一种希氏乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种希氏乳杆菌，该菌株为希氏乳杆菌Lactobacillus?hilgardii，系从废米浆水中筛选得到，该菌株于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC?No.8098。该菌株经活化和高密度培养后，可制备成直投式发酵剂。本发明得到的希氏乳杆菌及其直投式发酵剂可用于黄酒的酿造，使生产过程可控，受季节性影响小，操作简单、方便，对于黄酒酿造工艺的革新具有重要意义。
【专利说明】一种希氏乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用，特别是一种希氏乳杆菌及其在黄酒酿造中的应用。
【背景技术】[0002]黄酒主要是以谷物(南方主要是以糯米，北方是黍米和玉米)为原料，以麦曲为糖化剂，以黄酒酵母或活性干酵母为发酵剂，经浸米、蒸煮、糖化、发酵、压榨、过滤、煎酒、贮存、勾兑而成的一种低酒度的发酵原酒。按照生产工艺可以分为传统黄酒和机械化黄酒生产工艺，而传统黄酒工艺的特色在于“冬浆冬水”和“长时间浸米”。
[0003]将浸米浆水加入到黄酒发酵醪中酿制黄酒是传统黄酒工艺的特色，但是长时间的浸米工艺却给黄酒生产带来了不少了难题。一方面，传统黄酒的浸米需要占用大量的浸米场地和浸米容器，并且浸米主要是在露天环境下进行的，这样在浸米过程会网罗空气中的所有微生物，在经过长时间的浸米后，浸米水的表面会呈现白膜，主要有霉菌、野生酵母菌和醋酸菌等多种细菌；此种方式导致浸米浆水中既存在有利的微生物，也存在有害的微生物，所以浸米浆水的好坏直接决定了黄酒发酵的成败，这也是导致传统黄酒发酵不易控制，黄酒品质不稳定的主要原因。另一方面，经过长时间浸米后，原料米表面的糊粉层会进入到米浆水中，并随米浆水进入发酵醪中，糊粉层中的蛋白质会在麦曲混合酶及其他酶系的作用下产生大量的氨基酸，而大量的氨基酸会使黄酒的口感粗糙，甚至影响风味，在追求黄酒“淡、干、爽”的趋势下，这一弊端会更加突出，所以胡普信提出应该降低浸米浆水的使用量，尤其是应该摒弃对陈米浸米浆水的使用。第三，长时间的浸米会产生大量的含有高浓度B0D5、CODCr的浸米浆水，据统计，生产I吨黄酒，将产生2吨浸米浆水，一个年产5万吨的黄酒企业，至少产生10万吨的米浆废水。而这些浸米浆水只有部分能被利用，其余的将作为污水排出，排出的废水会严重的污染水资源，导致鱼类大量死亡，还可能导致水的富营养化。据测定，绍兴某年产5万吨的黄酒厂生产过程中浸米浆水的B0D5达到25000mg/L，CODCr达到60000mg/L，属于高浓度的有机废水，不符合排放标准。若将这些浸米浆水进行处理，又会产生巨大的费用:每年对浸米浆水的处理费用高达22.5万元；处理设施投入需要200多万元；设备折旧加上运行费用，每年要支出40多万元。
[0004]所以，针对传统黄酒浸米浆水存在的上述问题，有必要通过一定的方式摒弃对传统黄酒浸米浆水的使用，但是目前无法解决在摒弃使用浸米浆水后能保证黄酒发酵顺利进行的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种能够用于黄酒酿造的乳酸杆菌菌株。为实验上述内容，本发明提供该菌株的菌株保藏信息如下:分类学命名为希氏乳杆菌Lactobacillus higardii,于2013年9月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8098，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0006]本菌株采集自浙江绍兴某黄酒酿造企业排放的米浆水。将采集的进行梯度稀ffdo'io'io'io'io'io'io—7)对样品进行稀释，用无菌移液枪各取0.2mL不同浓度的稀释液，均匀涂布在固态番茄汁碳酸钙培养基、改进M17培养基和MRS培养基上，在30°C的恒温培养箱中倒置培养2-3d。固态番茄汁碳酸钙培养基:牛肉膏10g，酵母膏10g，蛋白胨IOg,葡萄糖5g,吐温800.5g,番爺汁200g,碳酸?