专利名称：益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性、定量测定方法
益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性、定量测定方法技术领域：
本发明涉及含有益生菌的乳制品技术领域。更具体地，本发明涉及一
种在益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌Uflcto6ac/〃ws rew&n')的快速定性、 定量测定方法。背景技术：
益生乳制品因其丰富的营养价值和特殊的益生功效成为人们关注的 热点。目前市场上益生菌及含有益生菌的乳制品种类繁多，并且每年以高 速度增长。对其质量的监管和认证，尤其在定性、定量检测方面缺乏科学、 合理、快速的方法。传统方法中对益生菌的定性、定量检测，仍采用生理 生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的方法。传统方法易受培养条 件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，而且受外界环境因素和培养基 性能的影响大，检测结果缺乏稳定性和可靠性，且耗时耗力。PCR技术一 经出现就被广泛应用于分子生物学和微生物学等领域。实时焚光定量PCR (Real-time PCR)的出现更是实现了 PCR技术从定性到定量的飞跃，避免 了传统PCR定量鉴定中交叉污染的问题。具有特异性强、重复性好、准 确、快速等优点，成为了分子生物学和微生物学领域定量检测的重要方法。 采用乳杆菌种属特异性PCR和实时荧光定量PCR技术，建立简便、快速、 准确的益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的定性、定量测定方法，可以简化益 生菌的检测程序、提高检测效率，能提高我国益生菌的检测能力，完善保 健食品的质量监管，并为益生菌产业的长远发展提供技术保障。
本发明针对益生菌乳制品中含有的罗伊氏乳杆菌，依据参考文献自行 设计罗伊氏乳杆菌的16SrRNA基因序列的种属特异性引物，应用此引物 进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图 谱分析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立益生菌乳制品中罗伊氏乳杆 菌的筒〗更、快速、准确的定性和定量测定方法。
发明内容[要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性 方法。
本发明的另 一个目的是提供一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快 速定量方法。
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性测定方法。
该方法的步骤如下
A、模板DNA的制备
(1 )取益生菌发酵乳样品于2.0mL离心管中，加入500|iL TE緩冲 液，混合均匀，再置于液氮中进行冻结，冻结后取出放入65。C水浴中进行 i!虫4匕4-6min, :^jt匕Hii《亍冻il虫3-5 ^欠；
(2)冻融结束后，往其中加入60.0^iL10。/q (质量体积比)的SDS和 10.0pL 10mg/mL蛋白酶K,在摇床中在温度37。C下以200r/min进行摇动 4h;
(3 )加入100.0|iL 5M NaCl和lOO[iL CTAB/NaCl溶液(将4.1gNaCl 溶于80ml水中，再緩慢加入10gCTAB得到的溶液)，65。C水浴10min。
(4) 然后，加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异 戊醇混合物，它们的体积比分别是25: 24: 1，混勻，再以10000g/min离 心1 Omin,该溶液分成上层水相、中间固相与下层有才几相；
(5) 吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯氯仿和异戊醇 混合物抽提一次，分离上清液；
(6 )往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积 的冰异丙醇，混合均匀静置30min，以10000g/min离心5min得到总DNA 沉淀；
(7)所述沉淀用70体积比％乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然 干燥，得到才莫板DNA;然后加入50.(HiL无菌超纯水回溶，在温度-20。C下 保存备用。B、 PCR扩增
反应体系25.0|iL: 2.5jiL 10xPCRBuffer、 l.OpL 25mmol/L Mg2+、 2^L 2.5mmol/L dNTPs、 2.5pL 5mmol/L上下游引物、1 .OpL 50ng/pL DNA模板， 0.25 uL 5U/(iL Taq酶，二次蒸馏水补足至25.0 pL;
PCR反应条件95。C预变性3min; 95。C变性40S, 56。C退火30S, 72°C 延伸lmin,循环40次；72 。C延伸8min,得到PCR扩增产物，在温度4。C 下保存；
