改良的分子信标探针及其应用的制作方法

专利名称：改良的分子信标探针及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及选择性地检测特异性靶核酸分子的寡核苷酸探针，特别是涉及改良的具有“茎-环”结构的分子信标探针及其在检测靶核酸分子中的应用。
在临床医学实践中，以更灵敏、特异和快速的方法检测和定量分析各种来源的核酸和/或蛋白质分子，对于提供疾病的诊断和预后信息将发挥重要的作用。近年来，一种主要用于核酸检测的试剂——分子信标探针(MB)的研究与开发已取得了十分迅速的进展。
结构上看，分子信标探针(MB)是一种含有“茎-环”结构单分子核酸分子。茎部分是由于分子内两互补序列，即核酸分子的5’和3’末端的碱基配对而形成的。环部分则与构成茎的两条链相连，并且包括与待检序列互补的序列。分子的一个末端连接有荧光素基团，而另一个末端则连接有荧光淬灭基团。当处于茎-环构象时，这两个部分在物理上是彼此相邻近的。当用相当与荧光基团发射波长的光照射分子信标探针时，因为荧光基团和荧光淬灭基团之间发生能量转移，使荧光基团受激发后由之发射出来的光被淬灭基团所吸收，所以不能观察到荧光。当分子信标探针与互补于环的靶序列接触时，环即与该序列杂交。又由于如此形成的分子间双链比茎区域中形成的分子内双链更长，所以能量上更为稳定。随着该分子间双螺旋的形成，即产生一种使茎区域松解并伸展的扭力。结果，导致荧光基团与淬灭基团分开，以至淬灭基团不再能有效地吸收由荧光基团发出的光。因此，分子信标探针与其靶核酸序列的结合即伴随着荧光发射的增加，并据此构成检测的基础。
例如，当MB游离存在于溶液中而没有与第二个核酸(靶核酸)杂交时，MB的茎因碱基配对而稳定化。这种自身互补配对便形成了使其中荧光部分和淬灭部分彼此接近的所谓“发夹环”结构。在这种构象下，荧光基团被淬灭基团淬灭。如果分子信标探针的环序列互补于靶核酸中的待检序列，则环序列便与之杂交并因此而导致茎区域解链，使荧光基团与淬灭基团分离开，进而导致MB的荧光增加。(附

图1)(参见美国专利5,925,517、5,989,823、6,150,097和6,355,421号)。
另外，从功能上看，分子信标探针的全序列又分为可与靶核酸序列杂交的特异性识别序列(即靶序列的反向互补序列)，和并不与靶核酸序列杂交的所谓无关序列(即不与靶序列反向互补的序列)。
作为一种核酸的检测和实时定量分析试剂，分子信标探针正在被越来越多的研究者和实验室所接受，并且近年来也已针对MB和相关技术进行了许多有益的改进和商业开发。尽管如此，在MB的设计、合成和纯化等技术领域仍存在许多有待解决的问题。例如，目前的合成和纯化手段有限，因而导致MB的生产成本很高，特别是在使用有较长序列的MB的情况下。更为不幸的是，对于一个设计并合成好的特定MB，甚至有高达70％的终产品经试验证实是无效或不能使用的。因此，如何进一步改进分子信标探针的设计、合成和纯化就成为本领域技术人员面临的一个重要课题。特别是鉴于MB设计是继后合成、纯化和商业化生产的基础，所以基于以前失败的教训改进MB分子的设计，对于MB及相关技术的广泛应用和发展将具有重要意义。
本发明人基于多年来从事分子信标探针设计与研究的经验，在经过反复失败后，全面改进了这种发夹状荧光探针的设计，特别是我们创造性地将信标探针的特异识别区域延伸到传统MB分子的茎区域，从而提高了MB分子与靶序列的杂交效率和强度，改善了信标探针的敏感性和特异性。
因此，本发明的一个目的是提供一种改良的分子信标探针，特征在于其中分子信标探针的环区域与部分或全部茎区域的连续核苷酸构成所说的探针的靶核酸识别序列。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中靶核酸识别序列是由分子信标探针的环区域和与之相连的部分或全部茎区域构成的。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中探针序列的总长度约为15至50个核苷酸。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中构成分子信标探针茎区域的长度约为0-8个核苷酸。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中与靶核酸杂交的环区域的Tm值为50℃以上。
