专利名称：通过检测人类t细胞受体tcr基因在治疗前后的变化来评价治疗hiv药物疗效的方法
技术领域：
本发明涉及药物疗效的评价方法，特别是指通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物的疗效的方法。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种嗜T细胞性病毒，感染的靶细胞是CD4T淋巴细胞，从而引起艾滋病(AIDS)。HIV感染可以引起CD4T细胞数量的减少和免疫功能的失调，也能引起CD8T淋巴细胞的高度活化及功能上的紊乱。有效的药物治疗不仅能控制病毒的复制而且能有效的改善或恢复T细胞的数量及功能。检测T细胞数量及功能状态是鉴定药物疗效的最有力的生物学及免疫学依据。
目前普遍采用的方法是用流式细胞记数仪检测T细胞数量的改变。此种方法是采用荧光标记单克隆抗体进行跟踪观察细胞数量的改变情况。然而要观察病人体内细胞的免疫状态，只靠这一细胞表型的定量分析是远远不够的。因此采用分子生物学及分子免疫学技术来观察T细胞内部的细微变化已经成为一个重要检测手段。
T淋巴细胞是通过T细胞受体(TCR)来识别蛋白抗原的特异性的。组成T细胞受体的多肽链包括αβ异二聚γδ异二聚体。其中T细胞受体的β链因其含有非模板依赖的N区序列的插入和D区的存在(ND或NDN)，是TCR重排多样性可独特性的关键区域。因此以检测TCRβ链基因或氨基酸表达频具有临床价值。TCRβ链是由可变区基因(V基因)，多变区基因(D基因)，结合区基因(J基因)及恒区基因(C基因)编码而成的。病毒通常引起一个选择性的Vβ基因家族的改变。已建立的半定量分析方法是采用同位素标记C区基因末端引物定量每一基因家族基因表达的相对百分比。这种定量方法的灵敏度及特异性都较低，而且需要大量的T细胞(1×107细胞)。由V-D-J组成都TCR的互补决定族区(CDR3)是抗原特异的识别区。该区是TCR产生多样性和特异性的关键区。因此可利用重排的T细胞受体基因，作为T细胞克隆的标志。目前研究资料表明，CDR3区段重排或称改变几乎发生在所有的T-细胞介导的免疫病中。检测此区基因及氨基酸的变化在鉴定药物疗效上具有广阔的前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效的通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物的疗效的方法。
本发明的上述目的可以通过如下的技术方案来实现。
1.T细胞的采集、分离血样经采集后，用Ficoll-Hypaque分层液分离，得到外周血单个核细胞(PBMC)，再以偶联有CD4或CD8抗体的磁化珠进一步分离出CD4或CD8 T细胞。
2.cDNA的合成淋巴细胞的mRNA的分离和提纯的方法是采用已经公布的技术(Chen，Z.W等1994 proc，Matl.Acai.Sci.Usa.917501-7505)，将mRNA同1μg任意的hexanucleotides(Promega，美国威斯康星州麦迪逊州)，5μl supertranscriptaseII(GibcoBRL，美国纽约长岛)在37℃混合反应后加热到70℃终止，得到cDNA。
3.TCR基因组引物的设计首先设计5′端引物。然后在C基因区设计3′端引物。这一引物用于第一步放大之用。
为了更精确地测定当HIV病毒与TCR分子相互作用时，其CDR 3区核酸或氨基酸序列的变化，我们设计了一组内侧引物用于TCR分子的CDR3区段图谱分析。在极其靠近CDR3区段V基因区设计24个内侧Vβ基因引物和一个内侧Cβ基因引物。Cβ基因引物采用高灵敏度的荧光(6-FAM)标记。我们首次在C区基因引物的5′端插入七个非模板碱基(GTTTCTT)。
4.PCR反应条件为使得PCR反应具有高度的特异性，不仅需要高度特异的引物，而且在引物浓度上也应严格控制。我们所用的引物浓度只是常规用量的十分之一到二十分之一，即在50μl反应体积中只需2.5Dmol。为了防止TaqDNA酶引起的反应物的碱基错配，我们将PCR的循环次数降至15个循环(通常为35-40个循环)。
5.CDP3基因变化的分析经荧光标记的PCR产物连同尺寸标记物与甲酰胺混合后在94℃变性2分钟，将样本置于含6％丙烯酰胺的测序凝胶中，在DNA测序机上运行6小时，将得到的数据用ABIPRISMGeneScan分析软件进行分析和量化，得出相应的结果。
本发明具有如下优点1.本发明填补了技术领域的空白，是首次用此方法来评价治疗HIV药物的疗效。
2.高度的敏感性，本发明提供的方法可以将T细胞的需求量由约1×107减少到1×105。
3.高度的特异性，本发明提供的方法所用的引物浓度只是常规用量的十分之一到二十分之一。
4.高度的可重复性，本发明提供的方法不仅在同一标本中有高度的重复性，而且在同一病人不同时间采集的样本都呈现出一致的核酸的定位。