取3.0|iL PCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行检测；
C、 结果及判断
检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为4莫4反为阳性对照，以 灭菌水作为模板为阴性对照；根据在740bp处出现预期特征条带，确定该 益生菌乳制品中含有罗伊氏乳杆菌，相反地则不含有罗伊氏乳杆菌。 在本发明中，所述的上下游引物分别是 上游引物REf为5 ， -GATTGACGATGGATCACCAG-3 ，； 下游引物REr为5' -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3',扩增片断长 度为740bp。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的检测是在5V/cm的电压下进 行电泳20-30min,再用EB染色，然后进行紫外照相。
本发明还涉及一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定量测定方 法。该方法的步骤如下
A、 样品总RNA的制备
采用Trizol法提取发酵乳制品总RNA，发酵样品500mg在盛有液氮 的研钵中研磨后，迅速加入lmL Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书提取 样品RNA。然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染， 得到纯化的RNA样品，使用微量紫外分光光度仪测定浓度，采用1%琼 脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，然后将样本保存于-8(TC;
B、 反转录扩增
反应体系lO.OjiL: 2.0jiL 5 x PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、 0.5pL PrimerScript RT Enzyme Mix I、 0.5jiiL Random 6 mers(100 jiM)、总RNA ( <500 ng), RNase Free dH20补足至10.0
反转录扩增反应条件37匸反应15min; 85。C变性5S，在温度-20。C下 保存；
C、 实时荧光定量PCR
反应体系25.0 12.5pL 2xSYBR Premix Ex TaqTM,各0.5jnL
1Ojamol/L上、下游引物RE饰REr， 2.0pLcDNA模板，9.5nLH20;
荧光定量PCR^应参数95。C变性25S; 95。C变性10S， 58。C退火22S， 40个循环；在温度4。C保存；每个样品重复3次；
D、 外标准品的制备和标准曲线的绘制
外标准品的制备提取含有以罗伊氏乳杆菌ZL12-1-1目的扩增片断的 质粒pRET的DNA,紫外分光光度计测定A值后，计算出拷贝数，进行IO 倍系列稀释，梯度稀释至10M0"拷贝数/!iL的浓度，以此作为外标准品进 行荧光定量PCIL良应；
标准曲线的绘制以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR 反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到罗伊氏乳杆菌的 标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准；
E、 结果及判断
以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用罗伊氏乳杆菌的种特异 性引物，以相同的体系同时进行罗伊氏乳杆菌的16S rRNA的基因片段的荧 光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行益生菌乳制品中罗 伊氏乳杆菌的快速定量检测。
在本发明中，所述罗伊氏乳杆菌种属特异性《1物序列如下
上游引物REf为5， -GATTGACGATGGATCACCAG-3';
下游引物REr为5， -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3，，扩增片断长 度为740bp。
下面将详细地说明本发明。
本发明涉及一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性测定方法。 采用液氮冻融-CTAB法抽提样品中益生菌总DNA和纯培养乳酸菌的 总DNA。所述的液氮冻融-CTAB法是一种本技术领域的技术人员熟知的
8方法，主要是利用CTAB緩冲液提取生物DNA的方法。
该方法的步骤如下
A、模板DNA的制备 (1 )取益生菌发酵乳样品于2.0mL离心管中，加入500|aL TE緩冲 液，混合均匀，再置于液氮中进行冻结，冻结后取出放入65。C水浴中进行 融化4-6min,如ot匕反复进^f亍冻融3-5次。