本发明的另一个目的是提供一种改善分子信标探针与待检靶核酸的杂交效率的方法，该方法包括将分子信标探针的靶核酸识别序列由环区域延伸到与之相连的部分或全部茎区域。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中构成靶核酸识别序列的分子信标探针的环区域和与之相连的部分茎区域的总长度约为15至45个核苷酸。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中构成分子信标探针茎区域的长度约为0-8个核苷酸。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中与靶核酸杂交的环区域的Tm值为40至50℃以上。
本发明的再一个目的是提供一种检测生物学样品中存在的靶核酸的方法，该方法包括(1)使用一组寡核苷酸引物对所说的样品进行扩增反应，以得到其中存在靶核酸序列的扩增产物；(2)在适于探针与靶核酸序列杂交的条件下，使扩增产物与如上限定的分子信标探针与生物学样品中的靶核酸扩增产物接触；(3)以常规方法监测所说的探针的荧光并借以检测靶核酸序列的存在。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的靶核酸序列来源于选自病毒、细菌、真菌、霉菌和原生动物的病原或非病原生物体。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的靶核酸序列来源于选自病毒、细菌、真菌、霉菌和原生动物的病原生物体。
本发明的再一个目的是提供用于上述检测方法中的试剂盒，所说的试剂盒包含对所说的靶核苷酸序列特异的如上限定的分子信标探针。
图1A和1B分别显示常规分子信标探针和本发明改良的分子信标探针的工作原理图。其中空心小圆圈代表荧光基团；实心小圆圈代表淬灭基团。
图2显示使用某一靶核酸序列设计并合成的特异性分子信标探针检测所说的靶核酸序列的动态杂交反应曲线。其中●代表本发明改良的、以整个环区域和茎区域作为识别序列的分子信标探针(探针1)；■代表以传统方法设计的、仅以环区域作为识别序列的分子信标探针(探针2)。
图3显示使用本发明设计的乙型肝炎病毒S区特异性分子信标探针，以均相荧光聚合酶链反应法(PCR)检测所说的靶核酸序列，在不同热循环次数下的相对荧光强度曲线。
本发明涉及选择性地检测特异性靶核酸分子的寡核苷酸探针，特别是涉及改良的具有“茎-环”结构的分子信标探针、含有所说的探针的试剂盒及所说的探针和其试剂盒在检测靶核酸分子中的应用。
本文中使用的术语“分子信标探针”(MB)是指在适当的杂交条件下自身杂交以形成茎和环结构的寡核苷酸。MB在其寡核苷酸两末端分别连有荧光剂和淬火剂。因此，在允许分子内杂交的条件下，荧光标记通常被淬灭剂淬灭。当在MB不发生分子内杂交的条件下(即与靶核酸结合时)，MB分子上的荧光标记即不被淬灭。
本文中使用的术语“茎区域”是指MB的“茎-环”结构中位于“茎”部分的寡核苷酸。“环区域”是指MB的“茎-环”结构中位于“环”部分的寡核苷酸。
本文中使用的术语“靶核酸识别序列”又称为“中心靶核酸识别序列”或“探针序列”，一般是指两侧翼连着茎区域的并可与靶序列杂交的探针部分。当探针不与靶链杂交时，两茎区域彼此杂交使探针形成“发夹”结构。此时，靶识别序列呈现为发夹结构的单链环，而茎序列则形成茎部分双链杂交体。
核酸分子的稳定性通常是根据其熔解温“Tm”值确定的。特定的核酸双链在特定条件下的Tm值是指双链分子的1/2碱基对发生解离(即没有以碱基配对的形式彼此杂交)时的温度。