图1是Vβ1基因在有效的药物治疗后展示的基因图谱。
图2是Vβ2基因在有效的药物治疗后展示的基因图谱。
图3是Vβ7基因在有效的药物治疗后展示的基因图谱。
a表示未感染HIV病毒时的基因图谱
b表示HIV病毒感染者治疗前的基因图谱c表示HIV病毒感染者治疗后的基因图谱
具体实施例方式下面结合实施例详细阐述本发明的
具体实施例方式将接受艾滋病药物治疗的患者和健康志愿者的血样分别采集后，用Fico11-Hypaque分层液分离，水平式离心后，单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬，得到PBMC。再以偶联有CD4或CD8抗体的磁化珠进一步分离出CD4或CD8T细胞。
T细胞的mRNA的分离和提纯的方法是采用已经公布的技术(Chen，Z.W等1994 proc，Matl.Acai.Sci.Usa.917501-7505)，将mRNA同1μg任意的hexanucleotides(Promega，美国威斯康星州麦迪逊州)，5μl supertranscriptaseII(Gibco BRL，美国纽约长岛)总的体积控制在20μl，在37℃混合1小时后加热到70℃10分钟终止反应，得到cDNA。
引物设计如附表1所示。
PCR参数设计如下第一次反应变性95℃，45秒；复性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34个循环，72℃10分钟。
5′引物(10pm) 1μl3′引物(10pm) 1μldNTPs(10mM) 1μl
10x反应缓冲液 2.5μl三蒸水 18.75μlcDNA0.5μlTaq DNA聚合酶 0.25μl第二次反应变性95℃，30秒；复性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15个循环，72℃10分钟。
5′引物(10pm) 0.5μl3′引物(10pm) 0.5μldNTP s(10mM)1μl10x反应缓冲液 2.5μl三蒸水 19.75μl第一次PCR产物 0.5μlTaq DNA聚合酶 0.25μl其中10x反应缓冲液*的组分如下，Tris-HCl(pH8.3) 300mMMgCl250mMKCl 25mM明胶0.01％反应完成后，用荧光标记的PCR产物连同尺寸标记物与甲酰胺混合后在94℃变性2分钟，将样本置于含6％丙烯酰胺的测序凝胶中，在DNA测序机上运行6小时，将得到的数据通过使用ABIPRISMGeneScan分析软件进行分析，得出相应的结果。
采用此技术我们已对50例HIV病毒感染的病人与20例正常人进行比较测定，结果表明，HIV感染的病人与正常人相比其TCR基因图谱有显著性差异(P＜0.001)。图1图2图3是3个代表性Vβ基因家族在有效的药物治疗后展示的基因图谱。由图可见治疗前基因图谱为克隆化增殖，只有一个主要的峰，而经有效药物治疗后则完全恢复到正常的分布状态。由此可见，此项技术在评价药物疗效方面是十分成功的。
表1人类TCR Vβ和Cβ引物Vβ out PCR引物 Vβ in PCR引物Vβ1out5’GGA GTC ACA CAA ACC CCA AAG CAC CTG 3’ Vβ1in 5’CTA AAC CTG AGC TCT CTG G 3’Vβ2out5’GTT ATC TGT AAG AGT GGA ACC 3’ Vβ2in 5’GCA GCT TCT ACA TCT GCA G 3’Vβ3out5’CTC GTA GAT GTG AAA GTA ACC CAG AG 3’Vβ3in 5’GAT TCT GGA GTC CGC CAG 3’Vβ4out5’GAT AGC CAA GTC ACC ATG ATG TTC 3’ Vβ4in 5’CAG CAG CAT ATA TCT CTG C 3’Vβ5.1out 5’GTC GAT TCT CAG GGC GCC AGT TCT C 3’ Vβ5.1in 5’GAC TCG GCC CTT TAT CTT TG 3’Vβ6out5’GAG TCT CCC AGA ACC CCA GAC ACA AG 3’ Vβ6in 5’GGA GAT CCA GCG CAC AGA G 3’Vβ7out5’GGT CAT GGG AAT GAC AAA TAA GAA G 3’ Vβ7in 5’CCT GAA TGC CCC AAC AGC TC 3’Vβ8out5’CGA TAG ATG ATT CAG GGA TGC CCG AG 3’ Vβ8in 5’CCA GCC CTC AGA ACC CAG G 3’Vβ9out5’GAC AAG TCC ATT AAA TGT GAA C 3’Vβ9in 5’CTG GAG CTT GGT GAC TCT GTG 3’Vβ11out 5’CTG ACA