所述的TE提供一个緩冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螫合Mg^或 Mn"离子，抑制DNase活性；
(2)冻融结束后，往其中加入60.0jiL质量体积比为10%的SDS和 IO.OjiL 10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37。C下以200r/min进行摇动 4h;
所述的SDS是十二烷基硫酸钠，它是日本关东化学株式会社以商品 名SDS销售的产品。
所述的蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶。它切割脂族氨 基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键，用于生物样品中蛋白质的降解。这种 酶经纯化去除了 RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中 稳定，还具有降解天然蛋白质的能力，因而它应用很广泛。本发明使用的 蛋白酶K是AMRESCO公司以商品名Proteinase K销售的产品。
所述的摇床是上海智城分析仪器制造有限公司以商品名ZHWY-200D 恒温培养振荡器销售的产品。
(3 )加入lOO.O]iL 5M NaCl和100|iL 10°/。CTAB溶液(将4.1gNaCl 溶于80ml水中，再緩慢加入10g CTAB得到的溶液)，65。C水浴10min。
所述的NaCl提供一个盐环境，使DNA充分溶解而存在于液相中。
所述的CTAB为十六烷基三曱基溴化铵，是一种阳离子去污剂，具有 从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋 白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白 质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。最 后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
(4)然后，加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它们的体积比分别是25:24:1 ，混匀，再以10000g/min离心 10min，该溶液分成上层水相、中间固相与下层有4几相。
(5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯酚、氯仿和异 戊醇混合物抽提一次，分离上清液。
(6 )往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积 的水异丙醇，混合均匀，再静置30min,以10000g/min离心5min,得到 总DNA沉淀；
(7 )所述沉淀用70体积％乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干 燥，得到模板DNA;然后加入50pL无菌超纯水回溶，在温度-20。C下保 存备用。
B、 PCR扩增
PCR扩增是一种体外高效复制DNA的技术，该技术几乎贯穿于现在 分子生物学的各个领域。PCR体系由模板、特异性引物、高温聚合酶、脱 氧核糖核酸几部分组成。PCR扩增过程可以分模板高温变性、引物与模板 低温退火、引物在高温聚合酶的作用下延伸。
该反应体系25.0pL: 2.5pL 10xPCRBuffer、 l.OpiL 25mmol/L Mg2+、 2jnL 2.5mmol/L dNTPs、 2.5|iL 5mmol/L上下游引物、1 .OpL 50ng/|uLDNA模板， 0.25 uL 5U/|iL Taq酶，二次蒸馏水补足至25.0 pL。 在本发明中，所述的上下游引物分别是 上游引物REf为5， -GATTGACGATGGATCACCAG-3，； 下游引物REr为5， -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3'，扩增片断长 度为740bp。
PCR反应条件95。C预变性3min; 95。C变性40S， 56。C退火30S, 72°C 延伸lmin，循环40次；72 。C延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度4°C 下保存；
取3.0pLPCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行检测。琼脂糖凝胶电泳图 谱分析是使用UVP^^司以商品名CDS-8000凝胶成像仪销售的仪器进行 的。
C、 结杲及判断检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为阳性对照模板，以灭 菌水作为阴性对照模板；根据在740bp处出现预期特征条带，确定该益生 菌乳制品中含有罗伊氏乳杆菌，相反地则不含有罗伊氏乳杆菌。具体可参 见附图1。
本发明还涉及一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定量测定方 法。该方法的步骤如下 A、样品总RNA的制备