如前所述，使用基于分子信标探针的检测系统检测靶核酸时，序列的特异性和检测的敏感性水平，以及信号出现的速度均在很大程度上受到探针与靶序列的结合效率的影响。众所周知，探针与靶核酸序列的杂交过程是一个要首先消耗能量断开发夹结构(二级结构)的过程。当反应体系降低温度时，探针因两末端互补而形成发夹样结构。在有靶核酸存在下，探针与之杂交并放出能量，并导致探针因末端自身杂交而形成的发夹结构茎区域的解离。这种能量转移过程的发生和大小主要取决于茎区域解离所需的能量。而所需能量的大小又在相当程度上取决于茎区域与靶识别区域(序列)的相对长度比例。因此，有可能通过延长靶核酸识别(杂交)序列的长度来提高MB与靶序列的杂交效率。
基于上述认识，本发明人在制备MB的实践中，成功地设计了将靶核酸识别(杂交)序列延长到部分或全部茎区域的MB探针。结果令人惊奇地发现，如此得到的探针显著地改善了其与靶核酸序列的特异性杂交的成功率，由以前原设计的MB的约30％成功率提高到目前新设计的50％以上成功率。
与传统的MB相比，本发明改良的分子信标探针似乎具有相对较低的特异性。然而，就MB的实际应用目的(主要是在聚合酶链反应(PCR)用于定性和/或定量检测某些病原微生物)而言，关键的是如何提高探针与靶核酸的杂交效率和成功率，而不一定要具有极端的特异性。特别是，在检测对象基本上是使用特异性引物经过PCR扩增的靶序列的情况下，使用本发明的分子信标探针也几乎不可能因靶序列的一或两个碱基突变而出现假阳性检测结果。
因此，本发明的一个目的是提供一种改良的分子信标探针，特征在于其中分子信标探针的环区域与部分或全部茎区域的连续核苷酸构成所说的探针的靶核酸识别序列。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中靶核酸识别序列是由分子信标探针的环区域和与之相连的部分或全部茎区域构成的。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中探针序列的总长度约为15至50个核苷酸。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中构成分子信标探针茎区域约为0-8个核苷酸。
使用本发明的探针，由于延长了与引物延伸产物杂交的靶结合区，所以使特异性在一定程度上得到提高。由于新合成的引物延伸产物是靶衍生的，所以该产物与延长了靶结合区的探针杂交时，即很容易定量地反映在输出的信号上。由于探针结合区或结合位点的分子内或分子间结合受到限制，所以也简化了探针设计。本发明改良的探针不仅适用于均相分析，而且能很好地完成常规探针不能完成的检测。
应特别指出的是，Taq酶的聚合反应具有一定的错配率，所以用Taq酶聚合合成的扩增产物可能含有碱基错配的产物，而传统的分子信标因其及高的特异性，使其无法和这些产物杂交。因此也检测不到这些扩增产物。由于本发明改良的分子信标将特异识别序列延长到茎区域，虽然在一定程度上降低了探针的特异性，但本发明改良的分子信标探针却可以与含有碱基错配的PCR产物杂交，从而提高了探针的杂交效率和敏感性。在出现我们无法避免的因Taq酶本身性质决定的碱基错配问题时，使用我们改良的分子信标尤其重要。
本发明的再一个目的是提供一种检测生物学样品中存在的靶核酸的方法，该方法包括(1)使用一组寡核苷酸引物对所说的样品进行扩增反应，以得到其中存在靶核酸序列的扩增产物；(2)在适于探针与靶核酸序列杂交的条件下，使扩增产物与如上限定的分子信标探针与生物学样品中的靶核酸扩增产物接触；(3)以常规方法监测所说的探针的荧光并借以检测靶核酸序列的存在。
在本发明的方法中，引物延伸反应可重复10、20、30、40、甚至50次。由于探针的靶结合区基本上是不与用于靶序列扩增的上、下游引物重叠的，所以三者“协同把关”，基本上能够完全避免可能出现的特异性问题。在适当的三磷酸核苷和聚合酶的存在下，引物将与模板核酸上的互补序列杂交并延伸形成引物扩增产物。然后，对应于靶序列中段的探针之靶结合序列与相当于靶核酸的引物延伸产物中的互补序列杂交。结果，使探针不能形成发夹状二级结构，从而这种靶特异性杂交导致信号发生系统(荧光基团和淬灭基团对)的可检测的改变。这样，样品中靶核酸存在与否，即可根据是否存在可检测的荧光信号改变来测知。
