一种拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其flaA基因表达的罗伊氏乳杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一株拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其flaA基因表达的罗伊氏乳杆菌，属 于微生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 空肠弯曲杆菌（Campylobacterjejuni)是革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界，可 通过动物、食物、水、牛奶等传播，能定植于各种野生动物和家禽、家畜的肠道内，接触禽畜 类，食入未煮熟或受污染的鸡肉、牛肉、未彻底杀菌的牛奶以及污染的水都可以引起人类感 染。近些年来，空肠弯曲杆菌感染率在世界各地普遍呈上升趋势。在一些发达国家，空肠 弯曲杆菌感染引起的腹泻病例数甚至超过了沙门氏菌和志贺氏菌，成为最常见的腹泻致病 菌；在发展中国家，空肠弯曲杆菌是婴幼儿感染性腹泻最常见的病原菌。人感染空肠弯曲杆 菌后，最常见的会引起肠胃炎、腹泻、发烧以及腹部绞痛；免疫力低下者会进一步引起一系 列的并发症，例如胆囊炎、腹膜炎、脑膜炎、败血症和骨髓炎等；空肠弯曲杆菌引起的最严重 的并发症是格林-巴利综合征，即GBS，它会引起轴突的损伤及不可逆的神经伤害，会导致 呼吸肌麻痹而死亡。
[0003] C.jejuni在宿主体内通过鉴别环境因素，调节表达或抑制自身的某些特异性基因 来适应寄主体内高度竞争的肠道环境。只有这样才能存活、生长，最终施行其致病性，并大 量繁殖。C.jejuni侵袭的第一步即黏附与定植，而这与其毒力因子flaA的表达密不可分， 且flaA的表达还与C.jejuni侵入祀细胞有着密切的联系，若C.jejuni毒力因子flaA的表 达受到抑制，其致病性将大大减弱。QuocV.Tu等2008年的研究发现C.jejuni利用MUC2 作为环境诱因能抑制其flaA基因的表达；A.Mundi等2013年研究发现具有抑制C.jejuni 活性的LactobacillusacidophilusStrainLa-5的发酵后的无细胞提取物在体外能抑制 flaA基因的表达。但目前没有关于调控空肠弯曲杆菌flaA基因表达的研究大多在体外水 平上且抑制其flaA基因表达倍数很低，对于细胞模型中乳酸菌对空肠弯曲杆菌flaA基因 表达的调控作用尚不清楚，也没有在体内验证其拮抗空肠弯曲杆菌的功能。
[0004] 目前临床治疗C.jejuni感染的常用药物为抗生素，但抗生素的使用会带来机体 及C.jejuni对抗生素的耐药性，过度使用还会导致体内药物的残留。
[0005] 乳酸菌是机体先天性免疫系统的重要成员，是机体维持免疫稳态不可缺少的部 分。能维持肠道健康，从而达到促进生长、防治疾病的目的，其使用价值日益受到重视。目前 利用乳酸菌干预并治疗消化道细菌感染已经成为国内外食品科学与生物医药研究的一个 重要领域，研究表明乳酸菌能在体内外有效干预C.jejuni感染。乳酸菌干预C.jejuni感 染的机理主要包括产生抗菌物质抑制C.jejuni的生长；黏附性高的乳酸菌可以通过空间 位阻效应或者产生抑制物质来抑制C.jejuni对宿主细胞的黏附；乳酸菌对肠道形态的完 整性具有显著的保护作用，可以减轻C.jejuni对肠道上皮细胞的感染症状；乳酸菌还可以 向细胞外分泌一些具有免疫调节活性的物质，如胞外多糖和其它分泌蛋白，这些成分参与 免疫调节或直接引起免疫应答，因而构成了乳酸菌发挥益生功效的物质基础，在细菌定植、 免疫激活、预防癌变等方面发挥作用。
[0006] 目前，一些公开专利文献涉及空肠弯曲杆菌的拮抗及其用途，例如CN104870472A 公开了一种特异于空肠弯曲杆菌的抗体及其片段；CN102497875A公开了一种用于降低空 肠弯曲杆菌定植的抗原；CN103381220A公开了一种可以治疗鸡空肠弯曲杆菌的药物；但 是，目前涉及乳酸菌拮抗空肠弯曲杆菌及抑制其毒力基因表达的专利申请文献并不多， CN102533618A公开了一种具有体外抑制空肠弯曲杆菌能力的植物乳杆菌，但该专利并没有 涉及空肠弯曲杆菌的flaA基因的表达情况及在细胞模型及体内拮抗空肠弯曲杆菌中的功 效。
[0007] 因此，筛选出一株拮抗空肠弯曲杆菌的乳酸菌，证明它在体外及细胞模型中能有 效抑制空肠弯曲杆菌flaA基因的表达，且在动物模型中具有良好的缓解空肠弯曲杆菌感 染的作用，并研究该乳酸菌实际用途就显得非常必要了。
[0008] 本发明人在总结现有技术的基础上，通过大量实验研究，终于完成了本发明。
【发明内容】
[0009]本发明提供了一种罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)，该菌株已于2015年 9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址为北 京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 11447。
