人用布氏菌弱毒疫苗株104m的快速检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种人用布氏菌弱毒疫苗株104M的 Taqman-MGB荧光定量PCR快速检测方法。
【背景技术】
[0002] 布氏菌病（简称"布病"）是由布氏菌引起的一种重要的人畜共患传染病。人感染 布病后，急性期表现为间歇热、乏力、多汗、肌肉和骨关节疼痛及神经痛等；部分患者会转化 为慢性布病，症状为惯性疲劳、抑郁，体重减轻和反应性关节炎，反复发作，且可终身带病。 近年我国人间和畜间布病发病率都有不同程度回升，严重威胁人类健康和畜牧业发展。
[0003] 弱毒疫苗免疫是防控布病的重要手段，我国人用疫苗为布氏菌弱毒疫苗株104M。 该疫苗于1965年开始应用，是目前我国唯一的人用布病疫苗，其使用对象主要是屠宰、放 牧、皮毛加工等重点职业人群，研宄显示通过免疫可有效降低布病发病率。但弱毒疫苗的使 用可对布病的诊断和监测造成干扰。因此，实现弱毒疫苗与野生菌株的鉴别，对于布病防控 工作具有重要现实意义。
[0004] 弱毒疫苗株的鉴别包括血清抗体和病原检测两个方面。104M为光滑型菌株，其 LPS含有O-侧链，能刺激机体产生抗体，但也使常规血清学检测方法难以区分疫苗免疫与 自然感染。病原分离鉴定，所需营养条件复杂，分离培养需在P2级以上生物安全实验室进 行，且难以区分104M与同生物型的其它菌株，限制其广泛应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种人用布氏菌弱毒疫苗株104M的Taqman-MGB荧光定量 PCR快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。
[0006] 本发明首先提供一种用于检测人用布氏菌弱毒疫苗株104M的引物组，引物信息 如下：
[0007] Dsba-F:GGACATAACGAACATTCGGATCT(SEQ ID ΝΟ:1)
[0008] Dsba-R:TCGATTACAATTGCGGCTATTG(SEQ ID NO :2)
[0009] Dsba-P:ATCGCTTCCATGTCG(SEQ ID NO :3)
[0010] 其中Dsba-P的Y端用FAM进行标记；3'端用MGB进行标记。
[0011] 本发明还提供一种利用上述的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组检测104M株的方 法，包括有如下的步骤：
[0012] 1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒（QIAGEN公司）提取 细菌DNA ;
[0013] 2) Taqman-MGB荧光定量PCR步骤：根据本发明设计104M株的Taqman-MGB荧光 定量PCR引物组，加入反应体系中各组分。反应程序：95°C 3min;95°C 5s，56°C 10s，72°C 10s，在72°C进行FAM荧光信号采集，进行40个循环。
[0014] 3)结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。
[0015] 另一方面，本发明的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组可用于制备检测试剂盒。
[0016] 本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：在I. 5h的时间里，即可完成扩增， 扩增模板的最低检出限为1.0 X l〇_4ng/ μ 1 ;2)特异性强：采用MGB标记的荧光探针，特异 性针对104Μ基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及 常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；3)操作简便：配置好的Taqman-MGB荧光定量PCR 反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖 凝胶电泳鉴定；4)高通量：根据荧光定量PCR仪的检测孔数量，可以一次性实现48~384 个样品的检测。
【附图说明】
[0017] 图1 :阳性结果荧光扩增曲线图，其中：曲线1.阳性对照，即104Μ基因组的荧光扩 增曲线；曲线2.阴性对照，即水的荧光扩增曲线。
[0018] 图2 !Taqman-MGB荧光定量PCR方法检测104Μ基因组DNA的灵敏度检测荧光扩 增曲线图，其中：曲线1-8. 104Μ基因组DNA的质量浓度分别为lng/yLLOXUrtig/yl， I. 0 X l(T2ng/ μ I，I. 0 X l(T3ng/ μ I，I. 0 X l(T4ng/ μ I，I. 0 X l(T5ng/ μ I，I. 0 X l(T6ng/ μ 1 ; 曲线8.阴性对照。
[0019] 图3 !Taqman-MGB荧光定量PCR方法检测104Μ基因组DNA的特异性检测荧光扩增 曲线图，其中：曲线 1，Brucella suis biovar I S1330;曲线 2, B.suis biovar 2 Thomsen; 曲线 3，B.suis biovar 3 686;曲线 4，B.suis biovar 4 40;曲线 5，B.abortus biovar I A544;曲线 6, B. abortus biovar 2 86/8/59;曲线 7, B. abortus biovar 3 Tulya ;曲 线 8, B. abortus biovar 4 292 ;曲线 9, B. abortus biovar 5 B3196 ;曲线 10, B. abortus biovar 6 870;曲线 11，B. abortus biovar 7 63/75;曲线 12，B. abortus biovar 9 C68; 曲线 13，B.melitensis biovar I 16M;曲线 14，B.melitensis biovar 2 63/9;曲线 15，B. melitensis biovar 3 Ether;曲线 16, B.ovis 63/290;曲线 17, B.canis RM6/66;曲线 18, B. neotomae 5K33 ;曲线 19, S2 ;曲线 20, A19 ;曲线 21，M5-90 ;曲线 22, Escherichia coli K99;曲线 23，Pasteurella multocida (M8-1 ;曲线 24，Streptococcus suis ST171 ; 曲线25, Pseudomonas aeruginosa DI-I ;曲线26，阳性对照；曲线27,阴性对照。