采用Trizol法提取发酵乳制品总RNA，发酵样品500mg在盛有液氮的 研钵中研磨后，迅速加入lmL Trizol试剂，按Trizol试剂说明书提耳又样品 RNA。然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到 纯化的RNA样品，测定浓度，在温度-80。C下保存；
所述的Trizol试剂是由Invitrogen公司专供提取RNA的产品；DNase I 是TaKaRa公司产品；此过程中使用的氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂是天 津市化学试剂三厂生产的产品。
RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，用DEPC-dH20溶解的 RNA样品可以直接用NanoDr叩-1 OOO微量紫外分光光度计测在260nm波长 处的RNA浓度和纯度，DEPC-H20为空白对照，RNA浓度可以直接读数， RNA纯度通过OD26(V28。来检测。若比值在1.9-2.1间，认为纯度较好，比值 小于1.8说明有杂蛋白质较多；比值大于2.2,则表明RNA已经降解。
RNA完整性通过1 %琼脂糖凝胶电泳^r测。
B、 反转录扩增
反应体系10.0pL: 2.0piL 5 x PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、 0.5jaL PrimerScript RT Enzyme Mix I、 0.5pL Random 6 mers(100 nM)、总眺 (<500ng)， RNaseFreedH2O补足至10.0nL;
反转录扩增反应条件37。C反应15min; 85。C变性5S,在温度-20。C下 保存；
C、 实时荧光定量PCR
反应体系25.0)LiL: 12.5)iL 2><SYBR Premix Ex TaqTM ，各0.5)iL
10nmol/L上、下游引物REff口REr, 2.0pLcDNA模板，9.5nLdH20;荧光定量PCR^应参数95。C变性25S; 95。C变性10S, 58。C退火22S, 40个循环；在温度4。C保存；每个样品重复3次；
D、 外标准品的制备和标准曲线的绘制
夕卜标准品的制备提耳又含有以罗伊氏乳杆菌丄Wo&c/〃w ZL12-1-1目的扩增片断的质粒DNA，紫外分光光度计测定A值后，计算出 拷贝数，进行10倍系列稀释，梯度稀释至10、l()S拷贝数/uL的浓度，以此 作为外标准品进行荧光定量PCR反应；
标准曲线的绘制将外标准品进行10倍系列稀释，使其成为具一定梯 度拷贝数含量的模板，以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR 反应过程中到达焚光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到罗伊氏乳杆菌的 标准曲线(参见附图2),作为待测样品定量测定提供参照标准；
E、 结果及判断
以待测样品的cDNA和标准品的DNA为模板，用罗伊氏乳杆菌的种特 异性引物，以相同的体系同时进行罗伊氏乳杆菌的16S rRNA的基因片段的 荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值进行益生菌乳制品中 罗伊氏乳杆菌的快速定量检测。
实时荧光定量PCR图谱分析是使用Bio-Red公司以商品名iQTM5销售的 仪器进行的。
在本发明中，所述罗伊氏乳杆菌种属特异性引物序列如下 上游引物REf为5， -GATTGACGATGGATCACCAG-3'; 下游引物REr为5' -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3'，扩增片断长 度为740bp。
本发明益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌快速定量测定方法的误差分析 如下
与传统的PCR相比，定量PCR更加快速、灵敏，并能有效地减少实验 过程中产生的交叉污染。由于定量PCR具有特异性强、4s丈感性高、精确性 好的优点，所以其操作每一过程都可能造成定量PCR实验结果的可靠性 差。如样本采集和存储、提取RNA、定量PCR检测过程的加样等，所以 应用定量PCR技术时，务必做到实验的标准化、合理化、细致化和有效化，使定量PCR技术更好地为我们服务。
标准品的制备是建立实时荧光定量PCR的关键环节，常用的标准品有 三种构建方法:一是按照扩增片段序列人工合成一段寡核苷酸；二是回收纯 化含有荧光定量PCR扩增片段的常规PCR扩增产物；三是将含有荧光定量 PCR扩增片段克隆到质粒中回收质粒。本发明选择第三种方法，构建了含 有目的条带的重组质粒作为标准品，以此为标准品制作标准曲线对未知样 品的绝对量(拷贝数)进行测定。 [有益效果]
本发明的有益效果是
可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定 量检测益生菌乳制品中的罗伊氏乳杆菌，整个过程对益生菌乳制品中罗伊 氏乳杆菌的检测程序简单、检测效率高、准确性好。