一般说来，本发明的其中探针序列的总长度约为15至50个核苷酸，并且茎区域约为0-8个核苷酸。也就是说，由于整个探针或其一端与靶序列(扩增或延伸产物)互补并杂交，所以此时探针便不能形成发夹形二级结构。
为了得到本发明的分子信标探针，可首先基于以下步骤并使用市售的引物和探针设计软件，完成本发明改良的信标探针的设计。
简单地说，所说的步骤包括(1)基于任何细胞或微生物来源之待测核酸的已知序列，从中选择一段具有特征性的约包括15至50个核苷酸的序列；(2)写出(1)中所选序列的反向互补序列，并以其作为探针的靶特异性识别或结合序列；(3)分别确定探针环区域和茎区域的核苷酸一般环区域的约包括15-40个核苷酸；位于环区域一侧末端的茎区域的长度一般不大于8bp；(4)确定了作为探针之一侧茎区域的核苷酸序列后，在步骤(2)确定的反向互补序列的另一端补加与(3)中所述的茎区域互补的核苷酸，以其作为探针另一端茎区域的序列；(5)在如上设计的探针茎区域序列较短，环区域的Tm值较低的情况下，可在探针两末端的茎区域不加几对核苷酸，以使环区域的Tm值达到约40-50℃。设计完成后，可以使用常规方法合成并制备MB，例如使用Tyagi和Kramer(Nature Biotechnology 14303-308，1996)或Kostrikis等人(Science 2791228-1229，1998)介绍的常规方法制备MB。但也可以使用国际专利WO 01/83820中描述的基于连接的组装方法制备MB，即分别植备MB的茎、环、标记和淬火等部分，然后再用化学或酶学方法将他们连接并组装在一起。
常用的标记部分包括德克萨斯红、荧光素、IAEDANS、EDANS或其衍生物等。常用的淬火部分包括异硫氰基四若丹明(TRITC)、EDANS、DABCYL、四甲基若丹明和荧光素等。适用于连接反应的连接酶包括Taq DNA连接酶、DNA连接酶和T4DNA连接酶。
再一个方面，本发明进一步涉及用于检测和定量分析核酸的试剂盒，所说的试剂盒包含对待检的靶核苷酸序列特异的如上文限定的分子信标探针，以及其他常规试剂盒组成成分，如包装材料、使用说明书、一个或多个容器。另外，本发明的试剂盒中还可包括标准靶序列、扩增靶序列的扩增引物等标准品。
本发明的探针适用于检测和分析任何常规核酸，特别是经PCR扩增得到的DNA。样品核酸的来源包括循环血细胞、颊黏膜上皮细胞、培养的正常细胞和肿瘤细胞等人细胞，以及其他哺乳动物、血液和细胞等。再者，病毒、噬菌体、细菌、真菌及其他微生物也可以是待检核酸的来源。DNA可以是游离DN因组DNA或克隆到质粒、噬菌体或人工染色体中的DNA。
本发明的分子信标探针和其试剂盒亦可用于检测人或动物基因组DNA中变异，以及遗传性疾病。例如必要时可将靶核酸连接到有益于分析的序列或区域上。特别是，本发明的探针适用于检测细菌、病毒等感染因子如免疫缺陷病毒(HIV)和其特定的变异体，以及丙型肝炎病毒(HCV)等。
在使用温度控制和选择性地改变茎区域密码子的情况下，本发明的探针也可用于错配靶的等位基因鉴别。
由于本发明的探针产生信号迅速而且只需要单分子反应，所以特别适用于实时检测。
下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
实施例1本实施例以序列5’-GAGTTCTTCTTCTAGGGGAGGACGC-3’作为靶序列，举例说明按照本发明的基本原则设计的分子信标探针与常规分子信标探针在靶核酸检测中的不同效果。
然后分别设计并制备两个探针一个是基于本发明的原则和精神设计的(探针1)；一个是按照传统分子信标探针的原则和精神设计的(探针2)。如下所示的序列中，阴影部分为探针的靶识别序列，即探针与靶序列杂交的部分；探针两端的下划线部分构成发夹探针的茎区域。由此可见，探针1是以环部分加上茎部分的序列一起作为探针的靶识别(结合)序列；而探针2则是仅以环部分作为探针的靶识别(结合)序列。
探针1 探针2. 在含有10mM Tris-HCl(Ph8.0)，1.5mM MgCl2和浓度为0.8μmol/L探针的50μl反应体系中，首先测定预先加入之标记探针的荧光强度。加入较高浓度待检靶序列后，在使用两种不同的探针的情况下每15秒钟定时检测并记录荧光强度。结果如图2所示。
