基于lamp和分子信标检测hpv16和18的反应体系和方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于LAMP和分 子信标对16和18型人乳头瘤病毒病原体进行检测的反应体系及检测方法。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是威胁全球女性健康最严重的疾病，2008年全球新发宫颈癌病例52. 98 万，死亡病例25. 51万人，其中85%新发病例在发展中国家。高危型人乳头瘤病毒（human papillomaviruses, HPV)的持续感染是引起宫颈癌及其癌前病变的主要原因。宫颈癌患者 100%携带高危型HPV感染，高度病变（CIN2或CIN3)患者中约97%为HPV阳性，低度病变 (CINl)中的阳性率也达 61. 4%。常见的高危型 HPV 有：16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、 58、59、68、73、82 等。
[0003] 目前的HPV检测平台包括传统的PCR产物凝胶电泳、定量PCR、反向膜杂交、基因芯 片、液相芯片等，但这些技术多局限于具备PCR操作资质的三甲医院检验科或疾病控制中 心进行，收费昂贵，不利于对人群进行广泛筛查。
[0004] 环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 Notomi于2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区 域设计4-6条特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA polymerase)在等温条件 (60-65°C左右）下放置30-60分钟，即可完成核酸扩增反应。作为一种简单、快速、成本低、 特异性强的检测技术，已在食品安全、微生物检验、临床诊断等方面得到了广泛应用。专利 申请号201110242077. 6即提供了一种基于LAMP技术检测HPV常见亚型的检测方法。
[0005] LAMP技术应用于临床的最大问题在于：传统LAMP技术多采用观测焦磷酸镁白色 沉淀、HNB染料颜色、钙黄绿素荧光等方法判断阳性，但上述方法的阳性检测结果只能代表 实验过程中发生了 LAMP反应过程，而无法区分真正的由引物和对应目标DNA模版杂交而形 成的阳性扩增结果和由于引物之间、引物与样本DNA之间误杂交发生误扩增所导致的假阳 性结果，对临床检测造成了不便。
[0006] 分子信标（molecular beacon)是1996年Tyagi等发明的一种有莖环结构的焚光 探针。当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近 而不发荧光。在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链 杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达 到熔点时，荧光迅速下降。通过控制反应温度同时观测荧光值，即可判断是否存在靶序列的 扩增。在PCR扩增的退火阶段，分子信标与生成的靶序列结合发出荧光，在延伸阶段，脱离 靶序列而不干扰扩增，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧 光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别 是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析。
[0007] 综上所述，亟需建立一种能够快速、高特异性和灵敏性、同时检测多种HPV病毒病 原体的技术。
【发明内容】
[0008] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种快速、高特异性和灵敏 性、基于LAMP和分子信标同时检测HPV16和18的反应体系和检测方法。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0010] 基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系，所述反应体系包括检测HPV16 和HPV18的引物组，
[0011] 所述检测HPV16的引物组为：
[0012] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的外引物F3 ;
[0013] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示的外引物B3 ;
[0014] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示的内引物FIP ;
[0015] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示的内引物BIP ;
[0016] 分子信标探针MB-16 ;
[0017] 所述检测HPV18的引物组为：
[0018] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示的外引物F3 ;
[0019] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 7所示的外引物B3 ;
[0020] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 8所示的内引物FIP ;
[0021] 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 9所示的内引物BIP ;
[0022] 分子信标探针MB-18 ;
[0023] 所述反应体系包括以下组分：
【主权项】
1. 一种基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系，其特征在于，所述反应体系 包括检测HPV16和HPV18的引物组， 所述检测HPV16的引物组为： 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示的外引物F3 ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示的外引物B3 ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示的内引物FIP ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示的内引物BIP ; 分子信标探针MB-16 ; 所述检测HPV18的引物组为： 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示的外引物F3 ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 7所示的外引物B3 ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 8所示的内引物FIP ; 核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 9所示的内引物BIP ; 分子信标探针MB-18 ; 所述反应体系包括以下组分：
2. 根据权利要求1所述的基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系，其特征 在于，所述反应体系包括以下组分：
3. 根据权利要求1或2所述的基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系，其 特征在于，所述反应缓冲液（2X)包括以下组分：
4. 根据权利要求1或2所述的基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系，其 特征在于，所述分子信标探针MB-16的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，所述分子信标探针 MB-18的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 10所示。
5. 根据权利要求4所述的基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系，其特征 在于，所述分子信标探针MB-16的核苷酸序列的5'端连接有荧光染料FAM，3'端连接有荧 光猝灭基团BHQ1。
6. 根据权利要求4所述的基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系，其特征 在于，所述分子信标探针MB-18的核苷酸序列的5'端连接有荧光染料R0X，3'端连接有荧 光猝灭基团BHQ2。
7. -种基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 、采用Axygen公司细菌基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的DNA ; (2) 、将待测样品的DNA加入到权利要求1-6任一项所述的反应体系中，56-65°C下，反 应30-90分钟进行LAMP反应； (3)、LAMP反应后，分别于4°C、65°C和95°C用紫外灯照射，观察荧光。
8.根据权利要求7所述的基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的方法，其特征在于， 步骤（2)中所述LAMP反应的反应条件为：60°C下，反应60分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种基于LAMP和分子信标检测HPV16和18的反应体系和方法，所述反应体系包括检测HPV16和HPV18的外引物F3、B3、和内引物FIP、BIP、和分子信标探针MB-16、MB-18。本发明的检测HPV16和18的方法基于LAMP和分子信标技术检测HPV病原体，该方法在传统LAMP技术的基础上利用分子信标探针在不同温度下发出荧光强度的差异对LAMP扩增产物进行检测，与传统的LAMP技术相比，本发明可避免传统LAMP技术因为引物自身杂交所造成的假阳性结果，具有特异性强，操作简单的优点。
【IPC分类】C12Q1-68, C12R1-93, C12Q1-70
【公开号】CN104805218
【申请号】CN201510154708
【发明人】钟田雨, 黄劭
【申请人】赣南医学院第一附属医院, 江西贤聚景欣医药生物科技有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年4月2日