疗 及预防空肠弯曲杆菌感染，具有非常广泛地应用前景。
[0029] 生物材料保藏
[0030]一种罗伊氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri)，于2015年09月24日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 11447。
【附图说明】
[0031] 图1是罗伊氏乳杆菌CGMCCN0.11447在HT-29细胞上的粘附状况。
[0032] 图2是罗伊氏乳杆菌CGMCCN0.11447发酵上清在体外对空肠弯曲杆菌flaA毒力 因子表达的影响。
[0033] 图3是罗伊氏乳杆菌CGMCCN0. 11447发酵上清在体外对空肠弯曲杆菌鞭毛合成 的影响。
[0034] 图4是罗伊氏乳杆菌CGMCCN0. 11447发酵上清在细胞模型中对空肠弯曲杆菌 flaA毒力因子表达的影响。
【具体实施方式】
[0035] 实施例1从鸡粪中筛选乳酸菌
[0036] 样品取自于江苏省无锡市滨湖区贡湖大道新鲜的农家鸡粪，保存于30%甘油中。 吸取lml鸡粪悬液加入到含有9ml灭菌生理盐水的试管中，振荡均匀，梯度稀释后采用涂布 平板法，将这些稀释菌液涂布在添加了酸碱指示剂嗅甲酚紫的MRS培养基（青岛海博生物 技术有限公司产品）平板上，分别在温度37°C下进行普通培养和厌氧培养48h，观察菌落 生长情况，挑取能使培养基中嗅甲酚紫变黄的典型单菌落，并对单菌落进行革兰氏染色，挑 取革兰氏阳性菌作为初步目的菌株，然后转接至MRS平板划线分离纯化，直至得到纯乳酸 菌株，作为实验菌株并在温度-20°C下保存。本发明获得的罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri)，于2015年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编 号为CGMCCNo.11447。
[0037] 实施例2采用牛津杯法筛选能够抑制空肠弯曲杆菌生长的乳酸菌
[0038] 乳酸菌发酵上清液的制备：将分离纯化得到的乳酸菌按照以MRS液体培养基体积 计2 %接种于MRS液体培养基中，于37°C下培养18h，按照同样的方式连续培养三代，然后将 乳酸菌菌悬液在8000r/min、4°C条件下离心8min，吸取上清液，使用0. 22μm水系滤膜进行 过滤除菌，得到乳酸菌发酵上清液。
[0039] 空肠弯曲杆菌（Campylobacterjejuni)NCTC11168菌株（购自美国典型培养物保 藏中心ATCC)在两项培养基上（即布氏琼脂（青岛海博生物技术有限公司产品）与脑心浸 液肉汤培养基（Oxoid公司培养基））在温度37°C与以体积计5% 02、10%0)2和85%~2的 环境下培养48h，按照同样的方式传代培养三代后，在2800r/min条件下离心6min，使用磷 酸盐缓冲液（PBS，pH为7. 2)洗涤后，调整该菌浓度至10sCFU/mL。
[0040] 吸取C.jejuni(编号NCTC11168)菌悬液（250μL，10sCFU/mL)均匀涂布于哥伦比 亚血琼脂平板（Oxoid公司培养基）中，待菌液自然干燥后，放置牛津杯，在牛津杯中加入 100以1^乳酸菌发酵上清。于4°(：扩散211后放入三气培养箱中（5%0 2、10%〇)2和85%1)， 经37°C培养48h后测量抑菌圈的直径。以pH为3. 8的MRS作为阴性对照，0. 28mg/ml诺氟 沙星广谱抗生素为阳性对照，检测抑菌圈直径（_)
[0041] 表1:抑菌圈直径的测量结果
[0042]
[0043] 表1表明乳酸菌CGMCCN0.11447发酵上清液显著抑制了空肠弯曲杆菌的生长。
[0044] 实施例3罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447对人工肠液及人工胃液的耐受性实验
[0045] 人工胃液：称取3g胃蛋白酶（1 :10000,Sigma，USA)溶解于1L生理盐水（0.5%， w/v)中、调整pH为2. 0,将该溶液过0. 45/0. 22μm无菌双层微孔滤膜，无菌保存备用。
