by Arabidopsis thaliana cDNAs.Plant J.，1992.2417-422.)，用BstXI进行酶切，并将酶切产物回收、连接，并转化大肠杆菌DH5α。经鉴定，得到了与pFL61中的启动子正向(pFL61-AsPCS+)和反向(pFL61-AsPCS-)连接的两种重组子。
〖二〗酵母的转化1.按照Gietz和Schiestl(1995 Methods in Molecular andCelluar Biology 5255-269)的方法对酿酒酵母突变菌株〖Saccharomyces cerevisiae〗ABDE-1(cuplΔmutant，对铜、镉等重金属敏感)[(arg4-8，leu2-112，his7-2，trp1-289，ade5 andcupΔ1)参见J.Zhou，P.B.Goldsbrough，Functional homologs offungal metallothionein genes from Arabidopsis，Plant Cell6(1994)875-884.]和裂殖酵母〖Schizosaccharomyces pombes〗FD236-6A(对砷敏感)[(MATa ura3-52，trp163，leu21，his3200acr3-1∷URA3，GAL2)参见R.Wysocki，P.Bobrowicz and S.Uaszewski.The Saccharomyces cerevisiae ACR3 gene encodes aputative membrane protein involved in arsenite transport.J.Biol.Chem.，1997.27230061-30066]的转化，对照组用水代替质粒进行转化。
〖三〗转化子的筛选制备含不同重金属浓度的1/2 YPD平板，以对照组的酵母菌株涂板，30℃培养72小时，测定其重金属胁迫下的生长临界浓度，得到ABDE-1对Cd2+生长临界浓度为10μM，而FD236-6A对As3+的生长临界浓度为200μM。将转化的酵母菌株ABDE-1涂布于含10μM的Cd2+的1/2 YPD平板，转化的酵母菌株FD236-6A涂布于含200μM的As3+的1/2 YPD平板，培养72小时，挑选长出的单菌落。
〖四〗转化子对重金属抗性的测定挑选转化后的ABDE-1于含5μM Cd2+的YPD液体培养基中，30℃，200rpm培养过夜至OD600＝0.5，取10μl分别加入Cd2+浓度为0μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM的YPD培养基(各20ml)，30℃，200rpm培养24小时或48小时，分别测定它们的OD600。同样的方法测定转化子在Cd2+浓度为10μM的YPD培养基的生长曲线(每6小时测定一次OD600)。转化后的FD236-6A的对As3+敏感度的测定方法同上。
实验结果表明，表达大蒜植物络合素合酶基因的ABDE-1在含20μM Cd2+的YPD液体培养条件下可以正常生长，而对照在5μM Cd2+的时便完全不能生长(见附图3)；AsPCS的表达还提高了FD236-6A对砷的抗性，这在前人的研究中未见报道。进一步在含不同种类和不同浓度重金属的培养基中进行平板培养证实了上述结果。这些研究结果表明，大蒜植物络合素合酶基因在大蒜对重金属铜、镉和砷的防御中有重要功能。
实施例三 用RT-PCR分析AsPCS的表达〖一〗材料的处理取生长一周的大蒜幼苗，以5mM的Cd2+处理，分别于处理0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时后取根尖及茎尖，置于-70℃保存。同法取以0mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM的Cd2+处理6小时后的大蒜的根尖及茎尖。
〖二〗RNA的提取及eDNA的合成按照前述方法分别提取各种处理材料的RNA，根据PCR mRNAselective kit(TAKALA)合成cDNA的第一链。
〖三〗大蒜Tublin基因片段的克隆根据小麦等禾本科植物Tublin基因的保守区设计一对简并引物，以大蒜的cDNA为模板，进行PCR扩增，得到一条600bp左右大小的条带，经过回收、连接、测序、比较，证明它与禾本科其他植物的Tublin基因具有较高的同源性，是大蒜的Tublin基因片段。因为Tublin基因的表达比较稳定，不因外界环境刺激或组织不同而变化，因此是很好的RT-PCR的内参。
〖四〗AsPCS的表达分析根据AsPCS的序列，设计一对特异引物
PAsPCSrt3 5’ATGGCGCTTGCGGGACTTTATCGT 3’PAsPCSrt4 5’CAGTTCCAGTCTGACCGAAAG 3’以不同处理的cDNA为模板，按以下程序进行28个循环的PCR扩增90℃40秒；54℃50秒；72℃50秒；取等量的PCR产物进行电泳，扫描，利用BiolD对各个泳道的条带进行积分。同法测定对应的Tublin基因表达量，并将两者进行比较，得到不同处理的AsPCS的表达差异。
结果表明，在镉的诱导下，大蒜根部和茎部的PC合酶基因的表达均有所提高。在根部，其最大表达量出现在处理后仅1小时，说明大蒜对重金属的胁迫能很快做出反应。PC合酶基因表达量的提高，是引起植物络合素合成量提高的一个重要原因，所以该基因的表达量的提高暗示植物体内植物络合素含量的提高。大蒜茎部PC合酶基因的表达量的最大值出现在处理后6小时，可能是与植物体内重金属离子的运输需一定的时间有关。通过对相同处理时间内的根部与茎部的PC合酶基因的表达量的比较，发现根部植物络合素合酶基因的表达量高于茎部，说明植物络合素对重金属作用的主要场所可能在根部。