TCT ACC AGA CCC CAA GAT AC 3’ Vβ11in5’CCT GGA GTC TGC CAG GCC 3’Vβ12out 5’GAT ACT GAC AAA GGA GAA GTC 3’Vβ12in5’CTC ACT CTG GAG TCG CTA C 3’Vβ13out 5’CAA GAC CCA GGC ATG GGG CTG AAG 3’Vβ13in5’GAG GAT TTC CCG CTC AGG C 3’Vβ14out 5’GGG AGA TGT TCC TGA AGG GTA C 3’Vβ14in5’GAG AAG AGG AAT TTC AAT TTC C 3’Vβ15out 5’CTC GAC AGG CAC AGG CTA AAT TC 3’ Vβ15in5’GAG TCT GCC ATC CCC AAC 3’Vβ16out 5’GAT TCT TAG CTG AAA GGA CTG GAG G 3’ Vβ16in5’CAG AAC TGG AGG ATT CTG G 3’Vβ17out 5’GAA GGG TAC AGC GTC TCT CGG GAG AAG 3’ Vβ17in5’CGG CCC AAA AGA ACC CGA CAG C 3’Vβ18out 5’GCC GGC GTC ATG CAG AAC CCA AGA C 3’Vβ18in5’GTG CGA GGA GAT TCG GCA G 3’Vβ20out 5’CTC TCA GCC TCC AGA CCC CAG 3’Vβ20in5’CAG GAC CGG CAG TTC ATC TTC 3’Vβ21out 5’GCC TGT GGC TTT TTG GTG CAA TC 3’ Vβ21in5’CCT GCA GAG CTT GGG GAC 3’Vβ22out 5’CAC ACA GAT GGG ACA GGA AG 3’ Vβ22in5’CAC TCT GAA GAT CCG GTC C 3’Vβ23out 5’CCC TGA TCG ATT CTC AGC TCA AC 3’ Vβ23in5’GAG CTC CTT GGA GCT GGG G 3’Vβ24out 5’CGG CCG AAC ACT TCT TTC TG 3’ Vβ24in5’CAT CCG CTC ACC AGG CCT GGG 3’Cβout 5’CAG GCC TCG GCG CTG ACG ATC TGG GTG AC 3’ 3’Cβin*5’GTT TCT TGA TCTCT GCT TCT GAT GGC TCA AAC 3’*6-FAM labelling
权利要求
1.通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法，其步骤为a.血样经采集分离后，得到外周血单个核细胞(PBMC)，再进一步分离出CD4或CD8T细胞；b.分离和提纯出T细胞的mRNA后，通过mRNA合成得到cDNA；c.在极其靠近CDR3区段V基因区设计24个内侧Vβ基因引物和一个侧Cβ基因引物，C区基因引物的5′端插入七个非模板碱基(GTTTCTT)，Cβ基因引物采用高灵敏度的荧光(6-FAM)标记；d.将设计的引物和由mRNA合成的cDNA通过两次PCR反应来扩增cDNA；e.将经过两次PCR反应扩增并被荧光标记的T细胞受体基因，与甲酰胺混合后94℃变性，将样本置于含6％丙烯酰胺的测序凝胶中，在DNA测序机上运行，得到的数据用ABIPRISMGeneScan分析软件进行分析和量化，得出药物疗效的评价结果。
2.权利要求1所述的通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法，其特征还在于所设计的PCR反应引物为Vβ out PCR引物 Vβin PCR引物Vβ1out 5’GGA GTC ACA CAA ACC CCA AAG CAC CTG 3’Vβ1in5’CTA AAC CTG AGC TCT CTG G 3’Vβ2out 5’GTT ATC TGT AAG AGT GGA ACC 3’Vβ2in5’GCA GCT TCT ACA TCT GCA G 3’Vβ3out 5’CTC GTA GAT GTG AAA GTA ACC CAG AG 3’ Vβ3in5’GAT TCT GGA GTC CGC CAG 3’Vβ4out 5’GAT AGC CAA GTC ACC ATG ATG TTC 3’Vβ4in5’CAG CAG CAT ATA TCT CTG C 3’Vβ5.1out5’GTC GAT TCT CAG GGC GCC AGT TCT C 3’Vβ5.1in 5’GAC TCG GCC CTT TAT CTT TG 3’Vβ6out 5’GAG TCT CCC AGA ACC CCA GAC ACA