【具体实施方式】
[0020] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP)指单个核苷酸替代、插 入或缺失而形成的分子形态，SNP位点广泛应用于耐药性基因、细菌及病毒种型区分等研宄 中。应用SNP位点的差异，布氏菌弱毒疫苗株S19、Revl、RB51已建立相应的分子鉴别方法。 但目前，尚缺乏104M株特异快速的分子鉴别方法。基于Taqman-MGB探针的荧光定量PCR 方法检测特异、敏感，可区分SNP位点的差异，通过其检测104M株独特的SNP位点，可实现 104M与野生菌株的快速鉴别。
[0021] 下面结合实施例对本发明的方法进行详细的描述。
[0022] 一、用于检测104M的Taqman-MGB荧光定量PCR引物组的设计
[0023] 本发明首先对 Shikimate kinase ABC transporter (Abc)、Conserved hypothetical protein (Chp)、Bacterial regulatory protein LysR(Lysr)等十余个布氏 菌毒力及宿主亲嗜性相关基因，以104M基因组DNA为模板进行了扩增测序，再利用生物信 息学软件 BLAST 和 DNAstar，将有关序列与 Genbank 中 B.melitensis M28、B. suis S1330、 B.pinnipedialis B2/94、B. microti CCM 4915、B.canis ATCC 23365、B. ovis ATCC 25840 等16株布鲁菌基因组的相关序列进行比较，分析筛选104M特异的SNP位点。经上述筛选， 本发明获得DSBA oxidoreductase (Dsba)基因上一处104M株特异的SNP位点。依据Dsba 基因上104M株特异的SNP位点，在其两翼用Primer Express软件进行引物与探针设计。设 计合适的引物是进行PCR反应的关键，通过考虑碱基组成、GC含量、二级结构的形成、Tm值 等因素来设计检测104M株的Taqman-MGB荧光定量PCR反应的引物及探针。其中，引物用 于扩增Dsba片段基因，探针用于检测该Dsba片段基因中SNP位点存在与否。应用上述引 物及探针进行检测时，当布氏菌基因组DNA中，存在SNP位点时，扩增后出现荧光扩增曲线， 可判定该模板来源于104M株；当布氏菌基因组DNA中不含SNP位点或模板本身为非布氏菌 时，扩增后不出现荧光扩增曲线。引物及探针由Invitrogen公司合成。引物及探针如表1 所示：
[0024] 表1 : 104M株的Taqman-MGB荧光定量PCR引物及探针
[0025]
【主权项】
1. 一种用于检测人用布氏菌弱毒疫苗株104M的引物组，其特征在于，所述的引物组的 序列信息如下： Dsba-F:GGACATAACGAACATTCGGATCT, Dsba-R:TCGATTACAATTGCGGCTATTG、 Dsba-P:ATCGCTTCCATGTCG。
2. 如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的Dsba-P的5'端用FAM进行标记。
3. 如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述的Dsba - P的3'端用MGB进行标记。
4. 权利要求1所述的引物组在检测布氏菌弱毒疫苗株104M中的应用。
5. -种利用权利要求1所述的引物组检测布氏菌弱毒疫苗株104M的方法，其特征在 于，所述的方法包括有如下的步骤： 1) 待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA ; 2. CyCleaVe PCR步骤：将权利要求1所述的引物组加入到反应体系中，反应程序为 95°C 30s ;95°C 5s，55°C 10s，72°C 20s，在72°C进行FAM荧光信号采集，进行40个循环； 3) 结果检测：根据荧光扩增曲线情况，判定检测结果。
6. -种检测布氏菌弱毒疫苗株104M的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利 要求1所述的引物组。
【专利摘要】本发明的目的是提供一种人用布氏菌弱毒疫苗株104M的Taqman-MGB荧光定量PCR快速检测方法。本发明用于检测人用布氏菌弱毒疫苗株104M的引物组，其序列为SEQ ID NO：1-3。本发明引物组的高效灵敏：在1.5h的时间里，即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10-4ng/μl；特异性强：采用MGB标记的荧光探针，特异性针对104M基因组产生荧光扩增信号，而对其它种、生物型的布氏菌、布氏菌弱毒疫苗及常见非布氏菌株，不产生荧光扩增信号；操作简便：配置好的Taqman-MGB荧光定量PCR反应体系，置于荧光定量PCR仪中即可完成整个扩增及结果判定过程，不需要通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。
【IPC分类】C12R1-01, C12Q1-68, C12N15-11, C12Q1-04
【公开号】CN104805215
【申请号】CN201510254878
【发明人】陈义平, 南文龙, 王勇, 巩明霞, 张风霞, 张悦勇
【申请人】中国动物卫生与流行病学中心
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月19日