经罗伊氏乳杆菌的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验 结果见图1。泳道1以含有目的扩增片断的质粒pRET作为阳性对照，泳 道2以灭菌水作为阴性对照。 一般认为阳性特征在740 bp处出现预期扩增 条带，说明此样本中含有罗伊氏乳杆菌；阴性对照无特征条带。泳道3-4 为从西藏采的自然发酵乳25#和36#样本，结杲为阴性说明这2份乳制品 中不含丄.ww&n'。泳道5 7为Z. ^M/en'外的其他种乳酸菌，结果为阴性， 说明引物特异性好，与预期结果一致。
图2、实时荧光定量检测罗伊氏乳杆菌的标准曲线。Ct值表示每个反 应管的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，研究表明，每个模板 的Ct和该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。 实施例1
益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性检测 该实施例使用含有目的扩增片断的质粒pRET作为阳性对照；dH20 作阴性对照；另外使用Z^"ok "'〃附ZL12-1-1 、从西藏采的传统发
13酵乳酸奶样25#、 /人西藏采的自然发酵乳酸奶样36#、丄.ATCC393、 丄.r/zamwosus 1.2134、丄.ac/tfop/zz7ws ATCC 4356和丄.p/awtorMm 1.2437 4乍为 样品进行。
所述的r/wm"osus 1.2134、丄./7/a"tonw 1.2437购自中国普通孩i生物 菌种4呆藏中心；丄.acftfopW/ws ATCC 4356、丄.case/ ATCC393购自美国 American Type Culture Collection;丄. wteW ZL12-1-1为内蒙古农业大学 "乳品生物技术与工程，，教育部重点实验室从酸奶中分离得到，保藏号为 IMAU10037。
a.模板DNA的制备
采用液氮冻融-CTAB法抽提样品DNA，具体步骤如下
(1) 取0.5g益生菌发酵乳样品或MRS培养基培养的乳酸菌(包括 L ^wten' ZL12-1-1 )于2.0mL离心管中，加入500|iLTE緩冲液，混合均 匀，再置于液氮中进行冻结，，冻结后取出放入65。C水浴中进行融化5min， 如此反复进行冻融4次；
(2) 冻融结束后，往其中加入60.0pL100/()(质量体积比)的SDS和 lO.O]iL 10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37。C下以200r/min进行摇动 4h;
(3 )加入lOO.O]iL 5M NaCl和100|iiL CTAB/NaCl (将4.1gNaCl溶于 80ml水中，再緩慢加入10gCTAB得到的溶液)，65。C水浴lOmin。
(4) 然后，加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异 戊醇混合物，它们的体积比分别是25:4:1，混匀，再以10000g/min离心 10min，该溶液分成上层水相、中间固相与下层有才几相；
(5) 吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯氯仿和异戊醇 混合物抽提一次，分离上清液；
(6 )往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积 的水异丙醇，混合均匀静置30min,以10000g离心5min得到总DNA沉 淀；
(7)所述沉淀用70体积°/。乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干 燥，得到模板DNA;然后加入50.0pL无菌超纯水回溶，在温度-20。C下保存备。
b. PCIU全测
反应体系25.0|iL: 2.5pL 10xPCR Buffer (含Mg2+)， 2jliL 2.5mmol/L dNTPs，共2.5pL 5mmol/L上下游引物(REf和REr )， l.OpL 50ng L DNA 模板，0.25piL 5U/(iL Taq酶(TakaRa)，用二次蒸馏水补足至25.0pL。将PCR 产物于1%琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min, EB染色，紫 夕卜才白照。
c. 将Z"cto6ac/〃附wwfe,/ ZL12-1-1的PCR产物与pMD18连4妾转化 DH5oc，获得阳性克隆子pRET。
d. 结果及判断
经罗伊氏乳杆菌的种属特异性引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验结 果见图l。泳道l以含有目的扩增片断的质粒pRET作为阳性对照，泳道2以 灭菌水作为阴性对照。 一般认为阳性特征在740 bp处出现预期扩增条带， 说明此样本中含有罗伊氏乳杆菌；阴性对照无特征条带。泳道3-4为从西 藏采的自然发酵乳25#和36#样本，结果为阴性说明这2份乳制品中不含 Z^ewten'。泳道5 7为丄.wwten'外的其他种乳酸菌，结果为阴性，说明引物 特异性好，与预期结果一致。
实施例2.