AG 3’ Vβ6in5’GGA GAT CCA GCG CAC AGA G 3’Vβ7out 5’GGT CAT GGG AAT GAC AAA TAA GAA G 3’ Vβ7in5’CCT GAA TGC CCC AAC AGC TC 3’Vβ8out 5’CGA TAG ATG ATT CAG GGA TGC CCG AG 3’ Vβ8in5’CCA GCC CTC AGA ACC CAG G 3’Vβ9out 5’GAC AAG TCC ATT AAA TGT GAA C 3’Vβ9in5’CTG GAG CTT GGT GAC TCT GTG 3’Vβ11out 5’CTG ACA TCT ACC AGA CCC CAA GAT AC 3’ Vβ11in 5’CCT GGA GTC TGC CAG GCC 3’Vβ12out 5’GAT ACT GAC AAA GGA GAA GTC 3’Vβ12in 5’CTC ACT CTG GAG TCG CTA C 3’Vβ13out 5’CAA GAC CCA GGC ATG GGG CTG AAG 3’Vβ13in 5’GAG GAT TTC CCG CTC AGG C 3’Vβ14out 5’GGG AGA TGT TCC TGA AGG GTA C 3’ Vβ14in 5’GAG AAG AGG AAT TTC AAT TTC C 3’Vβ15out 5’CTC GAC AGG CAC AGG CTA AAT TC 3’ Vβ15in 5 GAG TCT GCC ATC CCC AAC 3’Vβ16out 5’GAT TCT TAG CTG AAA GGA CTG AGG 3’ Vβ16in 5’CAG AAC TGG AGG ATT CTG G 3’Vβ17out 5’GAA GGG TAC AGC GTC TCT CGG GAG AAG 3’ Vβ17in 5’CGG CCC AAA AGA ACC CGA CAG C 3’Vβ18out 5’GCC GGC GTC ATG CAG AAC CCA AGA C 3’ Vβ18in 5’GTG CGA GGA GAT TCG GCA G 3’Vβ20out 5’CTC TCA GCC TCC AGA CCC CAG 3’ Vβ20in 5’CAG GAC CGG CAG TTC ATC TTC 3’Vβ21out 5’GCC TGT GGC TTT TTG GTG CAA TC 3’Vβ21in 5’CCT GCA GAG CTT GGG GAC 3’Vβ22ot 5’CAC ACA GAT GGG ACA GGA AG 3’Vβ22in 5’CAC TCT GAA GAT CCG GTC C 3’Vβ23out 5’CCC TGA TCG ATT CTC AGC TCA AC 3’Vβ22in 5’GAG CTC CTT GGA GCT GGG G 3’Vβ24out 5’CGG CCG AAC ACT TCT TTC TG 3’Vβ24in 5’CAT CCG CTC ACC AGG CCT GGG 3’Cβout 5’CAG GCC TCG GCG CTG ACG ATC TGG GTG AC 3’3’Cβin*5’GTT TCT TGATCTCT GCT TCT GGC TCA AAC 3’*6-FAM Imbelling
3.权利要求1所述的通过检测人类T细胞受体TCR基因在治疗前后的变化来评价治疗HIV药物疗效的方法，其特征还在于PCR反应的条件为第一次反应变性95℃，45秒；复性60℃，45秒；延伸72℃，45秒，34个循环，72℃10分钟；5′引物(10pm) 1μl3′引物(10pm) 1μldNTPs(10mM) 1μl10x反应缓冲液 2.5μl三蒸水 18.75μlcDNA0.5μlTaq DNA聚合 0.25μl第二次反应变性95℃，30秒；复性60℃，30秒；延伸72℃，30秒，15个循环，72℃10分钟；5′引物(10pm) 0.5μl3′引物(10pm) 0.5μldNTPs(10mM) 1μl10x反应缓冲液 2.5μl三蒸水 19.75μl第一次PCR产物 0.5μlTaq DNA聚合酶 0.25μl其中10x反应缓冲液的组分如下Tris-HCl(pH8.3) 300mMMgCl250mMKCl 25mM明胶0.01％
全文摘要
发明提供一种通过设计的特定引物来完成PCR反应，放大感染HIV病毒的患者的T细胞受体TCR基因在接受药物治疗前后的变化，进而评价药物的疗效的方法，本发明提供的技术不但填补了技术上的空白而且具有灵敏度高，准确性好的优点。
文档编号C12Q1/68GK1480537SQ02131070
公开日2004年3月10日 申请日期2002年9月28日 优先权日2002年9月28日
发明者寇忠琛 申请人:北京佰仁思生物工程有限责任公司