专利名称：控制植物根系发育基因的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物启动子及其应用。
背景技术：
农作物的生长与发育都需要依赖根系从土壤中吸收水分和无机盐养分。因此，根的发育对于农作物的产量起着至关重要的作用。水稻的根系，可根据它们发生的位置和发育阶段分为两类，一类是胚生根，一类是胚后发育的根。胚生根由胚根萌发后发育而来，它有两种形式，一条初生根和几条种子根。胚后发育的根，也有两种类型，一类是从植株茎节产生的不定根，另一类是在所有类型根上，都产生的侧生根。
在模式植物拟南芥中，人们已经发现了很多参与生长素信号转导的基因，调控着根的发育。例如受生长素快速诱导的AUX/IAA基因的成员，包括XHY2/IAA3，SLR1/IAA14，IAA28，MSG2/IAA19，如果发生突变都会导致侧生根减少或没有(Reed2001，Trends Plant Sci.6，420-425)。相反有些基因如AUX1，TIR1或者MAC1超表达，则会促进侧生根的形成(Marchant et al.，2002，Plant Cell.14，589-597.；Gray et al.，1999，Genes Dev.13，1678-1691；Xie et al.，2000，Genes Dev.14，3024-3036)。植物生长素(吲哚乙酸，IAA)在根发育多个方面起着重要作用，它们包括抑制初生根的伸长，促进不定根，侧根和根毛的形成，维持根尖细胞分化状态。作为一个重要的调节激素，生长素调控着细胞分裂、细胞扩展及其细胞的分化。这就决定生长素影响植物发育是多方面的，它决定着下胚轴和茎端的伸长，介导着根和茎的向地性，维持着顶端优势，并且促进维管束的形成(Hobbie，1998，Plant Physiol.Biochem.36，91-102)。
很多受生长素调控的基因的启动子序列中都有一段共同序列—生长素反应元件AuRE(Auxin Response Element)5’-TGTCTC-3’，这个序列被证实是生长素反应因子ARF(auxin response factor)结合所必需的(Guilfoyle et al.，1998，PlantPhysiol.118，341-347；Liu et al.，1994，Plant Cell.6，645-57；Ulmasov etal.，1999，Plant J 19，309-319)。幼叶原基、幼叶和根尖分生组织可能是生长素合成的部位。幼叶合成的生长素，可以向下极性运送到根；而根尖产生的生长素，它可以在根尖皮层里向上运输。这种极性运输可以引起细胞间的生长素浓度的梯度，而极有可能这个浓度梯度决定了胚胎细胞分化形态、维管束的分化、根尖分生组织形态建立等。最近的研究也表明，生长素不仅可以诱导生长素信号转导中正调控蛋白的表达，同时也可以诱导生长素信号转导的负调控蛋白，如AUX/IAA家族蛋白，而AUX/IAA家族蛋白又会被生长素诱导的SCFTIR1蛋白降解复合体所降解(del Pozo and Estelle，1999，Trends Plant Sci.4，107-112；Gray et al.，2001，Narure.414，271-276)。这样，植物通过一个精巧的反馈抑制与解抑制系统来精细调节生长素的调控作用。生长素的信号转导途径在双子叶和单子叶植物中具有较高的保守性。首先在水稻中发现了11个基因，编码的蛋白序列和拟南芥的ARF蛋白有同源性(Sato et al.，2001，Genes Genet.Syst.76，373-80)。而且在水稻中分离的OsIAA1基因，作为一个单子叶AUX/IAA基因家族的成员，被证实它可以被生长素和光线所诱导(Thakur et al.，2001，DNA Res 8，193-203)。与双子叶植物相比，单子叶植物根发育调控机理的研究相对滞后。只有在玉米中发现的几个与根发育相关的突变体可供研究rtcs，完全不产生不定根；rt1，只形成很少或没有冠状根和支持根；asr1，种子根形成缺陷；slr1和slr2，只形成很短的侧生根(Hetz et al.，1996，Plant J.10，845-857)，但遗憾的是这些突变体相对应的基因并没有克隆出来。而在水稻中，和根发育相关的基因研究则更少，现在只证实了水淹和乙烯处理能诱导不定根的形成(Suge，1985，Plant Cell Physiol.26，607-614；Bleecker et al.，1987，Plant Physiol.84，395-398)。
发明内容
本发明的目的是提供控制植物根系发育基因的启动子。