益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的定量测定
对实施例l中提到的不同样品进行了罗伊氏乳杆菌的定量测定。其测 定步骤如下
a. 样品总RNA的制备
采用Trizol法提取发酵乳制品500mg在盛有液氮的研钵中研磨后，迅 速加入lmL Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书提取样品RNA，然后用 DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样 品，按照本申请说明书说明的方法进行浓度测定，RNA完整性通过l。/。琼 脂糖凝胶电泳检测。
b. 反转录扩增
反应体系lO.OpL: 2.0pL 5 x PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、0.5pL PrimerScript RT Enzyme Mix I、 0.5pL Random 6 mers(100 /iM)、总腿 (<500 ng),認ase Free dH2O补足至10.0pL;
反转录扩增反应条件37。C反应15min; 85。C变性5S，在温度-20。C下 保存；
c. 实时荧光定量PCR
荧光定量PCR按照SYBR PrimeScriptTMRT-PCRKit(大连宝生物工程 有限公司，TaKaRa DRR063A)说明书进行。反应体系25.0)iL: 12.5pL SYBR Premix Ex Taq ( 2x )、各0.5jiL 10jimol/L上、下游引物(RE纤口 REr)、 2.0nLcDNA模板、9.5(^L二次蒸馏水。荧光定量PCRX应参数95°C 变性25S; 95。C变性5S, 58。C退火22S， 40个循环；在温度4。C保存。
d. 外标准品的制备和标准曲线的绘制
提取以含有目的扩增片断的质粒pRET总DNA，紫外分光光度计测 定A值后，计算出拷贝数，做10倍系列稀释，梯度稀释至109-102拷贝数 /uL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应。以不同拷贝数的 阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环 数(Ct)为纵坐标得到罗伊氏乳杆菌的标准曲线，见附图2。
e. 结果及判断
由图2可见，Ct值和拷贝数呈较好的线性关系，以模板初始拷贝数 的对数为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制出的焚光定量PCR标准曲线方 程:Y^3.583X+43 (Y代表Ct值，x代表模板初始拷贝数的对数)，模板初 始拷贝数的对数与Ct值之间线性相关系数为0.993,斜率为-3.583,所建 立的标准曲线符合Real-Time PCR定量的要求。
以待测样品的cDNA和标准品DNA为模板，用实施例1描述的罗伊 氏乳杆菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行罗伊氏乳杆菌的16S rRNA的基因片段的荧光定量PCR扩增。通过标准曲线和采用Bio-Red公 司的iQTM5多重实时荧光定量PCR仪的计算机软件分析进行益生菌乳制 品中罗伊氏乳杆菌的快速定量检测。这些样品的测定结果与分析误差结果 一并列于下表l中。
16表l丄.rew&n'发酵乳样品的Real-time测定结果样本单菌发酵又+SD拷贝数/g发酵乳丄.rew/er/ ZL12隱1-17.5±0.9由表1的结果清楚地表明，定量PCR能准确定量发酵乳中活性罗伊 氏乳杆菌。序列表
<110>内蒙古农业大学
<120>益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性、定量测定方法
<130>
<160> 2
<210> 1
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>对人工序列的描述本发明所设计和使用的上游引物REf。
<400> 1
GATTGACGAT GGATCACCAG 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>对人工序列的描述本发明所设计和使用的下游引物REr。
<400> 2
ACTACCAGGG TATCTAATCC 20
权利要求
1.一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A、模板DNA的制备(1)取益生菌发酵乳样品于2.0mL离心管中，加入500.0μL TE缓冲液，混合均匀，再置于液氮中进行完全冻结，冻结后取出放入65℃水浴中进行融化4-6min，如此反复进行冻融3-5次；(2)冻融结束后，往其中加入60.0μL 10％(质量体积比)SDS和10.0μL10mg/mL蛋白酶K，在摇床中在温度37℃下以200r/min进行摇动4h；(3)加入100.0μL 5M NaCl和100.0μL 10％CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10min；(4)加入与在步骤(3)得到的溶液等体积的苯酚、氯仿和异戊醇混合物，它们的体积比分别是25∶24∶1，混匀，再以10000g/min离心10min，该溶液分成上层水相、中间固相与下层有机相；(5)吸取上层水相，加入与所述水相等体积的上述苯酚、氯仿和异戊醇混合物抽提一次，分离上清液；(6)往所述的上清液中加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的冰异丙醇，混合均匀，再静置30min，以10000g/min离心5min，得到总DNA沉淀；(7)所述沉淀用70％(体积比)乙醇水溶液洗涤2次，再在室温下自然干燥，得到模板DNA；然后加入50.0μL无菌超纯水回溶，在温度-20℃下保存备用；B、PCR扩增反应体系25.0μL2.5μL 