[0046] 人工肠液：称取lg胰蛋白酶（P-1500,Sigma，USA)和0. 3g牛胆盐，溶解于1L生 理盐水（0.5%，w/v)中、调整pH为8.0,将该溶液过0.45/0. 22μm无菌双层微孔滤膜，无 菌保存备用。
[0047]PBS溶液（磷酸盐缓冲溶液）：磷酸二氢钾0·27g，氯化钾0·2g，十二水合磷酸氢二 钠2. 85g，NaC18. 5g，蒸馏水lL，pH调节至7. 2,过0. 45/0. 22μπι无菌双层微孔滤膜，121°C， 20min灭菌，保存于4°C冰箱。
[0048] (1)人工模拟胃液耐受性实验
[0049] 选取乳酸菌数量级为109CFU/mL的PBS溶液进行本实验，离心（5000r/min，lOmin， 4°C)，加入等体积的模拟人工胃液，设置空白对照组，对照组直接使用109CFU/mL的PBS菌 体溶液，水浴（37°C)中培养两个小时，完成后采用梯度稀释法进行平板菌落计数，中间需 要注意的是平均每隔三十分钟摇晃1次。
[0050] (2)人工模拟肠液耐受性实验
[0051] 选取乳酸菌数量级为109CFU/mL的PBS溶液进行本实验，离心（5000r/min，lOmin， 4°C)，加入等体积的模拟人工肠液，设置空白对照组，对照组直接使用109CFU/mL的PBS菌 体溶液，水浴（37°C)中培养两个小时，注意每隔三十分钟均摇1次，结束后使用梯度稀释法 进行平板菌落计数。
[0052] 表2 :罗伊氏乳杆菌CGMCCNO. 11447对人工胃液及人工肠液的耐受性实验
[0053]
[0054] 右表2可知，罗伊氏乳杆菌CGMCCNO. 11447对人工胃液及人工肠液有很好的耐受 性。
[0055] 实施例4罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447对肠道上皮细胞HT-29的粘附能力
[0056] 使用RPMI1640培养液（Gibco公司）（添加10%胎牛血清和1 %青链霉素）培养 肠上皮细胞株HT-29细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。HT-29细胞 在培养箱里于5%C02气氛与温度37°C的条件下进行培养，每培养48h就更换培养液1次， 连续培养。
[0057] 将生长融合至70%-80%的HT-29细胞进行消化，调整浓度至2X105个/mL，将无 菌盖玻片放置在6孔细胞培养板中，每孔加入2mL细胞培养悬液，于5%C02培养箱中37°C 培养，待细胞长至单层时，用PBS清洗三次，每孔加入lmL乳酸菌菌悬液（1X10sCFU/mL)，补 加RPMI-1640细胞培养液（不含血清及抗生素）至2mL，孵育2h。孵育结束后，用PBS清洗 三次，以除去未粘附的乳酸菌，然后用甲醇固定20min，PBS清洗三次后进行革兰氏染色，于 100倍油镜下镜检。随机选取20个视野计算每100个细胞所粘附的细菌数，作为粘附指数。 粘附实验结果列于表3,罗伊氏乳杆菌CGMCCN0.11447在HT-29细胞上的粘附状况见附图 1〇
[0058] 表3罗伊氏乳杆菌CGMCCN0. 11447在HT-29细胞上的粘附情况
[0059]
[0060] 由表3可知：罗伊氏乳杆菌CGMCCNo. 11447对肠道上皮细胞HT-29有较强的黏附 能力，而能够粘附在肠道上皮细胞上是其进一步发挥作用的前提，具有较强粘附能力的罗 伊氏乳杆菌CGMCCN0. 11447在肠道定植后，可以有效地防止病原微生物接触和粘附肠粘膜 细胞，从而可以预防肠道致病菌引起肠道疾病。
[0061] 实施例5罗伊氏乳杆菌CGMCCN0.11447在体外对空肠弯曲杆菌flaA毒力因子表 达的影响
[0062] 将C.jejuni置于两项培养基（布氏琼脂+9ml脑心浸液肉汤液体培养基）上培养 36h，于无菌条件下加入lml罗伊氏乳杆菌发酵上清，对照组加入lmlMRS液体培养基，摇匀 后置于三气培养箱中（5% 02、10% (：02和85%N2)培养4h，在4°C下2800r/min离心6min 收集菌体，提取菌体总RNA，用试剂盒（Takara公司）逆转录成cDNA，后进行荧光定量PCR， 并选用rpoD作为内参基因。进行荧光定量PCR，荧光定量PCR所用引物序列如表4所示。
[0063] 表4 :焚光定量PCR的寡核昔酸序列
[0064]<