序列表<110>中国科学院植物研究所<120>一种新的大蒜重金属抗性相关基因及其应用<130>1234<160>2<170>Patent In version 3.1<210>1<211>1868<212>DNA<213>大蒜(Allium sativum)<400>1ggccattatg gccggggatc tcagcttcaa taagatagat cacttttcag gccctcaaaa60tttgaaaaac acccaattac ttcctcattt ccacttaaat ggcgcttgcg ggactttatc120gtcgagttct cccgtcaccc ccggccgtcg agtttgcctc gactgaggga aagaaacttt180tcgctgaagc tctacaaaat ggtacgatgg aaggattttt taagttaatt tcctgcttcc240agactcagtc tgaacctgct tattgtggtc tggctagtct atctatggtg ttaaatgccc300ttgcaattga tccaggaaga aagtggaaag gcccttggag atggttcgac gagtcaatgt360tagattgttg cgaacctttg gaaaaagtca aagaagaagg aatcacattt gggaaagttg420catgcttggc ccattgtgcc ggtgctaatg ttcaagctat tcgtacaagc caaggcagtc480ttgaggattt ccgccagcat attatcagat gcacttcttc tgatgattgc catgtgatca540catcgtacaa ccgaaaagct ttcggtcaga ctggaactgg acatttttca ccaattggtg600gttatcacaa aggaagtgat atggcactca ttttagacac tgcacgtttc aaatatcctc660ctcattgggt cccacttcaa cttctttggg aggctatgaa gtatgaagat cctgctaccg720gatatcctag gggattcatg cttatatcaa agcttcagag agcgccatct cttctttaca780ccctgagctg cagacacgag agctgggttc aaaccgcaaa gtacttgatg gatgatgtcc840ctattcttct gaaaaaggca aatttaaaca cagtacaaga tgtactctct cttattttca900aatctctcct ttccaatgct ggggatttta ttaaatgggt tgcagaagtt agaagaccag960aagaaaattc agctttaagc aaagaagaga aggagagact tgcgattaag gaaatcgtac 1020tgcaacaaat tcgtgaaacc aaactgtata agtatgtgtc ggaatggctg tctgatatgc 1080ggtcgtgttg ctgcaacgca tcagctttca gtggaaaaga ttcattaact gatattgcgg 1140ccagtgtatg ttgccagggt gctttattgt tggctggaaa tttaggtagg gacaataaat 1200catgccttaa agaaacatgc gttaacaatg tgaaatccaa tggaggtggc cccataactg 1260tagtgtcagg tactgtagtt tcagagggtg gtgagcaagg ggttgatatg ttggtaccca 1320catcgccatc aaaatcacat ggttgcaatg caggttcttc ttctttctgt gctatagctc 1380acccgggaca tggtgacgta ttaactattc tttcactagc cttgtttacc aactcttggt 1440tcgatatcag caataagaag ctgcttgatg aaattcgtgc tctagtttca tttcagaatc 1500ttcccgatgt acttcaggag gaggttctac acctgcgcag gcaactaatg tttctgaaga 1560aatgcaaaga caaagaggtc gacggggacg ttttattgcc ttccatttcc atggtgtaat 1620tgatatgata tcaaaattca catacttact aagagaatgt tcgctgttgc taatttgttg 1680tatacctgct tactagtgaa agcggtatca tatggatgtg tattgtccat tttggaattc 1740agttctgaat aaacggtgag cctgacgcaa gcttgcaatt tgactttgaa tataacgtgc 1800cttgaacaat gaatcttagt agcaaattgt tagttttcgt ctccaaaaaa aaaaaaaaaa 1860aaaaaaaa 1868<210>2<211>506<212>PRT<213>大蒜(Allium sativum)<400>2Met Ala Leu Ala Gly Leu Tyr Arg Arg Val Leu Pro Ser Pro Pro Ala1 5 10 15Val Gl u Phe Ala Ser Thr Glu Gly Lys Lys Leu Phe Ala Glu Ala Leu20 25 30Gln Asn Gly Thr Met Glu Gly Phe Phe Lys Leu Ile Ser Cys Phe Gln35 40 45Thr Gln Ser Glu Pro Ala Tyr Cys Gly Leu Ala Ser Leu Ser Met Val50 55 60Leu Asn Ala Leu Ala Ile Asp Pro Gly Arg Lys Trp Lys Gly Pro Trp65 70 75 80Arg Trp Phe Asp Glu Ser Met Leu Asp Cys Cys Glu Pro Leu Glu Lys85 90 95Val Lys Glu Glu Gly Ile Thr Phe Gly Lys Val Ala Cys Leu Ala