10×PCR Buffer、1.0μL 25mmol/L Mg2+、2.0μL2.5mmol/L dNTPs、2.5μL 5mmol/L上下游引物、1.0μL 50ng/μL DNA模板，0.25uL 5U/μL Taq酶，二次蒸馏水补足至25.0μL；PCR反应条件95℃预变性3min；95℃变性40S，56℃退火30S，72℃延伸1min，循环40次；72℃延伸8min，得到PCR扩增产物，在温度4℃下保存；取3.0μL PCR产物使用1％琼脂糖凝胶进行检测；C、结果及判断检测时设以含有目的扩增片断的质粒DNA作为模板为阳性对照，以灭菌水作为模板为阴性对照；根据在740bp处出现预期特征条带，确定该益生菌乳制品中含有罗伊氏乳杆菌，相反地则不含有罗伊氏乳杆菌。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的上下游引物分别疋上游引物REf为5 ， -GATTGACGATGGATCACCAG-3 ，；下游引物REr为5， -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3'，扩增片断长度为740bp。
3、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于含有目的扩增片断的质粒DNA是通过将L rewfen'ZL12-l-l的PCR产物与pMD18连接转化大肠杆菌DH5a获得的阳性克隆子。
4、 一种益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定量测定方法，其特征在于该方法的步骤如下A、 样品总RNA的制备采用Trizol法提取发酵乳制品总RNA:发酵样品500mg在盛有液氮的研钵中研磨后，迅速加入lmL Trizol试剂，按Trizol试剂盒说明书提取样品RNA，然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，使用微量紫外分光光度仪测定浓度，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，然后将样本保存于-8(TC;B、 反转录扩增反应体系10.0pL: 2.0|iL 5 x PrimerScript Buffer(TakaRa DRR063A)、0.5jaL PrimerScript RT Enzyme Mix I、 0.5jaL Random 6 mers(100 pM)、 TotalRNA ( <500 ng), RNase Free dH20补足至10.0 pL;反转录扩增反应条件37。C反应15min; 85。C变性5S,在温度-20。C下保存；C、 实时荧光定量PCR反应体系25.0 nL: 12.5jiL 2xSYBR Premix Ex TaqTM,各0.5pL1Opmol/L上、下游引物RE饰REr， 2.0jiLcDNA模板，9.5pLdH20;荧光定量PCIL良应参数95。C变性25S; 95。C变性10S, 58。C退火22S，40个循环；每个样品重复3次；在温度4。C保存；D、 外标准品的制备和标准曲线的^^制外标准品的制备提取含有以罗伊氏乳杆菌ZL12-1-1目的扩增片断的质粒pRET的DNA，紫外分光光度计测定A值后，计算出拷贝数，进行10倍系列稀释，梯度稀释至109-102拷贝数/1^的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；标准曲线的绘制以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到罗伊氏乳杆菌的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准；E、 结果及判断以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用罗伊氏乳杆菌的种特异性引物，以相同的体系同时进行罗伊氏乳杆菌的16S rRNA的基因片段的荧光定量PCR扩增；通过标准曲线和待测样品的Ct值求出益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的起始模板量。
5、根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述罗伊氏乳杆菌种属特异性引物序列如下上游引物REf为5， -GATTGACGATGGATCACCAG-3';下游引物REr为5， -ACTACCAGGGTATCTAATCC-3',扩增片断长度为740bp。
全文摘要
本发明涉及一种在益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的快速定性、定量测定方法。该方法针对益生菌乳制品中含有的罗伊氏乳杆菌，自行设计罗伊氏乳杆菌的16S rRNA基因序列的种属特异性引物，应用此引物进行种属特异性PCR和实时荧光定量PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳图谱分析和实时荧光定量PCR图谱分析，建立益生菌乳制品中罗伊氏乳杆菌的简便、快速、准确的定性和定量测定方法。
文档编号C12Q1/68GK101649353SQ20091017790
公开日2010年2月17日 申请日期2009年9月21日 优先权日2009年9月21日
发明者包秋华, 张和平, 张家超 申请人:内蒙古农业大学