本发明的发明人采用反向遗传学的方法，分离克隆了水稻中与拟南芥AtFPF1(flowering promoting factor 1)基因(Kania et al.，1997 Plant Cell.9，1327-1338)同源的OsRAA1(Oryza sativa Root Architecture Associated 1)基因，并初步研究了它在植物发育中的功能。它的启动子序列是基于数据库中已有的EST(expressionsequence tag)和基因组序列来获得的。
本发明提供的控制植物根系发育基因的启动子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
序列表中序列1的DNA是水稻OsRAA1的启动子，由1987个碱基组成。
含有本发明启动子的表达载体、细胞系均属于本发明的保护范围。
本发明启动子的发现和其功能的阐明，在植物特别是水稻育种中具有重要的意义。
图1为从水稻基因组DNA扩增OsRAA1启动子的电泳图谱。
图2为本发明启动子序列的赤霉素和生长素顺式调控反应元件分析。
图3为转化水稻OsRAA1基因的启动子融合GUS基因的植物表达载体的图谱。
图4为表达载体的酶切鉴定谱带。
图5为OsRAA1∷GUS基因在转基因水稻中的GUS活性染色。
图6为生长素诱导OsRAA1的表达。
具体实施例方式
在下述实施例中，所用的水稻品种为中花10号(Oryza sativa L.cv Zhonghua 10)和中花11号(Oryza sativa L.cv Zhonghua 11)。
实施例1、水稻OsRAA1基因启动子序列的分离1、启动子引物设计选取ORF前1987bp作为目标序列，依据PAC(AP002525)序列设计了5’端引物5’-TGCAGGA TCCATA GAT TTG TCA AGA AAA CAT TTC GA-3’(下划线序列为BamH I位点)。同时考虑到需要把它和植物表达双元载体pCAMBIA1301的报告基因GUS相连，而在pCAMBIA1301的报告基因GUS起始密码子上有一个Nco I(CCATGG)位点，因此在目标基因的起始密码子上，也修饰为Nco I(CCATGG)位点，3’端引物为5’-CCTG CCATGG CTT AGA TCT CTC TCA AAC TC-3’。
2、PCR扩增OsRAA1基因的启动子序列常规方法分离水稻基因组DNA，引物如前设计，反应程序是97℃ 5min，1 cycle，加Taq酶；94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 3min，30 cycles；72℃ 7min，1 cycle。
用日本晴基因组DNA作为模板，得到了需要的目标条带，如图1所示，图中M3λDNA用Hind III和EcoR I消化的产物；LP单正向(forward)引物扩增产物；DP双引物扩增产物；RP单反向(reverse)引物扩增产物。图中显示双引物扩增产物中有一个特异的2.0kb的片段。测序结果得到的启动子序列1987bp，为序列表中序列1的DNA序列。
在所得到的启动子序列里含有大量的嘧啶盒，至少三个GARE，两个TATCCA盒，及生长素反应元件TGTCTC，其分布如图2所示，其中B是在启动子区域内定位赤霉素反应元件的3个组分，嘧啶盒，TAACAAA和TATCCA盒，(用DNAMAN软件处理)。C是在启动子区域内定位生长素反应元件的核心序列TGTCTC(箭头所示为潜在的反应元件)，这些反应元件的核心序列处于转录起始点上游约150bp的位置。这些保守序列的存在可能暗示这个基因受赤霉素和生长素的调控。
实施例2、水稻OsRAA1基因启动子融合GUS基因的植物表达载体的构建将经测序鉴定的2.0kb PCR片断，用BamH I和Nco I消化；同时用BamH I和NcoI酶切去pCAMBIA1301质粒中GUS基因前的CaM35S启动子，连上消化好的2.0kbPCR片断，即完成了OsRAA1Pro∷GUS (pCAMBIAI301)植物表达载体，其基因结构图谱如图3所示。图4是三个表达载体的酶切鉴定，其中带1是Marker；带2是转化水稻的OsRAA1正义基因植物表达载体用Kpn I和Sac I进行酶切的鉴定图谱(切出了360bp的目标条带)；带3是转化水稻的OsRAA1反义基因植物表达载体用BamH I和Kpn I进行酶切的鉴定图谱(切出了360bp的目标条带)；带4是转化水稻OsRAA1基因的启动子融合GUS基因的植物表达载体用BamH I和Nco I进行酶切鉴定图谱(切出2kb的目标条带)，从图中可以看出，GUS基因已置于OsRAA1基因的启动子后。