His100 105 110Cys Ala Gly Ala Asn Val Gln Ala Ile Arg Thr Ser Gln Gly Ser Leu115 120 125Glu Asp Phe Arg Gln His Ile Ile Arg Cys Thr Ser Ser Asp Asp Cys130 135 140His Val Ile Thr Ser Tyr Asn Arg Lys Ala Phe Gly Gln Thr Gly Thr145 150 155 160Gly His Phe Ser Pro Ile Gly Gly-Tyr His Lys Gly Ser Asp Met Ala165 170 175Leu Ile Leu Asp Thr Ala Arg Phe Lys Tyr Pro Pro His Trp Val Pro180 185 190Leu Gln Leu Leu Trp Glu Ala Met Lys Tyr Glu Asp Pro Ala Thr Gly195 200 205Tyr Pro Arg Gly Phe Met Leu Ile Ser Lys Leu Gln Arg Ala Pro Ser210 215 220Leu Leu Tyr Thr Leu Ser Cys Arg His Glu Ser Trp Val Gln Thr Ala225 230 235 240Lys Tyr Leu Met Asp Asp Val Pro Ile Leu Leu Lys Lys Ala Asn Leu245 250 255Asn Thr Val Gln Asp Val Leu Ser Leu Ile Phe Lys Ser Leu Leu Ser260 265 270Asn Ala Gly Asp Phe Ile Lys Trp Val Ala Glu Val Arg Arg Pro Glu275 280 285Glu Asn Ser Ala Leu Ser Lys Glu Glu Lys Glu Arg Leu Ala Ile Lys290 295 300Glu Ile Val Leu Gln Gln Ile Arg Glu Thr Lys Leu Tyr Lys Tyr Val305 310 315 320Ser Glu Trp Leu Ser Asp Met Arg Ser Cys Cys Cys Asn Ala Ser Ala325 330 335Phe Ser Gly Lys Asp Ser Leu Thr Asp Ile Ala Ala Ser Val Cys Cys340 345 350Gln Gly Ala Leu Leu Leu Ala Gly Asn Leu Gly Arg Asp Asn Lys Ser355 360 365Cys Leu Lys Glu Thr Cys Val Asn Asn Val Lys Ser Asn Gly Gly Gly370 375 380Pro Ile Thr Val Val Ser Gly Thr Val Val Ser Glu Gly Gly Glu Gln385 390 395 400Gly Val Asp Met Leu Val Pro Thr Ser Pro Ser Lys Ser His Gly Cys405 410 415Asn Ala Gly Ser Ser Ser Phe Cys Ala Ile Ala His Pro Gly His Gly420 425 430Asp Val Leu Thr Ile Leu Ser Leu Ala Leu Phe Thr Asn Ser Trp Phe435 440 445Asp Ile Ser Asn Lys Lys Leu Leu Asp Glu Ile Arg Ala Leu Val Ser450 455 460Phe Gln Asn Leu Pro Asp Val Leu Gln Glu Glu Val Leu His Leu Arg465 470 475 480Arg Gln Leu Met Phe Leu Lys Lys Cys Lys Asp Lys Glu Val Asp Gly485 490 495Asp Val Leu Leu Pro Ser Ile Ser Met Val500 50权利要求
1.一种大蒜重金属抗性相关基因，它编码序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的基因编码的多肽，它是由序列表SEQ ID NO1所示的cDNA序列编码的。
3.含有权利要求1所述基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的载体，它是含有所述基因的pFL61-AsPCS。
5.含有权利要求3所述的载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的细胞，它是酵母细胞。
7.根据权利要求5所述的细胞，它是大肠杆菌。
8.一种生产权利要求2所述的多肽的方法，包括培养权利要求5所述的宿主细胞，回收所述的多肽。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述的宿主细胞是酵母细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌。
全文摘要
本发明公开了一种对重金属具抗性的基因即大蒜植物络合素合酶基因，该基因所编码的氨基酸序列中氨基端有7个完全保守的Cys残基和4个完全保守的His残基，而且在羧基端也有4个完全保守的Cys残基；以酵母功能互补实验证明其cDNA在酵母中的表达可以使对重金属敏感的酵母菌株耐受一定浓度的重金属；本发明进一步可用于培育用于清除环境重金属污染的工程植物，以及制备在食用部分低吸收重金属的新型安全农作物。
文档编号C12P21/02GK1401771SQ0213103
公开日2003年3月12日 申请日期2002年9月26日 优先权日2002年9月26日
发明者麻密, 姜瑛楠, 冯保民, 李江川, 杨树德 申请人:中国科学院植物研究所