由图2所示的结果可以看出，与探针2产生的荧光信号相比，使用探针1产生的荧光升高的更快。这一实验结果说明探针1的杂交效率高于探针2的杂交效率。
实施例2本实施例以乙型肝炎S区作为靶序列，举例说明按照本发明的基本原则设计的分子信标探针在靶核酸检测中的积极效果。
(1)基于上述靶核酸的已知核苷酸序列，首先设计一对用于以PCR方法扩增所说的靶序列的引物引物S15’-CAA CCT CCA ATC ACT CAC CAA C-3’引物S25’-AGA TGA GGC ATA GCA GCA GGA T-3’同时，基于靶序列中相当于引物对中间的区域设计并合成下列探针序列，并且该探针的5’和3’端是分别连接了所示的荧光剂和淬灭剂 所示探针序列中阴影部分为探针的靶识别序列，即探针与靶序列杂交的部分；探针两端的下划线部分构成发夹探针的茎区域。
引物、探针在靶基因组中的位置如下所示 (2)样品提取取临床病人血清100μl，向其中加入裂解液(内含1％NP-40，2％Triton X-100)50μl，混匀后100℃放置10分钟，并以15000转/分离心10分钟，然后取上清20μl备用。
取预先提取的备用靶DNA样品，进行10倍系列稀释。
(3)PCR反应PCR反应混合物内含10mmol/L Tris-HCl，pH8.3，50mmol/LKCl，，2.0U Taq酶，200μmol/L dNTP，2.0mmol/L MgCl2，0.4μmol/L两引物，0.2μmol/L探针，不同浓度梯度的模板各5μl。反应总体积为50μl。经95℃，5min预变性，再95℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟，共40个循环后，在退火阶段即50℃时采集荧光数据。结果如图2所示。
由图2所示的结果可以看出，可使用我们设计的改良的分子信标探针进行PCR反应产物的实时监测，所得到的荧光动态曲线光滑，并且完全符合PCR反应的靶序列扩增规律初始靶序列浓度高的样品的荧光信号首先开始升高，并依据靶序列浓度的减小而依次降低。相反，没有靶序列的样品荧光信号则呈现低平趋势。
权利要求
1，一种改良的分子信标探针，特征在于其中分子信标探针的环区域与部分或全部茎区域的连续核苷酸构成所说的探针的靶核酸识别序列。
2，根据权利要求1的分子信标探针，其中探针序列的总长度约为15至50个核苷酸。
3，根据权利要求1的分子信标探针，其中构成分子信标探针茎区域的长度约为0-8个核苷酸。
4，根据权利要求1的分子信标探针，其中与靶核酸杂交的环区域的Tm值为50℃以上。
5，一种改善分子信标探针与待检靶核酸的杂交效率的方法，该方法包括将分子信标探针的靶核酸识别序列由环区域延伸到与之相连的部分或全部茎区域。
6，一种检测生物学样品中存在的靶核酸的方法，该方法包括(1)使用一组寡核苷酸引物对所说的样品进行扩增反应，以得到其中存在靶核酸序列的扩增产物；(2)在适于探针与靶核酸序列杂交的条件下，使扩增产物与如上限定的分子信标探针与生物学样品中的靶核酸扩增产物接触；(3)以常规方法监测所说的探针的荧光并借以检测靶核酸序列的存在。
7，根据权利要求6的方法，其中所说的靶核酸序列来源于选自病毒、细菌、真菌、霉菌和原生动物的病原或非病原生物体。
8，根据权利要求6的方法，其中所说的靶核酸序列来源于选自病毒、细菌、真菌、霉菌和原生动物的病原生物体。
9，用于完成如权利要求6限定的检测的试剂盒，其中所说的试剂盒包含对所说的靶核苷酸序列特异的如权利要求1限定的分子信标探针。
全文摘要
本发明涉及选择性地检测特异性靶核酸分子的寡核苷酸探针，特别是涉及改良的具有“茎－环”结构的分子信标探针及其在检测靶核酸分子中的应用。
文档编号C12Q1/68GK1488763SQ0213081
公开日2004年4月14日 申请日期2002年10月9日 优先权日2002年10月9日
发明者李庆阁, 栾国彦, 梁基选 申请人:英科新创(厦门)科技有限公司, 厦门大学