实施例3、植物表达载体转化植株的组织化学分析鉴定用OsRAA1启动子驱动的β-葡糖醛酸苷酶报告基因(GUS)植物转化载体，利用农杆菌侵染的方法转化水稻，并用GUS原位组织化学活性分析进行检测。方法是将经根癌农杆菌转化后产生的抗性愈伤组织及转化植株的叶片和根段分别放到GUS染色液(100mmol/L NaPO4(pH7.0)；0.1％Triton X-100；10mmol/L EDTA；0.5mmol/L亚铁氰化钾；0.5mmol/L铁氰化钾；1mg/mL X-Gluc)中，抽气几分钟，然后置于37℃温育过夜，观察蓝色反应。染色后的组织用70％乙醇脱色。结果如图5所示，图中，A，初生根分支区的X-gluc染色，表明不仅在侧根而且在它们的原基组织都有很强信号(箭头所示)；B，初生根根尖的染色，表明在根尖的分生和伸长区都有GUS活性信号，特别是根的中柱有很强信号；C，受粉前的成熟小花，表明内外稃也有GUS活性，特别是维管束更强一些；D，幼苗的染色，在幼叶的某些部分存在一些信号，但是不稳定和无规则性，可能是由于转GUS基因的渗漏表达造成的；E，染色后的花器官，雄蕊成熟后，花柱和花丝的连接部分也有稳定的很强信号(箭头所示)。
从OsRAA1的表达模式可以看出OsRAA1总是存在于快速生长的细胞内，如，侧根原基，侧根和不定根中柱。对于这些组织的细胞快速分裂和伸长，生长素起到重要作用。
实施例4、OsRAA1Pro∷GUS转基因水稻的NAA处理及GUS活性的组织化学染色OsRAA1Pro∷GUS转基因水稻T1代种子，在温室生长两个月后，从土壤中小心拔出，洗去土壤，在1/2MS无机盐培养液中培养3天，然后将水稻转移到含有2.5μM NAA的1/2MS无机盐培养液中。选取两种新生的不定根(直径约1mm和0.5mm)作为染色对象。在不同的时间段(0，1，2，4小时)分别剪取根尖，进行GUS组织化学染色。结果如图6所示，其中A，水稻幼根的RNA Northern杂交显示OsRAA1的转录受生长素的诱导(用10nM IAA分别处理野生型幼苗0，1/4，1/2，1，2，4，8hours)，对照为EB染色的rRNA。B，OsRAA1∷GUS转基因水稻的根用NAA(2.5μM)处理不同时间(0，1，2，4hours)的GUS染色结果。C-E，野生型水稻在1/2MS培养基(含有1μM NAA或没有NAA)生长14天的表型，C，显示1μM NAA的处理强烈抑制植株根系的生长，右边两株为NAA处理植株，左边为未处理植株；D，未处理的植株根基部的情况；E，用1μM NAA处理的植株根基部的情况，箭头所示为螺旋的初生根。从图中可以得出，在NAA诱导一小时的根尖有最强的信号。
序列表<160>1<210>1<211>1987<212>DNA<213>稻属水稻(Oryza sativa L.)<400>1tggccattaa caaataaaca aaaataaaca tatccataga tttgtcaaga aaacatttcg 60atcatataca ccatgatata tattgtaggt gctagttatc caacaatatt atgattttaa 120gcattgcgat aattttaaaa agctggtgat tatgtttatt taacttagaa cttgtggtat 180atttatgtgt gatttgtcac aacacggaac cactgtactg aggattttaa aacagtacta 240tgttcggccg gtaccttttg cacaaacaag cagtggcgcc cgaaagcata tatatgatgg 300atgtttaggt taagtcattg gaacctttct attgattaat cggttgattg aggagcaaga 360ttaacgccaa cttttagcat atatatatcg gccagacaaa tttgaaaagt aaacttttaa 420ctctgaaaaa catttcttaa ttatggggcg ttcatttttc tgccgtacaa cacaaccaaa 480acaggcctcg attaaacaaa tgtgtgccaa attttaggga cagacgtgca ccaatattat 540cacaaaggga acgaacacaa taaccaaatt aatgcgccat tgcgtgcgca ctatgggaat 600aattttgtta catatatata taaatagatg tggtattcta agataaacca aaatcttttt 660aaattttctg cagaagatgc tagcttgagc ttgtcaatca atatagctag agctataaaa 720attaaagaaa