丐20g,琼脂20g,蒸懼水IOOOmL,PH6.5-6.8，115°C灭菌20min ;改进M17培养基:植物蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g，牛肉提取物5g，乳糖3g，抗坏血酸0.5g，K2HP045g,甘油1%，MgSO4.7H200.25g，磷酸甘油二钠 1.9g，琼脂 20g，蒸馏水 IOOOmL,溴甲酚紫 0.04g, ρΗ6.8-7.0，12--灭菌 15min ；MRS固态培养基:蛋白胨10g，琼脂1.5%-2.0%，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二铵2g，K2HP042g，MgSO4.7H200.lg, MnSO4.H2O0.05g,葡萄糖 20g,无水乙酸钠 5g,吐温 801.0mL,蒸懼水IOOOmL, ρΗ6.2-6.4，115°C灭菌 20min。
[0007]本发明提供的菌株接触酶实验呈阴性、革兰氏染色呈阳性，不产生吲哚，不还原硝酸盐，能利用葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖、蔗糖。该菌株在显微镜下观察，从图1和图2可以看出，菌株的菌落为圆形、乳白色、边缘光滑、透明。经革兰氏染色后镜检观察:菌株HJ122为长杆状，成对出现，有时呈链状。
[0008]本发明菌株希氏乳杆菌Lactobacillus higardii采用MRS固态培养基进行活化。
[0009]本发明还提供了一种应用上述希氏乳杆菌Lactobacillus higardii酿造黄酒的方法。在实验室条件下将希氏乳杆菌Lactobacillus higardii活化培养与扩大培养,然后，在不改变其它传统黄酒工艺的前提下(前发酵温度30°C，时间5-7d ;后发酵温度20°C，时间23-25d)，将扩大培养的菌液接种到黄酒发酵醪液中。本发明不仅能够减少黄酒传统酿造工艺中的浸米工艺以及减少酿造过程中米浆水的排放量，并且较好地保持了黄酒的风味品质，与传统工艺黄酒品质差别不大。希氏乳杆菌Lactobacillus higardii应用于黄酒酿造可以采用直接接种的方法，这种方法实现了乳酸菌酿造黄酒工艺的可控性，操作简单、投入小。
[0010]本发明提供的希氏乳杆菌Lactobacillus higardii可进一步制备成直投式发酵剂。具体如下:利用自动发酵罐对希氏乳杆菌Lactobacillus higardii进行高密度培养，发酵罐各部分经过灭菌后，设置培养温度30°C、pH6.1-6.2及转速100r/mim，加入培养基并接入菌种，进行发酵13-14小时，然后经浓缩，冷冻干燥制成直投式发酵剂。
[0011]与现有技术相比，本发明的有益效果是:(1)提供了新的乳酸杆菌属菌株:希氏乳杆菌Lactobacillus higardii ； (2)从废米衆水中筛选到希氏乳杆菌Lactobacillushigardii,不会对人体、生态环境造成损害,符合安全规定；(3)希氏乳杆菌Lactobacillushigardii可用于黄酒酿造；(4)希氏乳杆菌Lactobacillus higardii酿造黄酒,生产过程可控，受季节性影响小，操作简单、方便；(5)通过本技术的实施，节省了传统酿造工艺的浸米工艺，减少了浸米水的使用，降低了污水处理成本和设备配套。[0012]应用本发明提供的希氏乳杆菌发酵24小时后发酵液pH可降低至4.7，收集发酵液，经HPLC检测发酵液中的乳酸含量达到14g/L。
【专利附图】
【附图说明】[0013]图1为希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii在M17培养基培养基上的菌落特征
[0014]图2为希氏乳杆菌Lactobacillus hilgardii的菌体形态
【具体实施方式】
[0015]实施例1培养基及菌液的制备
[0016](一)培养基的制备
[0017]MRS固态培养基:蛋白胨10g，琼脂1.5%-2.0%，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二铵2g, K2HP042g, MgSO4 *7H200.lg，MnSO4.H2O0.05g，葡萄糖 20g，无水乙酸钠 5g，吐温 801.0mL,蒸馏水 IOOOmL, pH6.2-6.4，115°C灭菌 20min。