[0010] 所述罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447具有下述生物学特性：
[0011] (1)菌体特征：革兰氏阳性，细长杆状，微弯成链出现，无鞭毛，无芽孢；
[0012] (2)菌落特征：菌落乳白色，边缘不整齐，片状，中央凸起，表面湿润光滑；
[0013] (3)生长特征：该菌株的最低生长温度为15°C，最高生长温度为40°C，在温度 30-37°C下生长最佳，最适生长PH为6. 5,培养18h后进入稳定期；
[0014] (4)具有耐酸性，在pH3. 0-9. 0环境条件下生长良好，在pH2. 0环境下存活良好；
[0015] (5)具有胆盐耐受性，在胆盐浓度为0. 1 %- 0.4%的范围内菌株生长良好；
[0016] (6)体外抑制空肠弯曲杆菌生长；
[0017] (7)对肠道上皮细胞具有较好的粘附能力；
[0018] (8)罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447发酵上清在体外能显著抑制空肠弯曲杆菌 flaA毒力因子的表达；
[0019] (9)罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447发酵上清在体外能影响空肠弯曲杆菌鞭毛的 合成；
[0020] (10)罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447发酵上清在细胞模型中能显著抑制空肠弯曲 杆菌flaA毒力因子的表达。
[0021] 本发明所述的罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447可用于制备抑制空肠弯曲杆菌的药 物组合物或保健功能食品。所述药物组合物是由罗伊氏乳杆菌菌剂CGMCCNo. 11447与在 药学上可接受的载体组成的。所述在药学上可接受的载体是一种或多种选自在药学上通常 使用的粘合剂、填充剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂或矫味剂。所述的药物组合物是胶囊剂、颗 粒剂、片剂、丸剂或口服液剂型。
[0022] 所述罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447可用于制备发酵食品。所述的发酵食品是使用 含有罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447菌种的发酵剂生产的乳制品、果蔬制品及、豆制品。所 述的乳制品是酸牛奶、酸奶油或干酪；所述的果蔬制品是黄瓜、甜菜、芹菜、胡萝卜或圆白菜 制品；所述的豆制品是酱油、酸豆奶、豆豉或豆酱。
[0023] 本发明还提供一种制备罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447菌剂的方法，是将含有所述 罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447生物菌液通过常规冷冻干燥工艺制备或其它工艺制备所得 到的粉剂，它含有大于l〇6CFU/g的活性罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447。
[0024] 根据本发明的一种优选实施方式，所述的发酵剂是采用下述方法制备得到的：
[0025] A、培养基的制备：以该培养基总重量计10%酶水解脱脂乳、0. 5%葡萄糖、1. 5胰 蛋白陈、0. 3%酵母浸膏和余量水，调整所制备培养基的pH到6. 8。
[0026] B、保护剂：100g/L脱脂奶粉、30mL/L甘油、100g/L麦芽糊精、150g/L海藻糖、10g/ LL-谷氨酸钠的保护剂。
[0027]C.罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447菌种按照以所述培养基的质量计2%的接种量 接种到在温度110-120°(：下灭菌8-121^11后的培养基中，然后在温度37°(：下培养181 1，用 pH7. 2磷酸盐缓冲液清洗2-4次，用所述的保护剂重悬使菌浓达到K^CFU/ml;接着，让该悬 浮液在温度37°C下预培养60min，再进行冷冻干燥得到所述的发酵菌剂。
[0028] 本发明所述的罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447具有耐酸、耐胆盐特性，对肠道上皮 细胞具有良好的黏附特性，能有效抑制空肠弯曲杆菌的生长，能在体外及细胞模型中有效 抑制空肠弯曲杆菌flaA毒力因子的表达。所述的罗伊氏乳杆菌CGMCCNo.11447用于治