aaaattatgt cctgccgtac acaaaatata tacttgacaa tgagctagga 780gaatcggttt tgttcctgat aaaaggtgat cttagctctg tcgatcggcc agaattcact 840ttcactagaa aaaaaaaatt gttcgaaaag agatgggcat gcacgtacag ctgaaattct 900cttgtgtgat ggctaagtaa agtagtaaac tatgggaagt gaatcatatt cccttctttg 960ataaatagac cccttttgtt ttcgagaaaa gaaagtaggt aggattcctc gcacagcatc1020acaagttatt ttcgttacca tatgaaaatt cttatctatc tatatatcaa tccattgtga1080aatcaattag ctttatggga tatataacac taatttatca ttgtggtcca agtaagatgc1140atggatatta ggatttaacc gattaatcat gcattttata tacacaaccc atatggtttt1200tatctctctt tttctacgcg tcatggtcac acgataacat gtgttgataa tcgagaaccc1260ttgatgtcat gcatgcatgt atatatttca atcgactttg gtttgtccca aaaattagag1320aataaatact agtttatttt tcttcttttt agagattgta cgatcactag ctagctaggt1380atagctagct gacggatttt tccaattagg tatatatcca tgcacacaca ccgatctttt1440cattcattct tttctttctt ttcacagata tattccaggt agcttatcaa gcacataatg1500ttggaaaatt aaacaaggaa tccttaacta acaaatgaaa cacggggagg gaggaagaga1560gggggcagag ctagagagct agctagctat tgctacagca catcttcgat atcatgacct1620aacctaacta cgaccccacg tatactcgat actaaactac tatagacgaa cgaacgatcg1680ttcgttcgtt tcgcatatat ctataaatcc tttatgatat cgatatctct atttcttagt1740atatctaata gcatagtagt aggttagtat atctgctata gctagctagc agtacatgca1800tgcatgcaca catgtacata ctaccatatc tctgtcttgt ctccctttca catgtcacct1860ctgacccaca aacaaaccct ttccaagctc ctaacactag ctttaccttc ttcttcctcc1920tcctctgtat atatacaccc cctcacctcc ctatcttgca cccatccatc cacccatagc1980tatctct 198权利要求
1.控制植物根系发育基因的启动子，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于它具有序列表中序列1的DNA序列。
3.含有权利要求1所述启动子的表达载体。
4.含有权利要求1所述启动子的细胞系。
5.权利要求1所述的启动子在植物育种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述植物为水稻。
全文摘要
本发明公开了控制植物根系发育基因的启动子及其应用，其目的是提供控制植物根系发育基因的启动子。本发明提供的控制植物根系发育基因的启动子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性的DNA序列。含有本发明启动子的表达载体、细胞系均属于本发明的保护范围。本发明启动子的发现和其功能的阐明，在植物特别是水稻育种中具有重要的意义。
文档编号C12N5/04GK1483822SQ0213075
公开日2004年3月24日 申请日期2002年9月20日 优先权日2002年9月20日
发明者种康, 葛磊, 陈惠 , 赵原, 徐云远, 许明丽, 许智宏, 谭克辉, 种 康 申请人:中国科学院植物研究所