[0018]液体扩大培养基:蛋白胨5g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二铵2g，K2HP042g,MgSO4 ? 7H200.lg, MnSO4 ? H2O0.05g,葡萄糖 25g,无水乙酸钠 5g,吐温 801.0mL,蒸懼水IOOOmL, pH6.2-6.4，115°C灭菌 20min。
[0019](二)菌液的制备
[0020]将希氏乳杆菌Lactobacillus higardii接种至活化培养基中活化48h,待用；利用自动发酵罐对希氏乳杆菌Lactobacillus higardii进行高密度培养,发酵罐各部分经过灭菌后，设置培养温度30°C、pH6.1-6.2及转速100r/mim，加入培养基并接入菌种，进行发酵13-14小时，然后经25000g离心30min冷冻离心制备高密度菌液。
[0021]实施例2直投式发酵剂的制备
[0022]在每一冻干瓶中吸ImL灭菌的10%脱脂乳作为悬浮基质，冻干保护剂为:脱脂奶粉10%，甘油 30mL ? L—1，麦芽糊精 IOOg ? L—1，海藻糖 250g ? L-1，L-谷氨酸钠 30g ? L-1 ;115°C高压蒸汽灭菌15min ;取ImL菌体细胞移入冻干瓶中，充分混匀制成菌悬液；然后将制备好的菌悬液置于_76°C超低温冰箱预冻120-150min ;预冻后，迅速转移至真空冻干机样品架，冻干12h,得到冻干希氏乳杆菌(Lactobacillus higardii)粉。
[0023]实施例3
[0024]将冻干直投式发酵剂接种黄酒发酵醪中发酵。干粉投入的量根据存活菌数计数结果，使起始浓度与液体发酵剂按0.1%-2%的接种量接入发酵醪中起始浓度相同，然后按黄酒发酵工艺进行发酵(前发酵温度30°C，时间5-7d ;后发酵温度20°C，时间23-25d)，最后对黄酒的各项理化指标进行检测。
[0025]成品黄酒检测理化指标:
[0026]氨基酸态氮≥0.6g/L 糖(以葡萄糖计)18-45g/L
[0027]总氨基酸≥14mg/mL总酸(以乳酸计)≤(5.0g/L
[0028]酒精度(2(TC)≥ 12%vol pH 值 3.5-4.5
[0029]非糖固形物≥13g/L
[0030]可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种希氏乳杆菌(Lactobacillus higardii),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.8098，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述希氏乳杆菌在制备直投式发酵剂中的应用。
3.权利要求1所述希氏乳杆菌在黄酒酿造中的应用。
4.权利要求3所述的方法，其特征在于:是将活化和扩大培养后的希氏乳杆菌Lactobacillus higardii 应用于黄酒酿造。
5.权利要求4所述方法，其特征在于所述希氏乳杆菌液体活化用培养基为:蛋白胨IOg ;牛肉膏 IOg ;酵母膏 5g ;柠檬酸二铵 2g ；K2HP042g ；MgS04 ? 7H200.1g ；MnS04 ? H2O0.05g ；葡萄糖20g ;无水乙酸钠5g ;吐温801.0mL ;蒸懼水IOOOmL ；pH6.2-6.4,115°C灭菌20min。
6.权利要求4所述方法，其特征在于所述希氏乳杆菌扩大发酵用液体培养基为:蛋白胨 5g ;牛肉膏 IOg ;酵母膏 5g ;柠檬酸二铵 2g ；K2HP042g ；MgS04 WH2O0.1g ；MnS04 -H2O0.05g ；葡萄糖25g ;无水乙酸钠5g ;吐温801.0mL ;蒸懼水IOOOmL ；pH6.2-6.4,115°C灭菌20min。
7.根据权利要求4-6 任一所述的方法，其特征在于所述希氏乳杆菌接种量为1%-2%。
【文档编号】C12N1/20GK103451134SQ201310407725
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】毛健, 孟祥勇, 姬中伟, 刘云雅 申请人:江南大学